實(shí)驗(yàn)用組培和轉(zhuǎn)化方案

1、本實(shí)驗(yàn)室用的水稻遺傳轉(zhuǎn)化程序1. 愈傷組織的誘導(dǎo)：去売的水稻種子，經(jīng)70%乙醇浸潤30秒后，滅菌水洗滌1次，然后用1%次氯酸 鈉溶液消毒20min,滅菌蒸憾水洗滌4次，無菌濾紙吸干多余水分后，將種子置于 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，28 °c黑暗下培養(yǎng)。經(jīng)常檢查污染情況，3-4周后誘導(dǎo)愈 傷出現(xiàn)。誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方如下：n6大量b5微量b5有機(jī)b5鐵鹽 脯氨酸2g/l水解酪蛋白300mg/l2, 4-d2. 5 g/l蔗糖30 g/l2. 愈傷組織的繼代：當(dāng)胚性愈傷組織從種子盾片處生長岀來后，選擇顏色鮮黃，質(zhì)地致密的直徑 1-2価的球型愈傷組織，置于愈傷組織培養(yǎng)基2±, 28

2、6;c、黑暗下繼代培養(yǎng)，每 4周繼代一次（7b培養(yǎng)基）；不要用繼代5次以上的材料做轉(zhuǎn)化材料2, 4-d和l-脯氨酸的濃度分別調(diào)整為2mg/l和0. 5g/l）繼代培養(yǎng)基配方如下n6大量b5微量b5有機(jī)b5鐵鹽水解酪蛋白300mg/l脯氨酸0. 5g/l2, 4-d2g/l蔗糖30g/l3. 農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化:(i)取生長健壯的愈傷組織轉(zhuǎn)入新的nb培養(yǎng)皿中(25-30個(gè)/皿) 第3天，將經(jīng)活化的農(nóng)桿菌于液體培養(yǎng)基中，28°c、200r/min培養(yǎng)至od600二0.6左右, 離心收集細(xì)菌重懸于等體積的nb培養(yǎng)基中，加入終濃度為100umol/l的乙酰丁香酮, 作為侵染液。 收集生長旺盛、狀態(tài)

3、良好的直徑2-3mm的愈傷組織，放于上述侵染液中，loor/min振 蕩培養(yǎng)20min,靜置lomin后取出愈傷組織，無菌濾紙吸去多余菌液，(4)選取生長良好的胚性愈傷組織然后置共培養(yǎng)培養(yǎng)基共培養(yǎng)的培養(yǎng)基:汕大量b5微量b5有機(jī)b5鐵鹽水解酪蛋白300mg/l脯氨酸500mg/l2, 4-d2g/l蔗糖30g/l20mg/l 乙（酰丁;香酮,ph5.2o4. 抗性篩選:共培養(yǎng)后，用無菌濾紙吸干多余水分后，將愈傷組織轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基上，28、 黑暗下選擇培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間3-4周。幾天內(nèi)注意觀察，若愈傷周圍有農(nóng)桿菌生長, 將同皿的其它愈傷轉(zhuǎn)到新的nbt+抗生素培養(yǎng)基抗性篩選培養(yǎng)基：n6大量b5微量b

4、5有機(jī)b5鐵鹽水解酪蛋白300 mg/l脯氨酸 500 mg/l2,4-d2 g/l蔗糖30 g/l潮霉素 50mg/l頭抱霉素 0. 5g/lpi15. 8.5. 予分化培養(yǎng)將表現(xiàn)出潮霉素抗性的愈傷組織轉(zhuǎn)移到予分化培養(yǎng)基上，28黑暗培養(yǎng) 4-12do挑取從原愈傷組織表面生長出來的新的潮霉素抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到預(yù)分 化培養(yǎng)基上，28°c、黑暗下預(yù)分化培養(yǎng)2-3周（14-21天）。b5微量b5有機(jī)b5鐵鹽6-ba2 mg/lnaa1 mg/laba5 mg/l水解酪蛋口300 mg/l脯氨酸500 mg/l蔗糖30 g/l潮霉素50mg/l頭砲霉素0. 5g/ln6大量ph5. 8.6.

5、 分化培養(yǎng)選擇奶白色，表面光滑的愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上，28c、光照下培養(yǎng) 50天n6大量b5微量b5有機(jī)b5鐵鹽6-ba3 mg/lnaa0. 5 mg/l水解酪蛋白300 mg/l脯氨酸500 mg/l蔗糖30 g/l潮霉素50mg/l頭砲霉素0.5g/lph5.87. 生根培養(yǎng)將從抗性愈傷組織再牛出的幼苗轉(zhuǎn)移到根誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，持續(xù)光照培養(yǎng)15d.生長狀況良好的幼苗直接轉(zhuǎn)移到溫室種植。根誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方:ms培養(yǎng)基大量元素,微量元素和有機(jī)成分,30g/l蔗糖, 15g/l 瓊脂,ph5. 8.水稻轉(zhuǎn)化程序table 4 the procedure of rice transfbnnation47大3大47周23周812天4周1014天愈傷預(yù)培養(yǎng)選擇i選擇11預(yù)再生再生壯苗移栽再生株系callusco-cultivation selection iselection iiprct50rct（亢照）trans-plantregenerationtrans-fer(nb+ag) (nbth 50)(n