微生物限度檢查基本技術

1、 目錄目錄 一、藥品微生物限度檢查一、藥品微生物限度檢查33 二、藥品包裝材料微生物限度檢查法二、藥品包裝材料微生物限度檢查法2020 三、問題解答三、問題解答2222一、藥品微生物限度檢查一、藥品微生物限度檢查1 1、幾個名詞解釋、幾個名詞解釋（1 1）微生物的概念）微生物的概念 所謂微生物是一群個體微小、結構簡單肉眼不能直接看到，必須借助顯微鏡以及其它手段才能辨別的微小生物。（2 2）菌落）菌落 一般是指在固體培養(yǎng)基上，由細菌單細胞經(jīng)過適宜溫度培養(yǎng)在一個局部位置上，繁殖而成的可見菌體細胞群。（3 3）無菌技術）無菌技術 無菌技術主要指在微生物實驗工作中，控制或防止各類微生物的污染及其干擾的

2、一系列操作方法和有關措施，其中包括無菌環(huán)境設施，無菌實驗器材以及無菌操作等統(tǒng)稱為無菌技術。（4 4）消毒）消毒 消毒是指殺滅病因微生物的繁殖體，但殺不死芽孢等全部微生物。 常用的清毒劑的種類常用的清毒劑的種類 75%乙醇、甲醛、碘酊、0.1%新潔爾滅、乳酸、過氧乙酸、3%來蘇爾、過氧化氫等。（5 5）滅菌）滅菌 凡能殺滅物體中所有微生物繁殖體及芽孢或孢子的作用稱為滅菌。 常用的滅菌方法常用的滅菌方法 (51)干熱滅菌法 (52)濕熱滅菌法 （6 6）微生物限度檢查法定義）微生物限度檢查法定義 微生物限度檢查法系檢查非規(guī)定滅菌制劑及其原料、輔料受微生物污染程度的方法。檢查項目包括細菌數(shù)、霉菌數(shù)、

3、酵菌數(shù)及控制菌檢查。（61 1）操作環(huán)境）操作環(huán)境 微生物限度檢查應在環(huán)境潔凈度10000級下的局部潔凈度100級的單向流空氣區(qū)域內(nèi)進行。檢查全過程必須嚴格遵守無菌操作，防止再污染。單向流空氣區(qū)域、工作臺面及環(huán)境應定期按醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法的現(xiàn)行國家標準進行潔凈驗證。（6 62 2） 培養(yǎng)溫度和時間培養(yǎng)溫度和時間 本檢查法中細菌培養(yǎng)溫度為3035C；時間為48小時。霉菌、酵母菌培養(yǎng)溫度為2328 C；時間為72小時?？刂凭囵B(yǎng)溫度為3537 C；時間為48小時。 眼用制劑微生物限度檢查用薄膜過濾法，培養(yǎng)時間為7天。2 2、微生物限度檢查方法學驗證、微生物限度檢

4、查方法學驗證 （1 1）驗證采用的方法：）驗證采用的方法： 、常規(guī)法、常規(guī)法 、稀釋法、稀釋法 、離心沉淀集菌法、離心沉淀集菌法 、薄膜過濾法、薄膜過濾法 、中和法、中和法 、離心和培養(yǎng)基稀釋法、離心和培養(yǎng)基稀釋法 、離心和薄膜過濾法、離心和薄膜過濾法（2 2）、細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法的驗證）、細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法的驗證 （2 21 1）、菌種）、菌種 驗證試驗所用的菌株傳代次數(shù)不得超過5代（從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代），并采用適宜的菌種保藏技術，以保證試驗菌株的生物學特性。 （1 1）大腸埃希菌）大腸埃希菌(CMCC (B) 44102)(CMCC (B) 44102

5、) （2 2）金黃色葡萄球菌）金黃色葡萄球菌(CMCC(B) 26003)(CMCC(B) 26003) （3 3）枯草芽孢桿菌）枯草芽孢桿菌(CMCC(B) 63501)(CMCC(B) 63501) （4 4）白色念珠菌）白色念珠菌(CMCC(F) 98001)(CMCC(F) 98001) （5 5）黑曲霉）黑曲霉(CMCC(F) 98003)(CMCC(F) 98003) (2 (22)2)、菌液制備、菌液制備 接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基或營養(yǎng)瓊脂養(yǎng)基中，培養(yǎng)1824小時，接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中，培

6、養(yǎng)2428小時。上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1m1含菌數(shù)為50100cfu的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中，培養(yǎng)57天，加入35m10.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，吸出孢子懸液（用管口塞有適度疏松的無菌棉花或管口外包扎無菌紗布能過濾菌絲的無菌毛細吸管）至無菌試管內(nèi)，用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1m1含孢子數(shù)50100cfu的孢子懸液 （2 23 3）、驗證方法）、驗證方法 驗證試驗至少應進行3次獨立的平行試驗，并分別計算各試驗菌每次試驗的回收率。 首先應進行預試驗，做金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的回收率，然后再確定驗證方法。 （1）試驗組 平皿法計

7、數(shù)時，取試驗可能用的最低稀釋級供試液1m1和50100cfu試驗菌，分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌數(shù)。薄膜過濾法計數(shù)時，取規(guī)定量試驗可能用的最低稀釋級供試液，過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入50100cfu試驗菌，過濾，按薄膜過濾法測定其菌數(shù)。 （2）菌液組 測定所加的試驗菌數(shù) （3）供試品對照組 取規(guī)定量供試液，按菌落計數(shù)法測定供試品本底菌數(shù)。 （4）稀釋劑對照組 若供試液制備需要分散、乳化，中和、離心或薄膜過濾等特殊處理時，應增加稀釋劑對照組，以考察供試液制備過程中微生物受影響的程度。試驗時，可用相應的稀釋液代替供試品，加入試驗菌，使最

8、終菌濃度為每1m1供試液含50100cfu，按試驗組的供試液制備方法和菌落計數(shù)方法測定其菌數(shù)。（2 24 4）、結果判斷）、結果判斷 在3次獨立的平行試驗中，稀釋劑對照組的菌回收率（稀釋劑對照組的平均菌落數(shù)占菌液組的平均菌落數(shù)的百分率）應均不低于70%。若試驗組的菌回收率（試驗組的平均菌落數(shù)減去供試品對照組的平均菌落數(shù)的值占菌液組的平均菌數(shù)的百分率）均不低于70%，照該供試液制備方法和計數(shù)法測定供試品的細菌、霉菌及酵母菌數(shù)；若任一次試驗中試驗組的菌回收率低于70%，應采用培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進行方法驗證。 當最低稀

9、釋級的供試液含有抑菌活性，且采用上述消除抑菌活性的方法后試驗菌的回收率還無法達到計數(shù)方法驗證的要求時，根據(jù)供試品的微生物限度標準和菌數(shù)報告規(guī)則，在不影響檢驗結果判斷的前提下，可采用高一稀釋級的供試液重新進行回收率的測定。若試驗菌的回收率符合計數(shù)方法驗證的要求，應以該稀釋級供試液作為最低稀釋級的供試液進行試驗。 驗證試驗也可與供試品的細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)同時進行。（3 3）、細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法）、細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法 試驗準備：（干熱滅菌、濕熱滅菌） 把滅菌好的所有物品搬運至傳遞窗，打開紫外燈殺菌，至少30分鐘。 檢查時，按已驗證的計數(shù)方法進行供試品的細菌、霉菌及酵母菌菌數(shù)的測定

10、。 取按驗證的方法制備的均勻供試液，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋成1：10、1：10、1：10等稀釋級。 （3 31 1）、平皿法）、平皿法 采用平皿法進行菌數(shù)測定時，應取適宜的連接23個稀釋級的供試液。 取供試液1m1，置直徑90mm的無菌平皿中，注入1520 ml溫度不超過45的溶化的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（含蜂蜜或王漿的液體制劑時），混勻，凝固，倒置培養(yǎng)。每稀釋級每種培養(yǎng)基至少制備2個平板。 （3 31 11 1）、）、 陰性對照試驗陰性對照試驗 取試驗用的稀釋液1m1，置無菌平皿中，注入培養(yǎng)基，凝固，倒置培養(yǎng)。每種計數(shù)用的培養(yǎng)基各制

11、備2個平板，均不得有菌生長。 （3 31 12 2）、培養(yǎng)和計數(shù)）、培養(yǎng)和計數(shù) 除另有規(guī)定外，細菌培養(yǎng)48小時，逐日點計菌落數(shù)，一般以48小時的菌落數(shù)報告；霉菌、酵母菌培養(yǎng)72小時，逐日計點菌落數(shù)，一般以72小時的菌落數(shù)報告；必要時，可適當延長培養(yǎng)時間至57進行菌落計數(shù)并報告；菌落蔓延生長成片的平板不宜計數(shù)。點計菌落數(shù)后，計算各稀釋級供試液的平均菌落數(shù)，按菌數(shù)報告規(guī)則報告菌數(shù)。若用稀釋級兩個平板的菌落平均數(shù)不小于15，則兩個平板的菌落數(shù)不能相差1倍或以上。 一般營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基用于細菌計數(shù)；玫瑰紅那瓊脂培養(yǎng)基用于霉菌及酵母菌計數(shù)；酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基用于酵母菌計數(shù)。在特殊情況下，若營養(yǎng)瓊

12、脂培養(yǎng)基上長有霉菌和酵母菌、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上長有細菌，則應分別點計霉菌和酵母菌、細菌菌落數(shù)。然后將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的霉菌和酵母菌數(shù)或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上的細菌數(shù)，與玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基中的霉菌和酵母菌數(shù)或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中的細菌數(shù)進行比較，以菌落數(shù)高的培養(yǎng)基中的菌數(shù)為計數(shù)結果。 含蜂蜜、王漿的液體制劑，用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基測定霉菌數(shù)，用酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基測定酵母菌數(shù)，合并計數(shù)。 （3 31 13 3）、菌數(shù)報告規(guī)則）、菌數(shù)報告規(guī)則 宜選取細菌、酵母菌平均菌落數(shù)在30300之間、霉菌平均菌落數(shù)在30100之間的稀釋級，作為菌數(shù)報告（取兩位有效數(shù)字）的依據(jù)。 當僅有1個稀釋級的菌落數(shù)符合

13、上述規(guī)定，以該級的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報告菌數(shù)。 當同時有2個稀釋級的菌落數(shù)符合上述規(guī)定時，視兩者比值（比值為高稀釋級的菌數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值除以低稀釋級的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值）而定。若比值不大于2，以兩稀釋級的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的均值報告菌數(shù)；若比值大于2但不超過5時，以低稀釋級的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報告菌數(shù)；當出現(xiàn)比值大于5，或高稀釋級的菌落數(shù)大于或等于低稀釋級的菌數(shù)等異常情況，應查明原因再行檢查，必要時，應進行方法的重新驗證。 當各稀釋級的平均菌落數(shù)小于30，以最低稀釋級的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報告菌數(shù)。 如各稀釋級的平板無菌落生長，或僅最低稀釋級的平均菌落數(shù)生長，但平均菌落

14、數(shù)小于1小時，以1乘以最低稀釋倍數(shù)的值報告菌數(shù)。菌落數(shù)報告舉例菌落數(shù)報告舉例序列各稀釋級平板平均菌落數(shù)菌落數(shù) 1：10 1：100 1：1000 1 35 2 0 3502 96 37 29603 不可計 200 35 280004 25 4 2 2505 0 0 0 10（3 31 14 4）、操作的注意事項）、操作的注意事項 制備的供試液力求分散均勻，使之菌體能均勻分散，其次在每次吸取供試液注皿的時候，都要把供試液搖勻，這樣能使兩個平板上生長的菌落數(shù)比較接近。 澆注培養(yǎng)基的溫度不能高，澆注好的平板搖勻后即要求冷卻，不要把平板壘起來，這樣不利于冷卻。 操作時間不能太長，一般要求從供試品稀釋到

15、注皿的時間不要超過1小時，因為有些活力較好的菌體在制備供試液的過程中就可行細胞分裂，這樣測得的菌數(shù)就不能代表原始的污染程度。另外，供試液的平皿底部接觸時間太長，會使菌液藥渣附著不宜搖散。 可以在培養(yǎng)基中加0.1的TTC 。 （3 31 14 4）、操作的注意事項）、操作的注意事項 制備的供試液力求分散均勻，使之菌體能均勻分散，其次在每次吸取供試液注皿的時候，都要把供試液搖勻，這樣能使兩個平板上生長的菌落數(shù)比較接近。 澆注培養(yǎng)基的溫度不能高，澆注好的平板搖勻后即要求冷卻，不要把平板壘起來，這樣不利于冷卻。 操作時間不能太長，一般要求從供試品稀釋到注皿的時間不要超過1小時，因為有些活力較好的菌體在

16、制備供試液的過程中就可行細胞分裂，這樣測得的菌數(shù)就不能代表原始的污染程度。另外，供試液的平皿底部接觸時間太長，會使菌液藥渣附著不宜搖散。 可以在培養(yǎng)基中加0.1的TTC 。 （3 32 2）、薄膜過濾法）、薄膜過濾法 采用薄膜過濾法，濾膜孔徑應不大于0.45um，直徑一般為50mm，若采用其他直徑的濾膜，沖洗量應進行相應的調(diào)整。選擇濾膜材質(zhì)時應保證供試品及其溶液不影響微生物的充分被截留。濾器及濾膜使用前應采用適宜的方法滅菌。使用時，應保證濾膜在過濾前后的完整性。水溶性供試液過濾前先少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜。油類供試品，其濾膜和過濾器在使用前應充分干燥。為發(fā)揮濾膜的最大過濾效率，應注意保持供試

17、品溶液及沖洗覆蓋整個濾膜表面。供試液經(jīng)薄膜過濾后，若需要用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量為100ml。每片濾膜的總過濾量不宜過大，以避免濾膜上的微生物受損傷。 取相當于每張濾膜含lg或1m1供試品的供試液，加至適量的稀釋劑中，混勻，過濾。若供試品每1g或1m1所含的菌較多時，取適宜稀釋級的供試液1m1，過濾。用ph7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或其他適宜的沖洗濾膜，沖洗方法和沖洗量同“計數(shù)方法的驗證”。沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)或酵母滲出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)。每種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜。（321）、陰性對照試驗 取試驗用的稀釋液1m1照上述薄膜過

18、濾法操作，作為陰性對照。陰性對照不得有菌生長。（322）、培養(yǎng)和計數(shù) 培養(yǎng)條件和計數(shù)方法用平皿法，每片濾膜上的菌落數(shù)應不超過100個。（3，23）、菌數(shù)報告規(guī)則 以相當于1g或1m1供試品的菌落數(shù)報告菌數(shù)；若濾膜上無菌數(shù)生長，以1報告菌數(shù)（每張濾膜過濾1g或1m1供試品），或1乘以最低稀釋倍數(shù)的值報告菌數(shù)。（4）控制菌檢查方法的驗證（41）菌種 對試驗菌種的要求同細菌、霉菌及酵母計數(shù)方法的驗證。 （1 1）大腸埃希菌（）大腸埃希菌（CMCC(B) 44102CMCC(B) 44102） （2 2）金黃色葡萄球菌）金黃色葡萄球菌(CMCC(B) 26003)(CMCC(B) 26003)（3 3

19、）乙型付傷寒沙門菌）乙型付傷寒沙門菌(CMCC(B) 50094)(CMCC(B) 50094) （4 4）銅綠假單胞菌）銅綠假單胞菌(CMCC(B) 10104)(CMCC(B) 10104) （5 5）生孢梭菌）生孢梭菌(CMCC(B) 64941)(CMCC(B) 64941)（4 42 2）菌液制備）菌液制備（4 43 3）驗證方法）驗證方法（4 43 31 1）試驗組）試驗組 （4 43 32 2）陰性菌對照組）陰性菌對照組 （4 44 4）結果判斷）結果判斷 （5 5）控制菌檢查）控制菌檢查 （5 51 1）陽性對照試驗）陽性對照試驗 （5 52 2）陰性對照試驗）陰性對照試驗 （

20、5 53 3）大腸埃希菌）大腸埃希菌 取供試液10ml（相當于供試品1g、1ml、10cm2）,直接或處理后接種至適量（不少于100ml）的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1824小時，必要時可延長至48小時。 取上述培養(yǎng)物0.2ml，接種至含5mlMUG培養(yǎng)基的試管內(nèi)，培養(yǎng)，于5小時、24小時在366nm紫外線下觀察，同時用未接種的MUG培養(yǎng)基作本底對照。若管內(nèi)培養(yǎng)物呈現(xiàn)熒光，為MUG陽性；不呈現(xiàn)熒光，為MUG陰性。觀察后，沿培養(yǎng)管的管壁加入數(shù)滴靛基質(zhì)試液，液面呈玫瑰紅色，為靛基質(zhì)陽性；呈試劑本色，為靛基質(zhì)陰性。本底對照應為MUG陰性和靛基質(zhì)陰性。 如MUG陽性、靛基質(zhì)陽性，判供試品檢出大腸埃希菌；如

21、MUG陰性、靛基質(zhì)陰性判供試品未檢出大腸埃希菌；如MUG陽性、靛基質(zhì)陰性，或MUG陰性、靛基質(zhì)陽性，則應取膽鹽乳糖培養(yǎng)基的培養(yǎng)物劃線接種于曙紅亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)1824小時。 若平板上無菌落生長、或生長的菌落與麥1所列的菌落形態(tài)特征不符，判供試品未檢出大腸埃希菌。若平板上無菌落生長、或生長的菌落與麥1所列的菌落形態(tài)特征相符或疑似，應進行分離、純化、染色鏡檢查和適宜的生化試驗，確認是否為大腸埃希菌。 培養(yǎng)基菌落形態(tài)培養(yǎng)基菌落形態(tài)曙紅亞甲藍瓊脂 呈紫黑色、淺紫色、藍紫色或粉紅色，菌落中心呈深紫色或無明顯暗色中心，圓形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤，常有金屬光澤麥康

22、凱瓊脂 鮮桃紅色或微紅色，菌落中心呈深桃紅色，圓形，扁平，邊緣整齊，表面光滑，濕潤 表表1 大腸埃希菌菌落形態(tài)特征大腸埃希菌菌落形態(tài)特征（5 54 4）大腸菌群）大腸菌群 取含適量(不少于10ml)的膽鹽乳糖培養(yǎng)基管3支，分別加入1：10的供試液1ml（含供試品0.1g或0.1ml）、1：100的供試液1ml（含供試品0.01g或0.01ml）、1：1000的供試液1ml（含供試品0.001g或0.001ml），另取1支膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基管加入稀釋液1ml作為陰性對照管。培養(yǎng)1824小時。 膽鹽乳糖發(fā)酵管若無菌生長、或有菌生長但不產(chǎn)酸產(chǎn)氣，判該管未檢出大腸菌群；若產(chǎn)酸產(chǎn)氣，應將發(fā)酵管中的培養(yǎng)物

23、分別劃線接種于曙紅亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)1824小時。 若平板上無菌生長，或生長的菌落與表2所列的菌落形態(tài)特征不符或為非革蘭陰性無牙孢桿菌，判該管未檢出大腸菌群；若平板上生長的菌落與表2所列的菌落形態(tài)特征相符或疑似，且為革蘭陰性無牙孢桿菌應進行確證試驗。表表2 大腸菌菌落形態(tài)特征大腸菌菌落形態(tài)特征培養(yǎng)基 菌落形態(tài) 曙紅亞甲藍瓊脂 呈紫黑色、紫紅色、紅色或粉紅色，圓形，扁平或稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤 麥康凱瓊脂 鮮桃紅色或粉紅色，圓形，扁平或稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤 確證試驗確證試驗 從上述分離平板上挑選45個疑似菌落，分別接種于乳糖發(fā)酵管中，培養(yǎng)2448小時。 若產(chǎn)酸產(chǎn)

24、氣，判該膽鹽乳糖發(fā)酵管檢出大腸菌群，否則判未檢出大腸菌群。根據(jù)大腸菌群的檢出管數(shù)，按表3報告1g或1ml供試品中的大腸菌群數(shù)。表表3 3 可能的大腸菌群數(shù)表可能的大腸菌群數(shù)表各供試品量的檢出結果 可能的大腸菌群數(shù)N(個/g或ml)0.1g或0.1 ml 0.01g或0.01ml 0.001g或0.001ml +_ +_ +_ 1000100N100010N10010 注注+ +代表檢出大腸菌群；一代表未檢出大腸菌群。代表檢出大腸菌群；一代表未檢出大腸菌群。 （5 55 5）沙門菌）沙門菌 （5 56 6）銅綠假單胞菌）銅綠假單胞菌 （5 57 7）金黃色葡萄球菌）金黃色葡萄球菌 （5 58 8

25、）梭菌）梭菌 （6 6）結果判斷）結果判斷 供試品檢出控制菌或其他致病菌時，按一次檢出結果為準，不再復試。 供試品的細菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)其中任何一項不符合該品種項下的規(guī)定，應從一批樣品中隨機抽 樣，獨立復試兩次，以3次結果的平均值報告菌數(shù)。 眼用制劑檢出霉菌和酵母菌數(shù)時，須以兩次復試結果均不得長菌，方可判供試品的霉菌和酵母菌數(shù)符合該品種項下的規(guī)定。 若供試品的細菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)、控制菌三項檢驗結果均符合該品種項下的規(guī)定，判供試品符合規(guī)定，若其中任何一項不符合該品種項下的規(guī)定，判供試品不符合規(guī)定。（7 7）微生物限度標準（一部有修改的部分）微生物限度標準（一部有修改的部分）（7 71 1）

26、、含豆豉神曲等發(fā)酵原粉的制劑）、含豆豉神曲等發(fā)酵原粉的制劑 細菌數(shù) 每1g不得過100000個。每1m1不得過1000個。 霉菌和酵母菌數(shù) 每1g不得過500個。每1m1不得過100個。 大腸埃希菌 每1g或1m1不得檢出。 大腸菌群 每1g應小于100個。每1m1應小于10個。 （7 72 2）、陰道、尿道給藥制劑）、陰道、尿道給藥制劑 細菌數(shù) 每1g、1m1或10cm不得過100個。 霉菌和酵母菌數(shù) 每1g、1m1或10cm應小于10個。 金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、梭菌 每1g、1m1或10cm不得檢出 （7 73 3）、含動物臟器）、含動物臟器（包括提取物）及動物類原藥材粉（蜂蜜、王

27、漿、動物角、阿膠除外）的口服 給藥制劑。 每10g或10ml還不得檢出沙門菌。二、藥品包裝材料微生物限度檢查法二、藥品包裝材料微生物限度檢查法 1.1.口服固體藥用聚丙稀瓶和口服固體藥用高密度聚乙稀瓶口服固體藥用聚丙稀瓶和口服固體藥用高密度聚乙稀瓶 取數(shù)個試瓶，加入標示容量1/3量的氯化鈉注射液,將蓋旋緊,振搖1分鐘,取提取液照微生物限度檢查法(中華人民共和國藥典2000年版二部附錄XI J)測定。細菌數(shù)每瓶不得超過1000個，霉菌、酵母菌數(shù)每瓶不得超過100個，大腸桿菌每瓶不得檢出。 2 2、口服固體聚酯瓶、口服固體聚酯瓶 取本品適量，加入標示容量1/2量的0.9%無菌氯化鈉溶液，將蓋旋緊，

28、振搖1分鐘，提取液進行薄膜過濾，照微生物限度檢查法（中華人民共和國藥典2000年版二部附錄XI J)測定。細菌數(shù)每瓶不得超過1000個，霉菌、酵母菌數(shù)每瓶不得超過100個，大腸桿菌每瓶不得檢出。 3 3、口服液體瓶、口服液體瓶 取數(shù)個試瓶，加入1/2標示容量的氯化鈉注射液,將蓋旋緊,振搖1分鐘, 提取液進行薄膜過濾，照微生物限度檢查法（中華人民共和國藥典2000年版二部附錄XI J)測定。細菌數(shù)每瓶不得超過100個，霉菌、酵母菌數(shù)每瓶不得超過100個，大腸桿菌每瓶不得檢出。 4 4、藥用滴眼劑瓶（燒傷及手術用滴眼劑瓶除外）、藥用滴眼劑瓶（燒傷及手術用滴眼劑瓶除外） 取數(shù)個試瓶，加入1/2標示容

29、量的氯化鈉注射液,將蓋旋緊,振搖1分鐘, 提取液進行薄膜過濾，照微生物限度檢查法（中華人民共和國藥典2000年版二部附錄XI J)測定。細菌數(shù)每瓶不得超過100個，霉菌、酵母菌不得檢出，金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌每瓶不得檢出 。 5 5、外用液體瓶、外用液體瓶 取數(shù)個試瓶，加入1/2標示容量的氯化鈉注射液,將蓋旋緊,振搖1分鐘, 提取液進行薄膜過濾，照微生物限度法（中華人民共和國藥典2000年版二部附錄XI J)測定。細菌數(shù)每瓶不得超過100個，霉菌、酵母菌數(shù)每瓶不得超過100個，金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌每瓶不得檢出。 6 6、藥用軟膏管（大面積燒傷及嚴重損傷皮膚用除外）、藥用軟膏管（大

30、面積燒傷及嚴重損傷皮膚用除外） 取本品10支，向每支加入標示容量2/3量的0.9%無菌氯化鈉溶液，振蕩1分鐘后，合并提取液備用。照微生物限度檢查法（中華人民共和國藥典2000年版二部附錄XI J)測定。細菌數(shù)每支不得超過100個，霉菌、酵母菌數(shù)每支不得超過100個，金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌每支均不得檢出。 7 7、藥用復合硬片、藥用復合膜和袋、藥用鋁箔、藥用復合墊片、藥用復合硬片、藥用復合膜和袋、藥用鋁箔、藥用復合墊片 取本品用開孔面積20的消毒過的金屬模版壓在內(nèi)層面上，將無菌棉簽用0.9%無菌氯化鈉溶液，稍沾濕，在板孔內(nèi)擦抹5次，換1支棉簽再擦抹5次，每個位置用兩支棉簽共擦抹10次，共擦

31、抹5個位置100。每支棉簽抹完后立即剪斷（或燒斷），投入盛有30ml0.9%無菌氯化鈉溶液的錐型瓶（或大試管）中。全部擦抹棉簽投入瓶中后，將瓶迅速搖晃1分鐘，即得供試液。取提取液，照微生物限度法（中華人民共和國藥典2000年版二部附錄XI J)測定。細菌數(shù)不得超過1000個/100, 霉菌、酵母菌數(shù)不得過100個/100,大腸桿菌不得檢出。三、問題解答三、問題解答 1、微生物限度驗證可否用供試品原液做。沒用到稀釋劑是否要做稀釋劑對照組，算回收率。（檢驗的時候用到稀釋劑，驗證時候用原液不用稀釋劑？答：微生物限度驗證可以用供試品原液。沒有用到稀釋劑不用做稀釋劑對照組。答：微生物限度驗證可以用供試品

32、原液。沒有用到稀釋劑不用做稀釋劑對照組。 2、微生物檢驗時，由-1級稀釋到-2級，是用pH7.0氯化鈉蛋白胨水溶液還是可用生理鹽水，還是均可用？答：微生物限度檢驗稀釋劑都要用答：微生物限度檢驗稀釋劑都要用ph7.0ph7.0氯化鈉蛋白胨水溶液，除非有特殊情況。氯化鈉蛋白胨水溶液，除非有特殊情況。 3、同一樣品中吸取1 ml結果超過平板最大差值，如何控制？答：同稀釋液兩個平板的菌落平均數(shù)不小于答：同稀釋液兩個平板的菌落平均數(shù)不小于1515，則兩個平板的菌落數(shù)不能相差，則兩個平板的菌落數(shù)不能相差1 1倍以上。操作時盡量用倍以上。操作時盡量用微量移液管，盡量使供試液充分混勻。微量移液管，盡量使供試液

33、充分混勻。 4、個別產(chǎn)品微生物方法學驗證做不出怎么辦？答：答：若沒有適宜的方法消除供試品中的抑菌作用，那么驗證試驗中微生物回收的失敗可看成是因供試若沒有適宜的方法消除供試品中的抑菌作用，那么驗證試驗中微生物回收的失敗可看成是因供試品的抗菌活性引起的，同時表明該供試品不能被試驗菌污染。但是，供試品也可能僅對試驗用菌株品的抗菌活性引起的，同時表明該供試品不能被試驗菌污染。但是，供試品也可能僅對試驗用菌株具有抑制作用，而對其他菌株沒有抑制作用。因此，根據(jù)供試品須符合的微生物限度標準和菌數(shù)報具有抑制作用，而對其他菌株沒有抑制作用。因此，根據(jù)供試品須符合的微生物限度標準和菌數(shù)報告規(guī)則，在不影響檢驗結果判

34、斷的前提下，應采用能使微生物生長的更高稀釋級的供試液進行方法告規(guī)則，在不影響檢驗結果判斷的前提下，應采用能使微生物生長的更高稀釋級的供試液進行方法驗證試驗。若驗證試驗符合要求，應以該稀釋級供試液作為最低稀釋級的供試液進行供試品檢驗。驗證試驗。若驗證試驗符合要求，應以該稀釋級供試液作為最低稀釋級的供試液進行供試品檢驗。 計數(shù)方法驗證時，采用上述方法若還存在一株或多株試驗菌的回收率達不到要求，那么選擇回收計數(shù)方法驗證時，采用上述方法若還存在一株或多株試驗菌的回收率達不到要求，那么選擇回收情況最接近要求的方法和試驗條件進行供試品的檢驗。情況最接近要求的方法和試驗條件進行供試品的檢驗。 5、對YBB0

35、0072005微生物限度的具體檢驗方法的注意點能否講解？答：答：YBB0072005YBB0072005微生物限度檢驗方法的注意點：（微生物限度檢驗方法的注意點：（1 1）嚴格無菌操作。）嚴格無菌操作。 （2 2）在內(nèi)層面上操作。）在內(nèi)層面上操作。 （3 3）最后的報告結果要乘以）最后的報告結果要乘以3030。 6、連續(xù)生產(chǎn)的不同批號同個品種的成品大腸埃希菌檢查，每批次都要做陽性對照嗎？答：同一天試驗的話，只要做一個陽性對照就可以；不是同一次試驗的話，每次都要做陽性對照。答：同一天試驗的話，只要做一個陽性對照就可以；不是同一次試驗的話，每次都要做陽性對照。 7、細菌、霉菌和酵母菌計數(shù)方法驗證中

36、的3次獨立的平行試驗，是指同批次3次還是不同批次3次獨立平行試驗？答：指同品種不同批次答：指同品種不同批次3 3次獨立平行試驗。次獨立平行試驗。 8、要求檢查沙門菌，哪些供試用量如何確定？答：檢驗沙門菌的供試品，和稀釋劑用量無關。答：檢驗沙門菌的供試品，和稀釋劑用量無關。 9、 糊精為什么要求檢查沙門菌，哪些供試品需要檢查沙門菌？答：答：20052005版藥典增補本中修訂了糊精的微生物限度檢查標準，其中提到了要做沙門菌的檢查。一部藥版藥典增補本中修訂了糊精的微生物限度檢查標準，其中提到了要做沙門菌的檢查。一部藥典附錄規(guī)定：含動物臟器（包括提取物）及動物類原藥材粉（蜂蜜、王漿、動物角、阿膠除外）

37、的典附錄規(guī)定：含動物臟器（包括提取物）及動物類原藥材粉（蜂蜜、王漿、動物角、阿膠除外）的口服溶藥制劑。二部藥典附錄規(guī)定：含動物組織（包括提取物）的口服溶藥制劑等需要檢查沙門菌。口服溶藥制劑。二部藥典附錄規(guī)定：含動物組織（包括提取物）的口服溶藥制劑等需要檢查沙門菌。 10、同一試驗供試品，重復兩次，一次長菌較多，另一次長菌較少，如何解釋這一現(xiàn)象？答：供試品污染的不均一性，操作上的習慣和誤差。答：供試品污染的不均一性，操作上的習慣和誤差。 11、膠囊劑的藥品，是否可用薄膜過濾法，如何操作？答：膠囊劑的藥品（固體制劑），可以用薄膜過濾法。可以先用離心法，答：膠囊劑的藥品（固體制劑），可以用薄膜過濾法。可以先用離心法，500500轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)/3/3分鐘，