火龍果潰瘍病菌拮抗細(xì)菌的鑒定和發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化①

1、火龍果潰瘍病菌拮抗細(xì)菌的鑒定和發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化摘 要 采用對(duì)峙培養(yǎng)法從來自土壤的136株細(xì)菌中篩選得到對(duì)火龍果潰瘍病菌有拮抗作用的菌株HTN-5，抑菌帶寬9.0 mm。通過形態(tài)學(xué)、生理生化特性和16s rDNA序列分析p ，將拮抗菌HTN-5初步鑒定為皮氏類芽孢桿菌Paenibacillus peoriae。從8種培養(yǎng)基中篩選出IFFI培養(yǎng)基最有利于菌株HTN-5形成抑菌活性物質(zhì)，正交試驗(yàn)優(yōu)化其成分，得最優(yōu)配方為：牛肉膏2.50 g/L，蛋白胨10.00 g/L，葡萄糖12.50 g/L，乳糖10.00 g/L，酵母膏2.50 g/L，氯化鈉5.00g/L，pH 6.8。【關(guān)鍵詞】：p 火龍果潰

2、瘍病 ；皮氏類芽孢桿菌 ；拮抗菌 ；培養(yǎng)基優(yōu)化分類號(hào) S667.9 ；S436.68火龍果（Hylocereus spp.）是一種熱帶、亞熱帶水果，屬于仙人掌科Cactaceae量天尺屬Hylocereus植物?；瘕埞a(chǎn)中美洲，20世紀(jì)90年代引入我國(guó)，在廣東、廣西、海南、福建、云南和貴州等地廣泛種植，種植面積約1.3萬hm2。近年來，火龍果遭受多種病害的侵襲1，其中，潰瘍病是危害最為嚴(yán)重的病害，在廣東、廣西等地導(dǎo)致許多果園丟荒，嚴(yán)重威脅火龍果的大面積種植和生產(chǎn)?；瘕埞麧儾∈怯尚掳瞪?jié)孢Neoscytalidium dimidiatum引起，主要危害莖，在高溫高濕下出現(xiàn)莖桿腐爛和果實(shí)開裂

3、2-3，也可引起果肉褐腐或黑腐4-5。室內(nèi)毒力測(cè)定顯示，許多化學(xué)藥劑對(duì)火龍果潰瘍病菌有很好的抑制作用6，但在生產(chǎn)上還沒有行之有效的方法控制火龍果潰瘍病發(fā)生和蔓延。筆者研究了一株從發(fā)病果園及其周圍土壤中分離篩選到對(duì)火龍果潰瘍病菌具有拮抗作用的細(xì)菌，對(duì)其進(jìn)行鑒定和發(fā)酵培養(yǎng)基成分的優(yōu)化，以期為開發(fā)防治火龍果潰瘍病的生防制劑提供依據(jù)。1 材料和方法1.1 火龍果潰瘍病菌采用病組織分離法7，從具有火龍果潰瘍病典型癥狀的組織上分離得到，經(jīng)致病性測(cè)定，確定為病原菌，通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定為新暗色柱節(jié)孢N.dimidiatum3，菌種保存在廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室。1.2 拮抗菌的分離篩選分離：采

4、用稀釋平板法從樣品分離細(xì)菌。將從廣東湛江地區(qū)發(fā)病果園及其周圍土壤中采集樣品，稀釋105倍，沸水浴5 min后，取20_L稀釋液涂布于冷卻的PDA培養(yǎng)皿上，28培養(yǎng)4864 h。篩選：采用平板對(duì)峙法進(jìn)行篩選。將火龍果潰瘍病菌接種到PDA平板上28培養(yǎng)3 d，用打孔器取直徑6.0 mm 的菌餅接種到PDA培養(yǎng)皿中央。用接種環(huán)挑取細(xì)菌接種到距菌餅3 cm處，每個(gè)菌餅周圍接種4 個(gè)細(xì)菌單菌落，28黑暗培養(yǎng)，3 d后觀察抑菌帶的形成，記錄抑菌帶的寬度和細(xì)菌菌落直徑，計(jì)算抑菌帶的寬度與細(xì)菌菌落直徑的比值，比值越大，抑菌效果越好。將對(duì)火龍果潰瘍病菌有拮抗作用的細(xì)菌轉(zhuǎn)接到PDA平板，劃線分離純化，在4冰箱中保

5、存。復(fù)篩：將有抑菌活性的細(xì)菌再次進(jìn)行平板對(duì)峙試驗(yàn)，測(cè)定其抑菌作用，挑取抑菌效果最好的菌株進(jìn)行鑒定及產(chǎn)抗菌物質(zhì)培養(yǎng)基的優(yōu)化。1.3 產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)培養(yǎng)基篩選供試培養(yǎng)基有（1）BPDB：馬鈴薯20_g、牛肉膏20 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1 000 mL、pH自然；（2）改良BPDB：馬鈴薯20_g、牛肉膏20 g、蛋白胨7 g、葡萄糖20 g、玉米粉7 g、水1 000 mL、pH自然；（3）YPAD：蛋白胨20 g、酵母膏10 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1 000 mL、pH自然；（4）NYDA：牛肉膏8 g、酵母膏5 g、葡萄糖10 g、蒸餾水1 000 mL、pH自然；（5）BPY：牛肉

6、膏5 g、蛋白胨10 g、酵母膏5 g、葡萄糖5 g、氯化鈉5 g、蒸餾水1 000 mL、pH 7.2；（6）玉米粉培養(yǎng)基：玉米粉5 g、蛋白胨0.1 g、葡萄糖1 g、蒸餾水1 000 mL、pH自然；（7）IFFI：蛋白胨10 g、牛肉膏5 g、酵母膏5 g、葡萄糖10 g、乳糖尿5 g、氯化鈉5 g、蒸餾水1 000 mL、pH 6.8；（8）NA：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、蒸餾水1 000 mL、pH自然。將經(jīng)活化后的拮抗菌用無菌水配成106107 CFU/mL的菌懸液，按1%的接種量接種到裝有20 mL BPDB 培養(yǎng)液的50 mL三角瓶中，在轉(zhuǎn)速為150 r/min 振蕩培養(yǎng)箱中28下黑暗培養(yǎng)24 h，作為種子液。按1%的接種量將種子液分別接種到裝有供篩選培養(yǎng)基的50 mL三角瓶中，裝瓶量為20 mL，150 r/min 振蕩培養(yǎng)72 h 后，經(jīng)12 000 r/min，離心15 min，取上清液，用0.22 m細(xì)菌過濾器過濾除菌，經(jīng)無菌檢驗(yàn)后得到無菌發(fā)酵液。牛