重組子的篩選與鑒定

1、NJU 重組子的篩選（重組子的篩選（screening）與鑒定與鑒定第一節(jié)、有關(guān)概念第一節(jié)、有關(guān)概念n轉(zhuǎn)化子n重組子n期望重組子n篩選n鑒定轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子n轉(zhuǎn)化子：接納有外源DNA分子（載體或重組分子）的受體細(xì)胞。n非轉(zhuǎn)化子：未接納外源DNA分子的非轉(zhuǎn)化細(xì)胞。n重組子：含有重組DNA分子的轉(zhuǎn)化子。n非重組子：僅含有空載體分子的轉(zhuǎn)化子。重組子與非重組子重組子與非重組子期望重組子與非期望重組子期望重組子與非期望重組子n期望重組子：含有外源目的基因的重組子。n非期望重組子：攜帶非目的基因的重組子。轉(zhuǎn)化子、重組子、期望重組子關(guān)系轉(zhuǎn)化子、重組子、期望重組子關(guān)系 轉(zhuǎn)化子重組子期望重組子篩

2、選（篩選（screening）n一般指從反應(yīng)體系細(xì)胞群中辨別挑選出轉(zhuǎn)化子或重組子的過程。n反應(yīng)體系細(xì)胞的組成：1、不含外源DNA的受體細(xì)胞2、含空載體的細(xì)胞（酶切未切開或重新環(huán)化的載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞）3、重組子：（1）含目的重組DNA的細(xì)胞（2）含非目的重組DNA的細(xì)胞鑒定鑒定n對(duì)篩選出的重組子重組子DNA進(jìn)行進(jìn)一步酶切、測序等，鑒定是否為目的重組子及重組子DNA序列的正確性等。 選擇標(biāo)記基因（選擇標(biāo)記基因（selectable marker gene）n指編碼的產(chǎn)物能夠使轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在有選擇劑或營養(yǎng)缺乏的情況下很好生長或表現(xiàn)出其他可視特征可視特征的基因。n構(gòu)建載體時(shí)，目的基因與選擇標(biāo)記基因在

3、載體上的空間關(guān)系有兩種：1、獨(dú)立存在。用于區(qū)分轉(zhuǎn)化細(xì)胞與未轉(zhuǎn)化細(xì)胞2、目的基因插入選擇標(biāo)記基因編碼區(qū)或其基因調(diào)控部分。用于區(qū)分空載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞與重組載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞報(bào)告基因（報(bào)告基因（reporter gene）n指載體上攜帶的、表達(dá)產(chǎn)物容易被檢測容易被檢測且能夠指示外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞與否及表達(dá)水平的基因。n構(gòu)建載體時(shí)，一般將報(bào)告基因與目的基因融合，并將報(bào)告基因置于目的基因啟動(dòng)子控制之下，報(bào)告基因與目的基因同步轉(zhuǎn)化與表達(dá)。第二節(jié)、大腸桿菌重組體的篩選第二節(jié)、大腸桿菌重組體的篩選一、質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞的篩選一、質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞的篩選（一）抗生素平板結(jié)合插入失活篩選法（一）抗生素平板結(jié)合

4、插入失活篩選法根據(jù)標(biāo)記根據(jù)標(biāo)記基因是否失活，確定是否有外源基因插入。基因是否失活，確定是否有外源基因插入。插入失活篩選法的應(yīng)用插入失活篩選法的應(yīng)用兩種情況：雙抗生素抗性基因標(biāo)記載體含一個(gè)抗生素抗性標(biāo)記，一個(gè)lacZ基因的載體帶雙抗生素抗性標(biāo)記的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化大腸桿帶雙抗生素抗性標(biāo)記的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌的篩選方法菌的篩選方法n載體攜帶兩個(gè)抗生素抗性基因，外源基因插入其中一個(gè)基因內(nèi)導(dǎo)致其失活，用兩種抗生素平板篩選重組子。n第一步：正選擇第一步：正選擇。在不進(jìn)行插入失活抗性基因的相應(yīng)抗生素平板上轉(zhuǎn)化子可以生長，非轉(zhuǎn)化子不能生長，可將轉(zhuǎn)化子直接從平板上挑出來；n第二步：負(fù)選擇第二步：負(fù)選擇。在插入失活

5、抗性基因的相應(yīng)抗生素平板上轉(zhuǎn)化子中的非重組子（未插入外源基因）可以生長，重組子（插入外源基因）不能生長，應(yīng)與第一種抗生素板進(jìn)行對(duì)照并在其上挑出含重組子的菌落。例n如pBR322質(zhì)粒含有TC r、Amp r兩個(gè)抗藥性基因，外源基因插入失活TC r后，會(huì)有三種不同表現(xiàn)的細(xì)胞:n未轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞 TC sAmp sn含載體的轉(zhuǎn)化菌落 Ampr Tcr n含重組體的陽性菌落Ampr Tcs空載體轉(zhuǎn)化菌落及重組載體轉(zhuǎn)化菌落空載體轉(zhuǎn)化菌落篩選具體做法篩選具體做法1、用轉(zhuǎn)化反應(yīng)液涂布含氨芐的LB平板，長出轉(zhuǎn)化子Ampr ；2、用無菌牙簽將Ampr的轉(zhuǎn)化子逐一挑在Tc平板上（或用無菌絲絨布、無菌濾紙影印），比

6、較兩塊板上的菌落生長情況，從Amp板上挑選出Tc板上不長的菌落即為重組子。 注意：氨芐平板菌落密度不宜過大影印平板培養(yǎng)法影印平板培養(yǎng)法利用利用lacZ基因的插入失活篩選重組子基因的插入失活篩選重組子藍(lán)白篩選法藍(lán)白篩選法 n載體同時(shí)含氨芐青霉素抗性基因氨芐青霉素抗性基因和lacZ 基因基因，外源基因插在lacZ基因內(nèi)，受體細(xì)胞為lacZ 基因互補(bǔ)菌。在同時(shí)含氨芐青霉素和藍(lán)白篩選顯色劑（ X-gal）的平板上篩選： 未轉(zhuǎn)化細(xì)胞不能生長； 空載體轉(zhuǎn)化菌長成藍(lán)色菌落； 重組子長成白色菌落。n例：pUC質(zhì)粒系列、pGEM質(zhì)粒系列、M13噬菌體lacZ基因編碼-半乳糖苷酶； lacZ基因編碼-半乳糖苷酶的

7、N端端序列片段 ，互補(bǔ)菌染色體上攜帶的缺陷基因編碼C端端片斷，兩者互補(bǔ)（-互補(bǔ)）形成有功能的全酶。藍(lán)白篩選菌落生長照片藍(lán)白篩選菌落生長照片X-galn5-Bromo-4-Chloro -3-Indoly- -D-Galactoside)，5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷n-半乳糖苷酶顯色劑：生色底物IPTG及其作用及其作用nIPTG：即Isopropyl- -D-thioagalactoside，異丙基- -D-硫代半乳糖苷n作用：乳糖操縱子誘導(dǎo)物，和載體上攜帶的大腸桿菌乳糖操縱子的調(diào)節(jié)基因（Lac I ）編碼產(chǎn)物阻遏蛋白結(jié)合，阻止其與操縱基因結(jié)合，使操縱子控制的基因（lacZ等）得以表

8、達(dá)。含Lac I 的載體：如pUC8，需要誘導(dǎo)物不含Lac I 的載體：如pUC18/19，不需誘導(dǎo)物研究中通常為何用研究中通常為何用IPTG而非乳糖作誘導(dǎo)物？而非乳糖作誘導(dǎo)物？乳糖會(huì)被宿主細(xì)胞利用而乳糖會(huì)被宿主細(xì)胞利用而IPTG不被利用。不被利用。大腸桿菌乳糖操縱子基因組成大腸桿菌乳糖操縱子基因組成IPTG例1:pUC8中l(wèi)acZ基因的插入失活例二：pGEM-3Z中l(wèi)acZ基因的插入失活（二）插入表達(dá)篩選（二）插入表達(dá)篩選n載體的選擇標(biāo)記基因前連接一段負(fù)調(diào)控序列負(fù)調(diào)控序列，插入失活負(fù)調(diào)控序列插入失活負(fù)調(diào)控序列后，其下游的篩選標(biāo)記基因才能表達(dá)。n如pTR262質(zhì)粒質(zhì)粒，在Tc（Tet）基因前有

9、來自噬菌體的cI基因，可編碼cI阻遏蛋白，抑制Tet表達(dá)。ncI基因（ Hind或Bgl位點(diǎn)）插入失活，Tc基因表達(dá)，受體細(xì)胞在Tc板上生長；未轉(zhuǎn)化細(xì)胞及及空載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞Tc表達(dá)被抑制，在Tc平板上不生長。二、二、 重組噬菌體重組噬菌體DNA轉(zhuǎn)入大腸桿菌后轉(zhuǎn)入大腸桿菌后重組子的篩選重組子的篩選（一）取代型載體：（一）取代型載體：根據(jù)基因組的大小篩選，直接挑取噬菌斑即重組子n機(jī)理： 空載體太小而不被包裝，不進(jìn)入細(xì)胞；重組-DNA可包裝成噬菌體顆粒并感染大腸桿菌產(chǎn)生噬菌斑； 未感染菌生長成菌落。（二）插入型載體（二）插入型載體n空載體及重組載體都可包裝，需要插入失活載體上的標(biāo)記基因篩選。 lacZ

10、 基因插入失活篩選：藍(lán)白篩選cI基因插入失活篩選：cI篩選利用Spi（sensitive to P2 inhibition）表型選擇：Spi篩選選擇標(biāo)記基因1、利用、利用lacZ基因的插入失活篩選重組噬菌斑基因的插入失活篩選重組噬菌斑 n如含有l(wèi)acZ基因的M13噬菌體及多種噬菌體載體（ gt11）n重組噬菌斑無色透明，非重組噬菌斑呈藍(lán)色，未轉(zhuǎn)化細(xì)胞長出菌落2、噬菌體的噬菌體的cI基因的插入失活篩選基因的插入失活篩選cI篩選法篩選法 n原理：cI基因編碼的阻遏蛋白可使感染了噬菌體的大腸桿菌進(jìn)入溶原化狀態(tài)； cI基因的插入失活使感染了噬菌體的大腸桿菌由溶原狀態(tài)進(jìn)入溶菌狀態(tài)。 重組噬菌斑：無色透明

11、 非重組噬菌斑：渾濁 未轉(zhuǎn)化菌：正常菌落Polylinker插入不影響lacZ基因表達(dá)單酶切時(shí)有這種情況噬菌斑2、 cI基因插入失活篩選n例：gt10 BNNl02（C600hflA ）系統(tǒng)n C600hflA是一種hflA突變菌；cI基因正常表達(dá)的噬菌體在其中溶原生長，不形成噬菌斑； 但cI基因插入失活的重組噬菌體卻能形成噬菌斑（Young and Davis 1983a）。hfL：high frequence lysogenization 3、spi-篩選篩選 用目的基因取代用目的基因取代噬菌體取代型載體上含有噬菌體取代型載體上含有redgam（整合基因）的填充片段后，使噬菌體由red+g

12、am+轉(zhuǎn)變?yōu)閞ed-gam-，感染P2噬菌體溶源菌后使細(xì)菌由溶原生長轉(zhuǎn)換為溶菌生長。 利用這種特性進(jìn)行的篩選稱為利用這種特性進(jìn)行的篩選稱為spi-篩選。篩選。填充片段內(nèi)含有填充片段內(nèi)含有red及及gam基因的載體如基因的載體如EMBL3和EMBL4red+gam+噬菌體可在P2噬菌體溶源菌中呈溶原生長，被定為SPi+ （ sensitive to P2 inhibition，對(duì)，對(duì)P2介入敏感）介入敏感）red-gam-噬菌體在P2溶源菌中則呈溶菌生長，定為Spi-。三、雜交篩選三、雜交篩選n菌落或噬菌斑雜交篩選第三節(jié)、轉(zhuǎn)化第三節(jié)、轉(zhuǎn)化/重組酵母菌的篩選重組酵母菌的篩選n營養(yǎng)缺陷互補(bǔ)基因n顯性

13、標(biāo)記基因一、利用營養(yǎng)缺陷互補(bǔ)基因的篩選方法一、利用營養(yǎng)缺陷互補(bǔ)基因的篩選方法n原理：受體細(xì)胞為某種營養(yǎng)缺陷型突變株，即不能合成某種營養(yǎng)成分，在缺乏該營養(yǎng)成分的培養(yǎng)基上不能生長；n攜帶相應(yīng)營養(yǎng)成分合成基因的載體轉(zhuǎn)化受體菌后，使細(xì)胞在選擇培養(yǎng)基（不含某種相應(yīng)營養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基）中能夠生長，而未被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞不能生長。酵母常用營養(yǎng)標(biāo)記基因酵母常用營養(yǎng)標(biāo)記基因n第一類：氨基酸合成基因：組氨酸合成酶基因HIS4色氨酸合成酶基因TRP1亮氨酸合成酶基因LEU2精氨酸合成酶基因 ARG4第二類：核苷酸合成基因： 尿嘧啶合成酶基因（URA3）例：含例：含HIS的載體的載體n 分泌型表達(dá)載體主要有：pPIc9，pP

14、Ic9k，pHIL-S1，pPIcza，pYAM75P6；n胞內(nèi)表達(dá)的載體主要有：pHIL-D2，pA0815，pPIC3K，pPICZ，pHWO10，pGAPZ， pGAPZa等 組氨醇脫氫酶基因（組氨醇脫氫酶基因（histidinol dehydrogenase gene，his4）缺失的畢赤）缺失的畢赤酵母酵母n主要有三類：GS115 、 SMDI168 、KM71n均不能合成組氨酸n載體需攜帶his4，轉(zhuǎn)染后的陽性重組子可以用不含組氨酸的平板進(jìn)行篩選含含URA3的載體及其相應(yīng)的受體細(xì)胞的載體及其相應(yīng)的受體細(xì)胞n載體： 酵母菌的Yep系列載體：含Amp、Tc和URA3（尿嘧啶）標(biāo)記基因n

15、受體細(xì)胞：EGY48菌株 Amp、Tc抗性基因用于在大腸桿菌中篩選重組子URA3標(biāo)記基因用于酵母轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選 二、酵母常用顯性標(biāo)記基因二、酵母常用顯性標(biāo)記基因1、氨基糖苷類藥物磷酸轉(zhuǎn)移酶基因：氨基糖苷類藥物磷酸轉(zhuǎn)移酶基因：Neo（neomycin）。）。2、博來霉素抗性基因博來霉素抗性基因：Zeo（Zeocin）。如pFLD1載體、（一）Neo選擇系統(tǒng)nNeo基因編碼氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，可以滅活氨基糖甙類抗生素，是新霉素（neomycin）、新霉素衍生物G418、卡那霉素等抗生素的抗藥基因。（二）Zeo選擇系統(tǒng)nZeo是編碼博來霉素抗性產(chǎn)物的基因。n博來霉素（ bleomycin）是一種光譜

16、抗腫瘤藥。三、酵母其他顯性標(biāo)記基因1、藍(lán)白篩選基因：LacZ基因2、 銅離子抗性蛋白基因：CUP1基因。編碼一種銅離子螯合蛋白，適合銅離子敏感菌（如釀酒酵母）的篩選。3、赭石突變抑制基因：sup4利用赭石突變抑制基因利用赭石突變抑制基因 sup4篩選重組酵母菌篩選重組酵母菌n酵母菌AB1380（與 YAC 載體配套）的胸腺嘧啶合成酶基因帶有一個(gè)赭石突變 ade 2-1，使其在基本培養(yǎng)基上形成紅色菌落，但在缺少某種營養(yǎng)素的選擇培養(yǎng)基上不能生長。n當(dāng)帶有赭石突變抑制基因 sup4 的空載體存在于細(xì)胞中時(shí)，可抑制 ade 2-1基因的突變效應(yīng)，該酵母菌在選擇培養(yǎng)基上形成正常的白色菌落；n sup4被

17、外源基因插入失活后重組子呈紅色。YAC 載體帶有trp 1、 leu 2和 his 3、 ura3 以及 sup4密碼子改變成UAA的無義突變又叫赭石突變第四節(jié)、轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞篩選第四節(jié)、轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞篩選一、哺乳動(dòng)物細(xì)胞常用的選擇標(biāo)記基因一、哺乳動(dòng)物細(xì)胞常用的選擇標(biāo)記基因1、新霉素抗性基因：、新霉素抗性基因： neo（neomycin）2、博來霉素抗性基因：、博來霉素抗性基因：zeocin3、黃嘌呤、黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因：gpt黃嘌呤黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（XGPRT）基因（基因（ecogpt）選擇系統(tǒng)選擇系統(tǒng) n由大腸

18、桿菌Ecogpt 基因編碼的黃嘌呤黃嘌呤-鳥嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶（XGPRT）是一種核苷酸代謝酶，能夠把黃嘌呤轉(zhuǎn)變?yōu)辄S苷酸（XMP），并最終形成鳥苷酸（GMP）。n霉酚酸霉酚酸能抑制次黃嘌呤核苷酸脫氫酶次黃嘌呤核苷酸脫氫酶的作用而阻斷嘌呤核苷酸的經(jīng)典合成途徑。n攜帶gpt的載體轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞后，使受體細(xì)胞在含霉酚酸的HAT培養(yǎng)基中啟動(dòng)核苷酸合成替代途徑，利用培養(yǎng)基中補(bǔ)加的黃嘌呤合成GMP，得以存活。合成GMP 的不同途徑 正常途徑（經(jīng)典途徑） IMP XMP GMP （次黃苷酸）霉酚酸（） （黃苷酸） （鳥苷酸） 替代途徑 黃嘌呤 XMP GMP XGPRT （） HGPR

19、T基因選擇系統(tǒng)組成1、受體細(xì)胞：普通哺乳動(dòng)物細(xì)胞2、載體：含有 gpt基因的載體，如 pAG4622（人-鼠嵌合輕鏈表達(dá)載體） ，pSV2gpt （人-鼠嵌合重鏈表達(dá)載體）3、培養(yǎng)基：篩選篩選XPGRT 活性缺陷細(xì)胞的活性缺陷細(xì)胞的HAT選擇培養(yǎng)基組選擇培養(yǎng)基組成如下：成如下： 霉酚酸 黃嘌呤（合成鳥苷酸GMP ） 腺嘌呤 胸苷（合成胸腺嘧啶） 透析除去鳥嘌呤的血清胸苷合成中的主要抑制劑nfluorouracil（五氟脲嘧啶）nmethotrexate（氨甲蝶呤或甲氨蝶呤 ）naminopterin（氨基喋呤）二、哺乳動(dòng)物細(xì)胞常用報(bào)告基因二、哺乳動(dòng)物細(xì)胞常用報(bào)告基因n-半乳糖苷酶基因n綠色熒光

20、蛋白基因（green fluorescent protein，GFP） n熒光素酶基因（luciferase，Luc）三、哺乳動(dòng)物細(xì)胞其他選擇標(biāo)記基因三、哺乳動(dòng)物細(xì)胞其他選擇標(biāo)記基因1、二氫葉酸還原酶基因、二氫葉酸還原酶基因：dfhr2、胸苷激酶基因、胸苷激酶基因：tk二氫葉酸還原酶基因（二氫葉酸還原酶基因（dfhr）選擇系統(tǒng)選擇系統(tǒng)n二氫葉酸還原酶（dihydrofolate reductase，DHFR）可將二氫葉酸還原成四氫葉酸，后者提供核苷從頭合成的甲基甲基。Dfhr -的突變 不生長體受體細(xì)胞 不含外源核苷的常規(guī)培養(yǎng)基dfhr的重組DNA 生長轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞二氫葉酸還原酶基因（二氫葉酸

21、還原酶基因（dfhr）選擇系統(tǒng)組成選擇系統(tǒng)組成 1、受體細(xì)胞：dfhr缺陷型細(xì)胞。如dfhr- CHO細(xì)胞2、載體：攜帶dfhr的質(zhì)粒載體。3、培養(yǎng)基： 無核苷的培養(yǎng)基。需透析血清以除去內(nèi)原性核苷。胸腺嘧啶脫氧核苷激酶基因（胸腺嘧啶脫氧核苷激酶基因（tk）選擇系統(tǒng)選擇系統(tǒng)n胸腺嘧啶脫氧核苷激酶（thymidine kinase，TK），是核苷酸合成補(bǔ)救途徑中的一種酶，能把胸苷轉(zhuǎn)化為胸苷磷酸，保證核苷酸的順利合成。TK基因缺陷受體細(xì)胞 HAT選擇培養(yǎng)基 不生長 外源基因轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞 生長HAT選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基n用于篩選具有次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶移酶（HGPRT）或胸苷激酶（

22、胸苷激酶（TK）活性缺陷細(xì)胞的培養(yǎng)基。篩選篩選TK 活性缺陷細(xì)胞的活性缺陷細(xì)胞的HAT培養(yǎng)基主要組成1、氨甲喋呤（aminopterin，A）：葉酸類似物（拮抗劑），抑制嘌呤和胸苷酸的從頭合成途徑。2、次黃嘌呤（hypoxanthine，H）：鳥嘌呤核苷酸鳥嘌呤核苷酸（ GMP）和腺嘌呤核苷酸腺嘌呤核苷酸（ AMP）替代途徑合成底物3、胸苷（thymidine，T）：胸腺嘧啶核苷酸（ TTP）合成替代途徑的材料。胸苷需要在TK作用下合成出TTP。tk +細(xì)胞可以存活， tk -細(xì)胞不能存活。合成dTTP的不同途徑 正常途徑（經(jīng)典途徑）dCDP dTTP 氨甲喋呤（） 替代途徑胸嘧啶核苷 dTT

23、P （胸苷） 胸苷激酶 （） 第五節(jié)、重組子結(jié)構(gòu)特征的鑒定第五節(jié)、重組子結(jié)構(gòu)特征的鑒定 n核酸分子雜交法n裂解細(xì)菌電泳鑒定分子大小n限制性內(nèi)切酶法限制性內(nèi)切酶法nPCR法n基因產(chǎn)物檢測法基因產(chǎn)物檢測法n序列分析序列分析一、一、 核酸分子雜交篩選法核酸分子雜交篩選法 nSouthern印跡雜交：用標(biāo)記的核酸探針檢測目的基因存在與否n步驟： 用內(nèi)切酶消化重組子 凝膠電泳分離 印跡到硝酸纖維素膜上 用標(biāo)記的DNA探針雜交，若有帶顯示，說明其來源細(xì)胞為陽性重組體。 二、裂解細(xì)菌電泳鑒定分子大小法篩選重二、裂解細(xì)菌電泳鑒定分子大小法篩選重組子組子n是從初篩的轉(zhuǎn)化子中進(jìn)一步篩出重組子的方法。n依據(jù)：重組載

24、體與空載體DNA大小不同，在同一電場的遷移率也不同適用于插入片段較大的重組子篩選（重組子與載體電泳遷移率差別較明顯）裂解細(xì)菌電泳鑒定分子大小法篩選重組子的裂解細(xì)菌電泳鑒定分子大小法篩選重組子的步驟步驟 三、限制性內(nèi)切酶法三、限制性內(nèi)切酶法n原理：外源片段通過特定的酶切位點(diǎn)插入到載體上，原理：外源片段通過特定的酶切位點(diǎn)插入到載體上，因此，可以用這些限制性酶切割提取的質(zhì)粒因此，可以用這些限制性酶切割提取的質(zhì)粒DNA，電泳分析插入片段。電泳分析插入片段。用途：1、區(qū)分期望重組子和非期望重組子2、判斷插入的DNA分子質(zhì)量3、判斷平末端連接的插入方向四、四、PCR法法n原理：原理：根據(jù)插入根據(jù)插入DNA

25、片段設(shè)計(jì)特異性片段設(shè)計(jì)特異性引物，引物，以小量抽提的轉(zhuǎn)化子DNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，能擴(kuò)增出特異片段的轉(zhuǎn)化子為攜有目的基因的重組子。n應(yīng)用： 1、鑒定重組子 2、鑒定插入片斷方向PCR引物設(shè)計(jì)示意圖 引物僅與載體上外源基因兩側(cè)序列或外源基因序列互補(bǔ)時(shí)，只能判斷插入片段有無及大小而不能判斷插入片段方向；引物與載體上外源基因兩側(cè)序列及部分外源基因序列同時(shí)互補(bǔ)時(shí)，既可檢測插入片段有無及大小，又可檢測插入方向。 例、酵母重組子的篩選和酵母重組子聚合酵母重組子的篩選和酵母重組子聚合酶鏈反應(yīng)檢測酶鏈反應(yīng)檢測n磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在畢赤酵母中的高效表達(dá)nChin J Arterioscler , Vol 10 , No 4n用營養(yǎng)缺陷型的方法檢查有無外源基因的插入；n取新鮮培養(yǎng)的重組子菌落溶于10 l 無菌水中，加入30 u 的裂解酶，25 作用45 min，然后于沸水中處理10 min ，取上清部分為模板進(jìn)行聚合酶鏈反