蘇氨酸產(chǎn)生菌的鑒定誘變選育及其發(fā)酵條件優(yōu)化

1、一株L-蘇氨酸產(chǎn)生菌的鑒定、誘變選育及其發(fā)酵條件優(yōu)化 一、研究的目的及意義 二、研究的內(nèi)容與方法 三、研究結(jié)果 四、展望一、研究的目的及意義L-蘇氨酸是必需氨基酸之一，用途廣泛：食品：作為營養(yǎng)增補劑，可恢復(fù)人體疲勞、 促進(jìn)生長發(fā)育飼料：作為飼料添加劑，調(diào)整飼料氨基酸平 衡、促進(jìn)生長、改善肉質(zhì) 醫(yī)藥：配置復(fù)合氨基酸輸液、 制造單酰胺菌素的原料 目前，全球蘇氨酸的需求量要明顯大于其總產(chǎn)量，而且缺口很大。 我國蘇氨酸工業(yè)發(fā)展稍晚，21世紀(jì)初國內(nèi)蘇氨酸年需求量僅為千噸，2009年接近2萬噸。21世紀(jì)初期，我國蘇氨酸還主要依賴于進(jìn)口，所以，蘇氨酸生產(chǎn)具有很大的發(fā)展?jié)摿?。二、研究的?nèi)容與方法（一）L-蘇氨

2、酸產(chǎn)生菌的鑒定1. 形態(tài)學(xué)特征觀察 主要包括菌落的形態(tài)、細(xì)胞個體的形態(tài)、大小、排列、運動性、特殊構(gòu)造和染色反應(yīng)等。 形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果：革蘭氏陽性，菌落呈圓形，黃色，無芽孢，有運動性圖1.WS4006-7E的菌體形態(tài) 圖2.WS4006-7E革蘭氏染色結(jié)果 2. 生理生化特征鑒定測定項目WS4006-7E測定項目WS4006-7E氧化酶-果糖+接觸酶+乳糖-硝酸鹽還原+木糖-明膠液化-阿拉伯糖-甲基紅+葡萄糖+V-P-麥芽糖+脲酶-山梨醇+脂酶+甘露醇-淀粉水解-H2S生成-蔗糖+KCN生長-表1.生理生化特征鑒定結(jié)果 根據(jù)形態(tài)學(xué)特征和生理生化特征鑒定結(jié)果，還不能確定WS4006-7E菌株的名稱，

3、近年來，由于分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，16SrDNA序列測定被認(rèn)為是最適細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育和分類鑒定的指標(biāo)。所以，又對菌株進(jìn)行了分子學(xué)上的鑒定。3.分子鑒定 WS4006-7E經(jīng)PCR擴(kuò)增出的16SrDNA得到的全序列為1508bp，根據(jù)WS4006-7E的序列比對分析和所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明WS4006-7E與Stenotrophomonas maltophilia的親緣關(guān)系較近，但由于未在同一個最小分支中，所以很難將其定為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌，所以鑒定結(jié)果為該菌為和嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌親緣關(guān)系非常近的一種新菌種。（二） L-蘇氨酸產(chǎn)生菌的誘變選育 原理：根據(jù)微生物的生物合成途徑以及代謝控制發(fā)酵技術(shù)，通

4、過誘變育種，獲得各種遺傳變異菌株，從而打破正常的代謝產(chǎn)物合成途徑和代謝調(diào)節(jié)機制，人為地使目的產(chǎn)物大量合成和積累。 本文以L-蘇氨酸產(chǎn)生菌WS4006-7E為出發(fā)菌株，經(jīng)亞硝基胍、紫外線和硫酸二乙酯逐級誘變，定向選育出一株帶有帶有Met-+Lys-+Ile-遺傳標(biāo)記的L-蘇氨酸高產(chǎn)菌。選育系譜 L-蘇氨酸產(chǎn)量（g/L）WS4006-7E 2.980 NTG誘變WS4006-7E-N-37（Lys-） 3.536 UV誘變 WS4006-7E-NU-23 （Lys-+ Met-） 4.458 DES誘變WS4006-7E-NUT-21（Lys-+ Met-+Ile-） 5.679（三）L-蘇氨酸發(fā)

5、酵條件優(yōu)化1.正交實驗設(shè)計優(yōu)化種子培養(yǎng)基 選取種子培養(yǎng)基的四大主要成分：葡萄糖（A）、玉米漿（B）、硫酸銨（C）、酵母膏（D），進(jìn)行四因素三水平的正交實驗。 L-蘇氨酸產(chǎn)量（g/L）總和實驗號ABCD12111115.365.4610.82212225.685.711.39313335.055.0810.13421234.874.919.78522315.335.0310.36623125.735.7211.45731324.814.799.60832135.125.0810.20933215.445.5510.99T132.3430.2032.4732.17T231.5931.9532.16

6、32.44T330.7932.5730.0930.11R1.552.372.382.33正交試驗安排表及試驗結(jié)果 從上表可以看出，這四個因素的最優(yōu)水平為A1、B3、C1、D2 ，因此，根據(jù)實驗結(jié)果可確定出種子培養(yǎng)基的最佳種子配比。 正交試驗所確定的最佳條件并未包含在九個實驗中，為了進(jìn)一步確定實驗結(jié)果，采用最佳條件進(jìn)行驗證。搖瓶序號12345平均L-蘇氨酸產(chǎn)量（g/L）5.835.755.635.765.785.75驗證實驗結(jié)果 2.單因素實驗設(shè)計優(yōu)化種子培養(yǎng)基3. 單因素實驗設(shè)計優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)件4. 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化（1）碳源、氮源的選擇（2）葡萄糖、硫酸銨的添加量對發(fā)酵產(chǎn)酸的影響（3）均勻設(shè)計

7、優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基序號玉米漿磷酸鹽硫酸鎂硫酸亞鐵硫酸錳碳酸鈣1100.60.150.0060.006102150.80.20.0080.0081532010.250.010.01204251.20.30.0120.012255301.40.350.0140.014306351.60.40.0160.01635六因素水平表（g/L） 序號玉米漿X1磷酸鹽X2硫酸鎂X3硫酸亞鐵X4硫酸錳X5碳酸鈣X6L-Thr產(chǎn)量1100.80.250.0120.014355.422151.20.40.0060.01304.353201.60.20.0140.006255.634250.60.350.0080.016

8、207.1453010.150.0160.012157.56351.40.30.010.008106.92發(fā)酵培養(yǎng)基均勻設(shè)計試驗方案及試驗結(jié)果（g/L）變量回歸系數(shù)F值7.250X2*X20.40521.611X3*X3-8.536-105.663X5*X511660.46662.243X5*X6-7.817-244.629回歸結(jié)果 根據(jù)回歸結(jié)果得出的二次回歸方程為：Y=7.25+0.405X2*X2-8.536X3*X3+11660.466X5*X5-7.817X5*X6，該方程的相關(guān)系數(shù)為R=1.000，F(xiàn)值=22745.972，顯著水平P=0.005，說明該方程的擬合程度較好。 根據(jù)回歸

9、分析的結(jié)果，進(jìn)行優(yōu)化后發(fā)酵培養(yǎng)基的驗證試驗，結(jié)果見表搖瓶序號12345平均L-Thr產(chǎn)量（g/L）9.879.939.859.849.909.878三、研究結(jié)果 1.根據(jù)伯杰氏菌種鑒定手冊和常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊，對L-蘇氨酸產(chǎn)生菌WS4006-7E進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定、生理生化鑒定的主要結(jié)果為：革蘭氏陽性，無芽孢的棒狀桿菌，有運動性，氧化發(fā)酵產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，接觸酶、甲基紅、硝酸鹽還原、脂酶陽性，氧化酶、V-P、明膠液化、脲酶等陰性。根據(jù)此結(jié)果，還不能不能準(zhǔn)確確定出WS4006-7E的分類，所以，又對該菌進(jìn)行了16SrDNA序列同源性分析，結(jié)果表明，WS4006-7E與嗜麥芽寡養(yǎng)單包菌的親緣關(guān)系較近，但由

10、于未在同一個最小分支中，所以很難將其定為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌，所以鑒定結(jié)果為該菌為和嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌親緣關(guān)系非常近的一種新菌種。 2.以WS4006-7E為出發(fā)菌株，經(jīng)亞硝基胍、紫外線、硫酸二乙酯逐級誘變，最終選育出一株帶有帶有Met-+Lys-+Ile-遺傳標(biāo)記的L-蘇氨酸高產(chǎn)菌WS4006-7E-NUT-21，發(fā)酵72h可產(chǎn)L-蘇氨酸5.679 g/L。 3. 通過對種子培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)條件的優(yōu)化，確定了最佳種子培養(yǎng)基及種子的最適培養(yǎng)條件。應(yīng)用單因素試驗設(shè)計和均勻設(shè)計，確定了最適的發(fā)酵培養(yǎng)條件，最適的發(fā)酵培養(yǎng)基組成及配比。四、展望 1.本文選育得到的L-蘇氨酸產(chǎn)生菌WS4006-7E產(chǎn)酸水平較高，但是由于時間有限，還沒有使之達(dá)到理想的產(chǎn)酸水平，可能是菌種本身的原因，因為經(jīng)菌種分類鑒定，WS4006-7E為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌，該菌本身具有分解多種糖類產(chǎn)酸的能力，但其分泌量比