細胞壁蛋白與寡糖素3

1、細細 胞胞 壁壁 (cell wall) 次生細胞壁、初生細胞壁和中膠層結構示意圖次生細胞壁、初生細胞壁和中膠層結構示意圖細胞壁中的蛋白質(the proteins of cell wall) l是植物初生細胞壁中一類富含羥脯氨酸的糖蛋白(hydroxyproline-richglycoprotein ergp)，為英國劍橋大學的lamport和northcote于1960年首次發(fā)現(xiàn)。同年，美國威斯康星大學的dougall和shimbayasi也發(fā)表了類似的結果。因猜測這種蛋白質可能與細胞生長時的細胞壁伸展性有關，故lamport試名之為伸展蛋白。llamport在番茄細胞壁中發(fā)現(xiàn)了羥脯氨酸阿

2、拉伯糖苷，并證實了這類糖苷和不被糖基取代的羥脯氨酸在菌藻、苔蘚、蕨類和種子植物四大門的多種植物細胞壁中的廣泛存在。l用酸和胰酶水解番茄細胞壁，得到了5種肽段。其突出特點是都含有五肽段五肽段ser(hyp)4。l在此基礎上，經證實伸展蛋白中半乳糖以糖苷鍵與絲氨酸相聯(lián)之后，lamport提出了伸展蛋白由重復的結構單位所組成的設想。la：serhyphyphyphypserhypserhyphyphyphyp(“tyr”tyr)lyslb：serhyphyphyphypserhyplyslc：serhyphyphyphypthrhypvaltyrlysld：serhyphyphyphyplysle：

3、serhyphyphyphypval(“tyr”lyslys)lsmith等發(fā)展了從完整細胞直接分離純化伸展蛋白前體的技術，從番茄懸浮培養(yǎng)細胞得到了伸展蛋白前體p1和p2。l經氟化氫脫糖、胰酶水解和高效液相層析，得的肽段特點也是都具有五肽段ser(hyp)4 。這就進一步支持了lamport等提出的結構單位的設想。lp1：lh5：serhyphyphyphypthrhypvaltyrtyslh20：serhyphyphyphypvallysprotyrhisprothrhypvaltyrlyslp2：lh4：serhyphyphyphypvaltyrlyslh11：serhyphyphyphy

4、pval1/2idtlyslchen和varner建立了胡蘿卜伸展蛋白的cdna克隆和基因組文庫。從dna序列推斷出一個有306個氨基酸殘基、富含羥脯氨酸的多肽。其中五肽段ser-(hyp)4重復了25次。此后，其它研究組相繼在菜豆和牽牛等植物中分離了伸展蛋白的cdna或基因組克隆，并發(fā)現(xiàn)它們所編碼的多肽中都有重復出現(xiàn)的ser-(pro)4。l羥脯氨酸是脯氨酸羥基化的產物，ser-(hyp)4是伸展蛋白中重復出現(xiàn)的特征性結構單位，甚至可以說是判別伸展蛋白的絕對必要條件。 la：serhyphyphyphypserhypserhyphyphyphyp(“tyr”tyr)lyslb：serhyph

5、yphyphypserhyplyslc：serhyphyphyphypthrhypvaltyrlysld：serhyphyphyphyplysle：serhyphyphyphypval(“tyr”lyslys)l (帶引號者為酪氨酸衍生物)l一些研究者發(fā)現(xiàn)有些細胞壁蛋白，它們的生化特性與經典的伸展蛋白類似，但卻不含ser-(hpy)4這一結構單位。如tierney等在胡蘿卜根中發(fā)現(xiàn)的、具有13次重復的 proproval/ilehislys和第4次重復 proprovaltyrthr 的壁蛋白p33；franssen等發(fā)現(xiàn)的、含有重復20次的proprohisglulys的根瘤蛋白noduli

6、n75；以及 hong等和averyhart-fullard等發(fā)現(xiàn)的含有多次重復proprovaltyrlys的大豆細胞壁蛋白。因為這些蛋白質都不含有ser-(pro)4而不被認為是伸展蛋白。 l李雄彪等從甜菜懸浮培養(yǎng)細胞中純化到一種細胞壁蛋白p1。根據(jù)這種糖蛋白的氨基酸組成、中性糖的種類和含量、免疫學特性、電鏡下的形狀以及能被伸展蛋白過氧化物酶在體外交聯(lián)成多聚體等特性，而被確認為伸展蛋白的前體。但是，經胰酶水解后的甜菜p1的肽段序列中卻不存在ser-(hyp)4。l根據(jù)甜菜p1的肽段序列，經分析比較胡蘿卜p33、nodulin75等氨基酸序列，李雄彪等提出serhyphyp(x)hyphyp

7、肽段是伸展蛋白的結構特點。 lh2：tyrprohyphypthrhypvaltyrtyslh1：serhyphypvalhislyslh5：serhyphypvalhisglutyrprohyphypthrhypvaltyrtysl1、羥脯氨酸的含量一般為蛋白質的30%40%。其它含量較高的氨基酸是絲氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、組氨酸和賴氨酸。l2、糖的組分主要是阿拉伯糖和半乳糖，含量為糖蛋白的26%65%。聯(lián)接到氨基酸上的糖在維持伸展蛋白的羥脯氨酸左手螺旋第ii型構象中起重要作用。l3、含特征性結構單位serhyphyp(x)hyphypl4、透射電鏡下單體分子為具紐結的桿棒狀l不少實驗

8、證據(jù)表明，伸展蛋白與細胞壁的伸展性并沒有直接關系。lamport本人也不堅持初衷。但由于extensin這一名詞已被廣泛沿用至今，目前尚未有人建議為伸展蛋白“正名”。l前述伸展蛋白的結構特點與動物結締組織中富含羥脯氨酸的結構糖蛋白膠原的特點極其相似。所以，人們認為伸展蛋白是細胞壁中起結構作用的一種組分。llamport和epstein提出的經緯模型(warp and weft model)較好地解釋了伸展蛋白的結構作用。l可溶性的伸展蛋白前體從垂直于細胞壁平面的方向(緯向)由細胞質分泌到細胞壁中；l 在平行于細胞壁的方向(經向)，纖維素一層一層地敷著(apposition)到細胞壁上并形成獨立

9、的微纖絲;l橫向進入、亦即內填(intussusception)入細胞壁的伸展蛋白前體之間以異二酪氨酸為聯(lián)鍵形成伸展蛋白網；l經向的纖維素網和緯向的伸展蛋白網相互交織；l結合在纖維素上的木葡聚糖和以離子鍵結合在伸展蛋白上的果膠象閂塞(latch)一樣可以可逆地松弛或固定兩網的聯(lián)結。ltolbott及ray提出了初生細胞壁的“千層餅”模型。他們認為細胞壁各類組分之間存在大量非共價鍵，只有很少的共價鍵。細胞壁是由各種組分(果膠多糖、伸展蛋白、木葡聚糖、纖維素等)一層一層地重復堆積而形成的，形狀極似千層餅。l機械損傷、真菌感染、植物抗毒素誘導劑處理、甚至熱處理都能引起細胞壁中的伸展蛋白反應。l在把胡

10、蘿卜切成片這樣的機械損傷后，細胞壁中就積累了hrgp，并且hrgp的mrna含量也增加l損傷后的番茄莖也積累hrgp和hrgp的mrna。植物被感染hrgp的增加與抗病性相關。lesquerre-tugaye和lamport發(fā)現(xiàn)引起炭疽病的瓜類炭疽刺盤孢菌(colletotrichum lagenarium)感染黃瓜植株后，后者細胞壁中的hrgp增加約10倍。lhammer-schmidt等則發(fā)現(xiàn)當真菌瓜瘡痂芽枝霉(cladosporium cucumerinum)感染抗性品種和敏感品種的黃瓜植株時，抗性品種細胞壁中羥脯氨酸含量增加比敏感品種的更迅速。l細胞壁hrgp是一類熱休克(heat s

11、hcok)蛋白。lstemer和hammerschmidt發(fā)現(xiàn)黃瓜植株被熱處理后，其細胞壁的羥脯氨酸含量增加。同時，這種經過熱休克的植株對真菌感染的抗性增強。lzimmerman等則發(fā)現(xiàn)經過熱休克的胡蘿卜培養(yǎng)細胞中hrgp的mrna含量增加。l大豆種皮中羥脯氨酸的含量可能與種子發(fā)育有一定關系。l生長素誘導的伸長生長與伸展蛋白的合成、積累、轉運之間也可能有某種聯(lián)系。l光敏色素調控細胞壁中羥脯氨酸的含量又使人認為伸展蛋白可能與光形態(tài)建成有關。l伸展蛋白可能是將多糖從細胞質運輸?shù)郊毎诘妮d體。 lcondit和meagher在“nature” 上報道從矮牽?；蛭膸熘蟹蛛x了grp基因，該基因編碼的多

12、肽grp由384個氨基酸殘基組成，其中67%的殘基為甘氨酸。和基因克隆pdc5a1編碼的伸展蛋白一樣，grp編碼的多肽也包括一個信號肽。該信號肽含27個氨基酸殘基，在rgp的運輸及翻譯后加工中起作用。grp的一級結構可以用(gly-x)n表示。其中x既可以是甘氨酸，也可以是其他氨基酸。grp的構象為8段反向平等的折迭片。l在同一期“nature”上，研究細胞壁蛋白的權威專家、美國華盛頓大學的joseph e.varner教授認為grp是一種新的細胞壁結構蛋白。其原因如下：l甘氨酸在多種植物細胞壁中普遍存在并且含量豐富。如大豆(glycine max)和無花果葉瓜(cucurbita ficif

13、olia)的種皮細胞壁都含21%甘氨酸，燕麥(avena sativa)胚芽鞘細胞壁含27%的甘氨酸，希臘杠柳(periploca graeca)莖的細胞壁含31%甘氨酸，而西葫蘆(cucurbita pepo)種皮含甘氨酸高達47%。l萊因衣藻(chlamydomonas reinhardi)細胞壁的主要結構糖蛋白含23%的甘氨酸。噬熱菌(thermomicrobium roseum)細胞壁中一種主要的蛋白質有34%的甘氨酸。這些事實表明富含甘氨酸的蛋白質在細胞壁的結構中起重要作用。lgrp的結構特征與動物的結構蛋白膠原(xprogly)n和家蠶繭絲蛋白(xgly)n的結構特征類似，也具有某

14、些多次重復出現(xiàn)的短肽段。lgrp被普遍認為是一種細胞壁蛋白。 l富含蘇氨酸和羥脯氨酸與富含組氨酸和羥脯氨酸的細胞壁糖蛋白l(threonine and hydroxyproline-rich glycoprotein,thrgp. histidine and hydroxy proline-rich glycoprotein, hhrgp)l首次發(fā)現(xiàn)并一直研究伸展蛋白的lamport研究組在1987年從懸浮培養(yǎng)的玉米細胞中分離純化到 一 種 富 含 蘇 氨 酸 和 羥 脯 氨 酸 的 糖 蛋 白(thrgp)。一年后又分離到一種富含組氨酸和羥脯氨酸的糖蛋白(hhrgp)。l他們的新發(fā)現(xiàn)使得單子

15、葉植物(特別是禾本科植物)細胞壁中經典的伸展蛋白含量很低的現(xiàn)象有了合理的解釋。 細胞壁結構蛋白的含糖量細胞壁結構蛋白的含糖量( (w/w)w/w) 結構蛋白結構蛋白蛋白含量蛋白含量(%)糖含量糖含量(%)hrgpthrgphhrgp607058403042 細胞壁結構蛋白中糖的組成細胞壁結構蛋白中糖的組成(%(%，w/w)w/w) 結構蛋白結構蛋白阿拉伯糖阿拉伯糖半乳糖半乳糖葡萄糖葡萄糖thrgphhrgphrgp100639003767002l首先，用鹽溶液洗脫完整的懸浮細胞來獲得蛋白質的方法決定了thrgp和hhrgp位于細胞壁中。l其次，除了富含蘇氨酸或組氨酸以外，thrgp和hhrgp

16、的氨基酸組成與經典的伸展蛋白的類似。此外，它們不僅都是糖蛋白，而且糖的組成及 含量和伸展蛋白的也有相似之處。并發(fā)現(xiàn)桿狀的分子外形與雙子葉植物伸展蛋白的外形相同；用番茄伸展蛋白p1免疫白兔產生的抗體能與thrgp和hhrgp發(fā)生較強的交叉反應。l最后，thrgp和hhrgp經酶解后的肽譜分析結果表明，這兩種糖蛋白的氨基酸序列和番茄伸展蛋白的氨基酸序列類似，也具有較多的重復肽段。l根據(jù)上述各方面的研究結果，lamport等認為thrgp和hhrgp是禾本科單子葉植物細胞壁中的伸展蛋白。 l阿拉伯半乳聚糖蛋白是一類糖蛋白。它們存在于植物的根、莖、葉、花、種子及培養(yǎng)的愈傷組織之中。在進化程度較低的植物

17、，例如苔蘚中也發(fā)現(xiàn)存在agp。lagp干重的90%左右是碳水化合物。從阿拉伯半乳聚糖蛋白這一名稱可以看出，agp中的糖類主要是阿拉伯糖和半乳糖。除此以外，還存在少量的甘露糖、木糖、葡萄糖、巖藻糖以及葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸。各種agp的分子量變化很大。這主要是由于它們糖基化的程度不同而造成的。 lagp的生物合成與細胞壁中hrgp的生物合成類似。編碼agp的mrna在粗糙內質網上被翻譯成蛋白質。新合成的agp中的脯氨酸在內質網中被羥基化為羥脯氨酸，然后，蛋白質再在高爾基體中被糖基化，最終形成糖蛋白。lagp是胞外基質中的糖蛋白，所以它們既可能作為細胞間的潤滑劑(lubricant)，也可以是樹膠

18、的主要成分，還可能在細胞的相互識別中起重要作用。l富硫蛋白是一類低分子量蛋白，僅含有不到50個氨基酸殘基。早在1885年，jago等人就曾指出小麥面粉中存在一種使啤酒酵母致命的有毒物質。1942年，balls等人將這種有毒成分分離出來，發(fā)現(xiàn)是一種低分子量的多肽，并稱之為purothionin。l此后，在大麥、燕麥、黑麥、玉米以及某些雙子葉植物中也發(fā)現(xiàn)了這類多肽。因為這些多肽都有較多的含硫氨基酸，而且它們的許多性質又相互關聯(lián)，故把它們統(tǒng)稱為富硫蛋白。l1987年，h.bahlmann和k.apel在大麥葉中發(fā)現(xiàn)了富硫蛋白。它們存在于大麥葉片的細胞壁和液泡之中。l在黃化大麥葉中，所有細胞壁內雖然均

19、可檢測出富硫蛋白，但是，表皮細胞層的外壁中富硫蛋白的濃度卻要高得多。l富硫蛋白大多數(shù)表現(xiàn)出對于細菌、真菌和高等生物的毒性。種子中的富硫蛋白，除了作為貯存蛋白外，它們也可能作為防御毒素，保護種子免遭細菌或真菌的侵染。l大麥幼苗在其生長早期處于大量的土壤微生物環(huán)境之中。這些微生物隨時都可侵染大麥幼苗。因此，黃化苗合成大量富硫蛋白以作為防御手段。一旦幼苗出土并暴露在陽光下和空氣中時，直接與它們接觸的病原微生物也相應減少，所以葉片內富硫蛋白的mrna濃度也就大大降低了。 l正常生長的植物接種白粉菌(erusyphe graminis)后，又能夠迅速合成富硫蛋白的mrna。由此看來，富硫蛋白很可能參與了

20、植物的防御體系。l albersheim等發(fā)現(xiàn)一些初生壁的寡糖片段能誘導植物抗毒素(phytoalexin)的形成，此外，它們還對其它生理過程有調節(jié)作用，便將這種具有調節(jié)活性的寡糖片斷稱為寡糖素(oligosaccharin)。 l細胞壁主要成分是90%左右的復雜多糖和10%的糖蛋白。多糖又可分為三大類：纖維素，半纖維素和果膠類。l在初生細胞壁中約20%30%是纖維素，它是1，4連接的d葡萄糖的聚合物，半纖維素中常見的是木葡聚糖和木聚糖，前者在雙子葉植物中較多，而后者主要在單子葉植物中，兩者結構完全不同。木葡聚糖的主鏈也是1，4連接的葡萄糖，但約3/4的葡萄糖的c6上接有木糖，有些木糖上還接有

21、半乳糖和l巖藻糖。木聚糖主鏈是1，4連接的木糖，在部分木糖c3上還可掛有單個l阿拉伯糖。有的側鏈較長，在l阿拉伯糖基上再接有半乳糖，木糖或半乳糖基木糖。一些木糖的c2上也可接上葡萄糖醛酸或阿拉伯糖。l果膠類多糖的特征是含有較豐富的半乳糖醛酸或其他酸性單糖。最常見的是多聚半乳糖醛酸。它們是半乳糖醛酸通過1，4連接的同多糖。這種多聚半乳糖醛酸中的羧基仍然可以形成酯類，柑桔皮中的果膠就屬于這種結構。另外還有兩類果膠多糖，鼠李半乳糖醛酸聚糖i和鼠李半乳糖醛酸聚糖ii。前者的結構比后者簡單。假挪威槭(acer psuedoplatanus)的鼠李半乳糖醛酸聚糖i的聚合度2000，骨架中約有l(wèi)鼠李糖和半乳

22、糖醛酸各300個。兩者交替以1，2和1，4連接方式存在，約有一半的l鼠李糖的c4上有側鏈，其組成有半乳糖、l阿拉伯糖以及少量的l巖藻糖，這些分支糖鏈的結構非常復雜。l還有一些其他的聚糖，如阿拉伯聚糖，半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖等。l以前只認為這些多糖合在一起構成極為牢固的細胞壁的骨架，猶如鋼筋水泥結構。其中纖維素相當于鋼筋，半纖維素和果膠類物質則分別起到橋架在鋼筋間的鐵絲和水泥的作用。structural model of a cellulose microfibrill植物抗毒素的合成是植物的一種抗病機制，已表明同型多聚半乳糖醛酸片段能誘發(fā)組織合成植物抗毒素。誘發(fā)物(elicitor)包括真菌

23、細胞壁中的專一性寡聚葡萄糖苷和植物細胞壁中的同型多聚半乳糖醛酸。誘發(fā)物能改變受體細胞的代謝及與抗毒素合成有關的mrna和酶的從頭合成。l用酸水解從真菌大雄疫霉(phytopathora megasperma)菌絲細胞壁得到幾百種七聚葡糖，從中只分離出一種具誘發(fā)物活性的寡糖，可見作為誘發(fā)物必須具有很專一的結構。l機械損傷誘導植物形成一系列的蛋白質類的抑制劑，它們能夠抑制昆蟲和微生物的蛋白水解酶，并使得昆蟲和微生物難于消化植物材料，從而起到保護的作用。l在一些植物中發(fā)現(xiàn)了能誘導遠離損傷部位的組織合成蛋白酶抑制劑的信號，即蛋白酶抑制劑誘導因子(piif)。從蕃茄葉片中抽提的piif主要由-4-連接的

24、半乳糖醛酸殘基組成。l某些傷害細胞的非生物因素引起植物累積植物抗毒素，例如適度的凍融、紫 外線照射等，它們可能通過活化細胞中的酶，從胞壁中釋放內源誘發(fā)物，從而誘發(fā)抗毒素的累積。l寡糖片段可能與植物病理中的過敏死亡現(xiàn)象有關。l懸浮培養(yǎng)的假挪威槭和玉米細胞初生壁經部分酸水解分離得出一些活性片段，它們抑制蛋白質的合成。入侵的病原菌分泌的酶可能從植物細胞壁解離下毒性片段引起細胞的過敏死亡，使得病原物不能進一步散。l稻瘟病菌能分泌一種酶，本身能引起植物細胞死亡，此酶的作用機制可能是從細胞壁中釋放寡糖素引起細胞的死亡。l木葡聚糖的寡糖片段抑制2，4d誘導的豌豆上胚軸生長。此片段是假挪威槭細胞外多糖經內切1，4葡萄糖苷酶處理后制得的。l寡糖產物經分離得到已知結構的七糖和九糖。九糖有抑制活力，而七糖沒有。九糖的抑制活性表現(xiàn)出明顯的最適濃度曲線，排除了它對豌豆組織具毒性的可能性，抑制生長的九糖濃度只需能促進最大伸長生長的2，4d濃度的1%。 l植物的成花是由許多環(huán)境因素控制的復雜過程。植物中可能有促進成花和抑制成