細(xì)胞生長(zhǎng)曲線（精編版）

1、word 格式專業(yè)資料整理一細(xì)胞生長(zhǎng)曲線：a、目的：學(xué)習(xí)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定方法，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)基本規(guī)律。b、背景知識(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線是觀察細(xì)胞生長(zhǎng)基本規(guī)律的重要方法。只有具備自身穩(wěn)定生長(zhǎng)特性的細(xì)胞才適合在觀察細(xì)胞生長(zhǎng)變化的實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用。因而在細(xì)胞系細(xì)胞和非建系細(xì)胞生長(zhǎng)特性觀察中，生長(zhǎng)曲線的測(cè)定是最為基本的指標(biāo)。原理（選填項(xiàng)目）：細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定一般可利用細(xì)胞計(jì)數(shù)法進(jìn)行。c、材料（一）儀器1.凈化工作臺(tái)2.離心機(jī)3.恒溫水浴箱4.冰箱（ 4、 -20 ）5.倒置相差顯微鏡6.培養(yǎng)箱（ 37、 5%co2 、飽和濕度）（二）玻璃器皿1.吸管（彎頭）2.培養(yǎng)瓶3.玻璃瓶（ 250ml、100ml）4.廢液

2、缸（三）塑料器皿1.吸頭2.槍頭3. 24 培養(yǎng)板4.膠塞（四）其他物品1.微量加樣槍word 格式專業(yè)資料整理2.紅血球計(jì)數(shù)板（五）試劑1. d-hanks 液2.小牛血清3. rpmi1640 4.雙抗（青霉素、鏈霉素）5. 0.08%胰酶（四）、操作步驟1.取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，采用一般傳代方法進(jìn)行消化，制成細(xì)胞懸液；2. 計(jì)數(shù)，精確地將細(xì)胞分別接種于2130 個(gè)大小一致的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)或培養(yǎng)孔（以24 孔培養(yǎng)板為宜），每瓶或孔細(xì)胞總數(shù)要求一致，加入培養(yǎng)液的量也要一致。3. 每天或每隔一天取出3 瓶（孔）細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算均值。培養(yǎng)35d 常要給未計(jì)數(shù)的細(xì)胞換液。4.以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸，細(xì)胞數(shù)為

3、縱軸（對(duì)數(shù)），描繪在半對(duì)數(shù)座標(biāo)紙上，連接成曲線后即成該細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。9 （五）、注意事項(xiàng)1細(xì)胞生長(zhǎng)曲線雖然最為常用，但有時(shí)其反映數(shù)值不夠精確，可有2030% 的誤差，需結(jié)合其它指標(biāo)進(jìn)行分析。2現(xiàn)在很多實(shí)驗(yàn)室利用培養(yǎng)板采用mtt法進(jìn)行生長(zhǎng)曲線測(cè)定，較為簡(jiǎn)便。3標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線近似“s”形，一般在傳代后第一天細(xì)胞數(shù)有所減少，再經(jīng)過(guò)幾天的潛伏適應(yīng)期，然后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，達(dá)到平臺(tái)期后生長(zhǎng)穩(wěn)定，最后到達(dá)衰老。4在生長(zhǎng)曲線上細(xì)胞數(shù)量增加1 倍時(shí)間稱為細(xì)胞倍增時(shí)間，可以從曲線上換算出。二、四唑鹽試驗(yàn)（ mtt）比色試驗(yàn)（一）、目的學(xué)習(xí)四唑鹽比色試驗(yàn)，檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)情況。word 格式專業(yè)資料整理（二

4、）、原理和背景。四唑鹽是一種能接受氫原子的染料，簡(jiǎn)稱mtt ?；罴?xì)胞的線粒體中的琥珀脫氫酶能使外源性的 mtt還原為難溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶物并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。二甲基亞砜能溶解細(xì)胞中的紫色結(jié)晶物，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，可間接反映細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，mtt結(jié)晶物形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。（三）、材料a、儀器1. 凈化工作臺(tái)2. 離心機(jī)3. 恒溫水浴箱4. 冰箱（ 4）5. 倒置相差顯微鏡6.co2培養(yǎng)箱7. 振蕩混合儀8. 酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀9. 移液槍10. 電磁力攪拌機(jī)11. 微孔濾器b、玻璃器皿1.吸管2.小燒杯（ 100ml）3.廢液缸c、塑料器

5、皿1.吸頭2.槍頭3. 96 孔培養(yǎng)板4. 15ml 離心管5.50ml 離心管word 格式專業(yè)資料整理6.膠塞d、其他物品1.微量加樣槍2.紅血球計(jì)數(shù)板f、試劑1. d-hanks 液2.小牛血清3. rpmi1640 4.雙抗（青霉素、鏈霉素）5. 0.08%胰酶6.二甲基亞砜（ dmso ）7. mtt溶液：稱取250mgmtt ，放入小燒杯中，加50ml 培養(yǎng)液或平衡鹽溶液在電磁力攪拌機(jī)上攪拌 30min，用 0.22um 的微孔濾器除菌，分裝，4保存?zhèn)溆?，兩周?nèi)有效。（四）、操作步驟1.接種細(xì)胞：用0.08%胰蛋白酶消化單層培養(yǎng)細(xì)胞，用含10% 胎牛血清的rpmi1640培養(yǎng)液配成

6、單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔103104 個(gè)細(xì)胞接種于96 孔培養(yǎng)板中，每孔體積200ul 。2.培養(yǎng)細(xì)胞：將培養(yǎng)板移入co2孵箱中，在37、 5%co2 及飽和濕度條件下培養(yǎng)。（培養(yǎng)時(shí)間取決于實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵螅?.呈色：每孔加入mtt溶液（ 5mg/ml）20ul ，37孵箱中繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。對(duì)于懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞，需離心（1000rpm，5min），然后棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入150uldmso ，振蕩 10min，使結(jié)晶物充分溶解。4.比色：選擇490nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值，記錄結(jié)果。以時(shí)間為橫軸，光吸收值為終軸繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。（五）、注意事項(xiàng)1

7、選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞接種濃度。在進(jìn)行 mtt試驗(yàn)前，對(duì)每一種細(xì)胞都應(yīng)測(cè)其貼壁率、倍增時(shí)間以及不同接種細(xì)胞數(shù)條件下的生長(zhǎng)曲線，然后確定試驗(yàn)中每孔的接種細(xì)胞數(shù)和培養(yǎng)時(shí)間。2避免血清干擾，一般選小于10% 胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行試驗(yàn)。word 格式專業(yè)資料整理3設(shè)空白對(duì)照，與試驗(yàn)平行設(shè)不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對(duì)照孔。最后比色時(shí)，以空白孔調(diào)零。四唑藍(lán) (mtt)法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線及生長(zhǎng)速度：mtt法繪制3 組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，分別將細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)液配制成單細(xì)胞懸液, 計(jì)數(shù)后接種于96 孔板 (1 104)/ 孔，設(shè)立空白組培養(yǎng)7d, 每天每組細(xì)胞各取6 孔, 每孔加入 mtt溶液 0.5g/l,37繼續(xù)培養(yǎng)4