白血病免疫分型講課最終本實(shí)用教案

1、 正常血細(xì)胞從多能干細(xì)胞分化、發(fā)育、成熟為功能細(xì)胞的過程中，細(xì)胞膜、細(xì)胞漿或胞核抗原的出現(xiàn)、表達(dá)增多與減少甚至消失與血細(xì)胞的分化發(fā)育階段密切相關(guān)，而且表現(xiàn)出與細(xì)胞系列及其分化程度相關(guān)的特異性。因此，這些抗原的表達(dá)與否可作為鑒別和分類血細(xì)胞的基礎(chǔ)。 白血病是造血系統(tǒng)的惡性腫瘤，在形態(tài)上變化雖相當(dāng)大，但仍能表達(dá)正常血細(xì)胞所具有的抗原，因而仍可依據(jù)其抗原的表達(dá)譜對白血病進(jìn)行免疫(miny)分型。由于白血病細(xì)胞具有腫瘤細(xì)胞的特征，其抗原表達(dá)又不完全同于正常血細(xì)胞，常可出現(xiàn)某些抗原缺乏、過度表達(dá)、系列交叉表達(dá)某一系列或階段不應(yīng)有的抗原，這又增加了白血病免疫(miny)分型的復(fù)雜性。白血病/淋巴瘤的免疫(

2、miny)分型已成為診斷血液惡性腫瘤不可缺少的重要標(biāo)準(zhǔn)之一。第1頁/共32頁第一頁，共33頁。早 年 曾 用 過 的 熒 光 顯 微 鏡 或 A P A A P 方 法 基 本 被 廢 棄 。 國 際 上 公 認(rèn) 的 通 用 的 方 法 是 流 式 細(xì) 胞 術(shù) （ F C M ） 。 流 式 細(xì) 胞 術(shù) （ F C M ） 白 血 病 免 疫 分 型 是 利 用 熒 光 素 標(biāo) 記 的單 克 隆 抗 體 （ M c A b ） 作 分 子 探 針 ， 多 參 數(shù) 分 析 白 血 病 細(xì) 胞 的 細(xì) 胞 膜 和 細(xì) 胞 漿 或 細(xì) 胞 核 的 免 疫 表 型 ， 由 此 了 解 被 測 白 血

3、病 細(xì) 胞 所 屬 細(xì) 胞 系 列 及 其 分 化 程 度 。 因 為F C M 能 快 速 ， 多 參 數(shù) ， 客 觀 的 定 性 又 定 量 測 定 細(xì) 胞 膜 ， 漿 ， 核 的 抗 原 表 達(dá) 。另 一 個 重 要 理 由 是 至 今 尚 未 發(fā) 現(xiàn) 白 血 病 / 淋 巴 瘤 的 特 異 抗 原 。 所 以 能 用 正 常 血 細(xì) 胞 的 單 抗 來 進(jìn) 行 免 疫 分 型 是 基 于 白 血 病 形 成 的 分 化 阻 斷 學(xué) 說 即 白 血 病 細(xì) 胞 基 因 異 常 ，分 化 受 阻 于 某 階 段 形 成 不 同 亞 型 的 白 血 病 。 這 群 細(xì) 胞 充 盈 于 骨 髓

4、 。 抗 原 表 達(dá) 與 其 相 應(yīng) 系 列 / 階 段 的 血 細(xì) 胞 無 明 顯 差 異 。 與 形 態(tài) 學(xué) 檢 查 ( j i n c h ) 相 似 僅 能 根 據(jù) 數(shù) 量 的差 異 來 判 斷 病 變 細(xì) 胞 的 屬 性 。第2頁/共32頁第二頁，共33頁。 單參數(shù)免疫標(biāo)志測定易將正常細(xì)胞包括在內(nèi)。因此，近年來主張用設(shè)門（gating）方法。即用CD45與側(cè)向角（side scatter,SSC），對數(shù)取樣后可將骨髓細(xì)胞清晰地分出淋巴細(xì)胞，單核細(xì)胞，成熟粒細(xì)胞，幼稚細(xì)胞和紅細(xì)胞群，其理論依據(jù)是CD45是所有白細(xì)胞的抗原。其表達(dá)量在淋巴細(xì)胞最高，單核細(xì)胞，成熟粒細(xì)胞，早期造血細(xì)胞（bl

5、asts）依次減弱。紅細(xì)胞（中，晚幼紅細(xì)胞，成熟紅細(xì)胞）不表達(dá)CD45。SSC反映細(xì)胞的顆粒性，成熟粒細(xì)胞SSC最高，依次為單核細(xì)胞，淋巴細(xì)胞，blasts，紅細(xì)胞。以CD45/SSC雙參數(shù)，對數(shù)取樣時即可把各細(xì)胞群區(qū)分出來(ch li)。若同時加上一個，二個甚或三個熒光標(biāo)記的單抗，則很容易識別非正常細(xì)胞群所表達(dá)的抗原。這樣可以排除正常細(xì)胞的干擾。在幼稚細(xì)胞低的情況下或檢測殘存白血病時尤為必要 FCM分析白血病免疫表型時，測量細(xì)胞數(shù)量一般在1000050000細(xì)胞之間，而且快速、特異、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，能區(qū)分細(xì)胞起源、劃分其分化發(fā)育階段等，對白血病的診斷與分型、治療方案選擇與預(yù)后判斷、發(fā)病機(jī)理研

6、究等有重要價值。 第3頁/共32頁第三頁，共33頁。 一 白細(xì)胞分化抗原 白細(xì)胞分化抗原（leukocyte differentiation antigen，LDA）指血細(xì)胞在分化成熟(chngsh)為不同譜系（lineage） 、分化的不同階段及細(xì)胞活化過程中，出現(xiàn)或消失的細(xì)胞表面標(biāo)記。 它們大都為跨膜分子，由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞漿區(qū)組成；有些以糖基磷脂酰肌醇（GPI）“錨”在細(xì)胞膜上； 它們大都是蛋白或糖蛋白，少數(shù)為碳水化合物第4頁/共32頁第四頁，共33頁。 二 CD的概念、CD分子的分 類、功能(gngnng)及應(yīng)用 CD：用以單克隆抗體鑒定為主的聚類分析法，將來自不同實(shí)驗(yàn)室的單克隆抗體

7、所識別的同一分化抗原歸為一個分化群（Cluster of differentiation，CD）。并以此(y c)代替分化抗原以往的命名。 在許多情況下，單克隆抗體及其識別的相應(yīng)抗原都用同一個CD序號。 迄今為止，人CD分子的序號已從CD1命名至CD371，可大致劃分為14個組。第5頁/共32頁第五頁，共33頁。第6頁/共32頁第六頁，共33頁。 CD分子的功能： （1）免疫應(yīng)答過程中參與免疫細(xì)胞的相互識別；免疫細(xì)胞識別抗原(kngyun)、活化、增殖和分化；免疫效應(yīng)功能的發(fā)揮； （2）參與造血細(xì)胞的分化和造血過程的調(diào)控； （3）參與炎癥的發(fā)生； （4）參與細(xì)胞的遷移如腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移等。第7頁

8、/共32頁第七頁，共33頁。 CD分子(fnz)的臨床應(yīng)用 CD單克隆抗體可用于 （1）闡明某些疾病的發(fā)病機(jī)制； （2）廣泛應(yīng)用于多種疾病的免疫診斷； （3）治療移植排斥反應(yīng)和腫瘤等疾??；第8頁/共32頁第八頁，共33頁。第9頁/共32頁第九頁，共33頁。第10頁/共32頁第十頁，共33頁。 CD20分子(fnz) 結(jié)構(gòu)與分布：單鏈跨膜蛋白，僅表達(dá)于B細(xì)胞(xbo)， 早期即表達(dá)，分化為漿細(xì)胞(xbo)后消失 功能： （1）參與和調(diào)節(jié)B細(xì)胞(xbo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、生長和分化。 （2）直接參與調(diào)節(jié)跨膜Ca2+的流動。第11頁/共32頁第十一頁，共33頁。 三 免疫(miny)分型常用的免疫(miny

9、)標(biāo)志及其意義 第12頁/共32頁第十二頁，共33頁。 白血病系列(xli)分化抗原 T淋巴細(xì)胞白血?。篊D3、CD5、CD7。 B淋巴細(xì)胞白血病：CD10、CD19、CD22。 NK淋巴細(xì)胞白血病：CD16、CD56、CD57。 髓系白血病：CD13、CD14、CD33、MPO（髓過氧化物(u yn hu w)酶）。 紅白血?。篏lyA（血型糖蛋白A）。 巨核細(xì)胞白血?。篊D41、CD42、CD61。 第13頁/共32頁第十三頁，共33頁。 白血病系列(xli)非特異性抗原 CD34、HLADR為早期細(xì)胞抗原(kngyun)，無系列特異性，可與CD38聯(lián)合運(yùn)用于免疫分型。一般而言，干/祖細(xì)胞

10、CD34、HLADR、CD38，原始細(xì)胞CD34、HLADR、CD38，而幼稚細(xì)胞（如早幼粒細(xì)胞）CD34、HLADR、CD38。第14頁/共32頁第十四頁，共33頁。 白血病分化階段(jidun)抗原 T細(xì)胞(xbo)抗原：CD4、CD8。 B細(xì)胞(xbo)抗原：CD10、Cy（胞漿鏈）、SmIg（表面膜免疫球蛋白）、CD38和CyIg （胞漿免疫球蛋白）、CD11C。第15頁/共32頁第十五頁，共33頁。 白細(xì)胞共同(gngtng)抗原 CD45為白細(xì)胞共同抗原，但原幼細(xì)胞表達(dá)量比成熟淋巴細(xì)胞低，幼紅細(xì)胞不表達(dá)。用SSC/CD45 PerCP雙參數(shù)(cnsh)分析可十分容易鑒別骨髓和血液中

11、的原始或成熟細(xì)胞。用兩個系列或階段特異性McAb加CD45進(jìn)行三色免疫熒光染色，經(jīng)FSC、SSC、McAbl-FITC、McAb2-PE、CD45 PerCP五參數(shù)(cnsh)分析，可特異地分析原幼白血病細(xì)胞的免疫表型而不受成熟細(xì)胞的干擾。第16頁/共32頁第十六頁，共33頁。 四 白血病免疫(miny)分型 急性( jxng)髓系細(xì)胞白血病第17頁/共32頁第十七頁，共33頁。 MO Mo blasts 有低的SSC和FSC。在CD45SSC圖上出現(xiàn)在淋巴細(xì)胞位置上，至少表達(dá)(biod)一個特異性標(biāo)志如CD13或CD116，但MPO比CD13與CD33更靈敏。一般淋系標(biāo)志陰性，但也可表達(dá)(b

12、iod)CD7或CD4。 Mo blasts一般HLADR、CD34陽性，有些研究表明CD7與CD34共表達(dá)(biod)在AML且預(yù)后差。第18頁/共32頁第十八頁，共33頁。M 1 流 式 上 M 1 與 M 0 相 似 不 易 區(qū) 分 ， M 1 一 般 C D 1 3 、 C D 3 3 、 H L A D R ， 但 C D 3 4 表 達(dá) 少 于 M 0 ， 可 能 表 達(dá) 部 分 ( b f e n ) C D 1 5 。 M 2 M 2 與 M 1 要 區(qū) 別 是 成 熟 度 增 加 ， b l a s t s 減 少 ， C D 1 5 較 M 1 較 顯 著 ， C D 3

13、4 弱 于 M 1 ， C D 1 3 有 時 表 達(dá) 強(qiáng) 于 C D 3 3 ， 多 數(shù) 病 例 H L A D R （ - ） 。 C D 4 5 S S C 圖 顯 示 從 髓 系 b l a s t區(qū) 至 成 熟 骨 髓 細(xì) 胞 區(qū) 的 連 續(xù) 細(xì) 胞 帶 ， C D 4 5 S S C 圖 有 助 于 確 定 b l a s t s 比 例 。第19頁/共32頁第十九頁，共33頁。 M3 高顆粒性，具較高的SSC，但CD45較成熟細(xì)胞少，多數(shù)情況(qngkung)HLADR（-）或表達(dá)減少，CD34少于M2、一般CD13弱（），可有CD2表達(dá)。第20頁/共32頁第二十頁，共33頁。

14、M4與M5 兩型表型相似，但M4較M5表達(dá)更多的CD34（），較之M0、M1，M4與M5有更大的FSS和SSC，CD45SSC圖上，成熟C出現(xiàn)在單核區(qū)，重要(zhngyo)的表型為CD13、CD33、HLADR、CD14和CD15，CD33可表達(dá)強(qiáng)于CD13，CD33（）、CD13（）、CD34（）很可能為M5，但只出現(xiàn)在少數(shù)病人中，部分M5可見CD56（）。第21頁/共32頁第二十一頁，共33頁。 M6 M6較少見且特征不明顯，一般HLADR，CD34、CD13、CD33陽性(yngxng)，CD45SSC圖顯示主要為紅系成份。 M7 巨核細(xì)胞白血病，在AML中少于1。一般CD61（Gpa）

15、和/或CD41（Gpb-a）陽性(yngxng)，而注意由于血小板粘附在blasts上造成的假陽性(yngxng)，可以用流式雙色分析在EDTA存在下，測pb/a與CD34以減少激活血小板的粘附。第22頁/共32頁第二十二頁，共33頁。 急性(jxng)淋巴細(xì)胞白血病 ALL是兒童中最常見(chn jin)的惡性腫瘤，約占全部腫瘤的25，在成人，ALL約占急性白血病的25，我們將ALL分為B祖細(xì)胞型，CD10或CD10，前B細(xì)胞型，B細(xì)胞型，T細(xì)胞型第23頁/共32頁第二十三頁，共33頁。 B祖細(xì)胞型ALL：在幼兒約占ALL的6570，青少年為5560，人為50。在兒童，約90病例CD10，在

16、幼兒只有少于50病例CD10，blasts一般FSC、SSC很少，是FAB標(biāo)準(zhǔn)的L1或L2，一般TdT(+)HLA-DR(+)，CD19(+)，此型又分為2個亞型，CD10和CD10，前者預(yù)后好，多數(shù)(dush)病例CD24，CD34，CD20表達(dá)隨成熟度增加而增加，B祖細(xì)胞被定義為sIg-。第24頁/共32頁第二十四頁，共33頁。 前B細(xì)胞型ALL：此亞型約占兒童ALL的25，細(xì)胞一般為CD19，CD24，HLADR，胞漿CD22，CD10，TdT隨CD20變化，CD34多為陰性，前B亞型被認(rèn)為比B祖型預(yù)后更差，這與t(1；19)出現(xiàn)相關(guān)并由此產(chǎn)生E2APBX1融合蛋白，它的表型為CD19、

17、CD10、CD9，不同(b tn)程度CD20表達(dá)，CD34，確認(rèn)此表型有助于診斷基因上不確定的病例。第25頁/共32頁第二十五頁，共33頁。 B細(xì)胞(xbo)型ALL：成熟B細(xì)胞(xbo)型ALL約占ALL25，B細(xì)胞(xbo)型ALL較之B祖細(xì)胞(xbo)型ALL有更大的FSC和SSC，在CD45SSC圖上出現(xiàn)在淋巴和單核細(xì)胞(xbo)區(qū)域，即FAB標(biāo)準(zhǔn)的L3，表型為CD19、CD20、CD22、CD24且sIg（多數(shù)為IGM）多數(shù)病例CD10。但成熟抗原及sIg使之區(qū)別于更早的B系A(chǔ)LL，極少數(shù)成熟B細(xì)胞(xbo)ALL無FABL3形態(tài)。第26頁/共32頁第二十六頁，共33頁。 T-AL

18、L：多數(shù)病例有大的FSC、SSC，在CD45SSC圖上可能出現(xiàn)在淋系未成熟細(xì)胞和髓系未成熟細(xì)胞或單核細(xì)胞區(qū)，多數(shù)表現(xiàn)為胸腺亞型，最常見亞型為皮質(zhì)晚期表達(dá)，CD1、CD2、CD5、CD7、CD4/CD8雙陽與極少膜表面CD3、TdT多為陽性。另一常見亞型為皮質(zhì)早期表達(dá)CD2、CD5、CD7、TdT強(qiáng)表達(dá)。髓質(zhì)期亞型表達(dá)CD2、CD5、CD7、與CD3CD4/CD3+CD8+,很少見TdT表達(dá)。前T細(xì)胞亞型，表達(dá)CD7胞漿CD3且無其它(qt)T細(xì)胞抗原，T細(xì)胞腫瘤的特征是喪失T細(xì)胞抗原而表現(xiàn)出其它(qt)異常抗原組合。第27頁/共32頁第二十七頁，共33頁。 雜合型白血?。弘S著流式技術(shù)的廣泛應(yīng)用

19、，我們(w men)發(fā)現(xiàn)許多病例并不能嚴(yán)格劃分為淋系或髓系，真正的雙表型病人多為t(9；22)或（11q23），現(xiàn)在雜合型的誤診率很高。最常導(dǎo)致誤診的原因是在分析中未能排除非白細(xì)胞，過度強(qiáng)調(diào)弱的非特異性結(jié)合，忽略了某些抗體缺乏系特異性，最重要的系特異性抗原在B系、T系、髓系分別為CD22、CD3和MPO。第28頁/共32頁第二十八頁，共33頁。 慢性(mn xng)粒細(xì)胞白血病 由于慢性期顯著的細(xì)胞分化，在CD45SSC圖上除了(ch le)髓系細(xì)胞占主導(dǎo)外，只顯示一個正常骨髓像，CML可確診，CML起病與發(fā)展相對緩慢，慢性期的持續(xù)1年左右最終發(fā)展為加速期和急變期。流式細(xì)胞技術(shù)對急變期亞型的診斷具有極高價值。直接影響到治療效果。 急變期CML主要表現(xiàn)為髓系，偶為淋系，髓性急變可表現(xiàn)出多種形態(tài)包括未分化細(xì)胞。淋性急變具典型形態(tài)特征，為CD10B祖細(xì)胞ALL極少有T細(xì)胞型ALL。第29頁/共32