三葉木通的組織培養(yǎng)和多倍體誘導(dǎo)

1、三葉木通的組織培養(yǎng)和多倍體誘導(dǎo)三葉木通 Akebia trifoliate （Thunb. ） Koidz. 為木通 科木通屬藤本植物，全株均可入藥，具有通經(jīng)下乳、清熱利尿等 功效，主要分布于甘肅、貴州、河北、河南、山東等地 1 。三 葉木通果實(shí)具有發(fā)達(dá)的胎座組織，味甜可口，具有獨(dú)特的風(fēng)味， 含有許多人體必需營(yíng)養(yǎng)成分 2-3 ，是一種具有開(kāi)發(fā)潛力的保健 水果，但存在果皮厚、種子多、可食率低的問(wèn)題。多倍體植株具 有生物產(chǎn)量增加、藥用活性成分增加、抗逆性增強(qiáng)、植株育性下 降、少籽或無(wú)籽等特點(diǎn)， 多倍體育種可成為三葉木通遺傳改良的 途徑之一。植物離體誘導(dǎo)多倍體的方法已成功地在許多植物中取 得成功，

2、其中建立組培快繁體系是其必要環(huán)節(jié)。 本試驗(yàn)旨在以三 葉木通幼嫩種子為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)獲得叢生芽， 再用秋水仙 素對(duì)叢生芽進(jìn)行處理， 以獲得三葉木通多倍體材料， 為無(wú)籽三葉 木通的研究奠定基礎(chǔ)。1 材料與方法1.1 材料三葉木通果實(shí)采自貴州省貴陽(yáng)市花溪區(qū)棉花關(guān)， 植株經(jīng)貴州 大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院趙財(cái)副教授鑒定為木通科木通屬植物三葉木 通。1.2 方法1.2.1 外植體處理 2014年 8月中旬摘取三葉木通幼嫩果實(shí)，毛刷刷去表面塵土f洗潔精浸泡7 minf自來(lái)水沖洗20 minf超凈工作臺(tái)中取出種子-無(wú)菌水清洗種子數(shù)次-濾紙吸干表面水分f 75尤醇消毒15 s f 0.1% HgCI2浸泡7 min

3、 f無(wú)菌水沖洗 3次。將消毒好的種子橫切成半、沿背腹線縱切成半，以不切作對(duì)照處理，然后分別接種到MS培養(yǎng)基（添加蔗糖30 g/L、瓊脂7 g/L , pH值5.86.0，下同）中。每個(gè)處理接種 20個(gè)培養(yǎng)瓶，每瓶4 粒種子。（25± 2） C黑暗培養(yǎng)40 d，統(tǒng)計(jì)出苗情況。1.2.2 無(wú)菌苗誘導(dǎo)培養(yǎng)采用合適的切種方式，將消毒好的種子接種在含 6-BA 不同濃度（0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L） 的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行無(wú)菌苗誘導(dǎo)， 每個(gè)處理接種10個(gè)培養(yǎng)瓶，每 瓶放5粒種子。（25± 2） C黑暗培養(yǎng)30 d后，統(tǒng)計(jì)6-BA不同 濃度處理下出苗率（出苗率 =

4、萌發(fā)外植體數(shù) /接種外植體數(shù)x 100%。1.2.3繼代增殖培養(yǎng)以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，設(shè)置不同激素組合的處理，共8種培養(yǎng)基（見(jiàn)表1中A1A8號(hào)培養(yǎng)基）。 將無(wú)菌苗接種于這些培養(yǎng)基中，每種培養(yǎng)基接種 10瓶，每瓶 3 個(gè)外植體。（25±2） C光照培養(yǎng)（光照時(shí)間12 h/d，光照度1 000 Ix ）45 d 統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)。表1 繼代增殖培養(yǎng)基編號(hào)培養(yǎng)基 A1MS+0mg/L 6-BA+0.0 mg/L NAAA2MS+0.0mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAAA3MS+1.0mg/L 6-BA+0.0 mg/L NAAA4MS+1.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L

5、 NAA A5MS+2.0 mg/L 6-BA+0.0 mg/L NAAA6MS+2.0mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAAA7MS+3.0mg/L 6-BA+0.0 mg/LNAA A8MS+3.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA1.2.4 多倍體誘導(dǎo)將生長(zhǎng)良好的幼嫩叢生芽接入抽濾滅菌的 秋水仙素溶液中， 搖床振蕩培養(yǎng)。 試驗(yàn)采用 2 因素 3 水平 L9（32） 正交試驗(yàn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)， 試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表 2。搖床轉(zhuǎn)速設(shè)定為 50 r/min ， 培養(yǎng)溫度設(shè)定為24 C,光照24 h/d，光照強(qiáng)度為1 000 lx。 處理完畢后轉(zhuǎn)接于 MS+2.0 mg/L 6-BA+0.3

6、mg/L NAA 的培養(yǎng)基中 培養(yǎng)。培養(yǎng)條件同上。1.2.5 多倍體鑒定取出小叢生芽塊，放入卡諾氏固定液（無(wú) 水乙醇：冰乙酸體積比 3 : 1）中，0 C固定1周后，將小叢 生芽塊取出放到載破片上，用鑷子搗碎小叢生芽塊，用改良'寶品紅染色液染色12 min，蓋上蓋破片后在光學(xué)顯微鏡 下觀察，拍照。根據(jù)染色體數(shù)確定加倍處理材料的倍性。2 結(jié)果與分析2.1 切種方式對(duì)種子出苗的影響從表 3 可知，沿背腹線縱切成半的種子出苗率最高 （325%）， 橫切成半的次之，不切半的種子出苗率最低（ 75%）；縱切成半 的種子平均出苗天數(shù)最短（ 15 d） ，不切半的種子平均出苗天數(shù) 最長(zhǎng)（35 d）o

7、表明縱切種子能加快種子出苗，其原因可能是縱 切處理使種子的胚暴露于培養(yǎng)基中， 胚無(wú)種皮限制而得以直接從 培養(yǎng)基中吸收養(yǎng)分而快速生長(zhǎng)； 橫切可能破壞了胚的完整性或沒(méi) 有使胚完全暴露于培養(yǎng)基中而對(duì)種子出苗沒(méi)有太大影響。2.26-BA 濃度對(duì)種子出苗的影響消毒好的種子沿背腹線縱切成半，接種于培養(yǎng)基中，培養(yǎng)15 d左右種子便開(kāi)始萌發(fā)，繼續(xù)培養(yǎng)15 d后無(wú)菌苗高度可達(dá)2 cm 左右（圖1）。由表4可知，MS培養(yǎng)基添加6-BA后能提高種子 出苗率。隨著 6-BA 濃度升高，種子出苗率呈先升高后下降的趨 勢(shì)。當(dāng)6-BA濃度為1.0 mg/L時(shí)出苗率最高，為 60%2.3 繼代增殖培養(yǎng)基篩選由表5可知，當(dāng)培養(yǎng)

8、基中不添加 6-BA時(shí)，NAA處理的無(wú)菌 苗增殖系數(shù)均為1;當(dāng)6-BA濃度一定時(shí)，添加0.3 mg/L NAA與 不添加NAA的相比，無(wú)菌苗增殖系數(shù)均有所提高；當(dāng)NAA濃度一定，隨著 6-BA 濃度升高，無(wú)菌苗增殖系數(shù)先上升后下降， 當(dāng) 6-BA 濃度為 2.0 mg/L 時(shí)無(wú)菌苗增殖系數(shù)最高（ 5.70）。無(wú)菌苗轉(zhuǎn)接 到增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時(shí)間后其基部可分化出白色的不定芽（圖 2）；對(duì)不定芽繼代增殖后，能得到數(shù)目眾多的叢生芽，這些叢生芽具有分化成完整植株的能力。2.4 秋水仙素對(duì)叢生芽多倍體誘導(dǎo)的影響秋水仙素濃度越低，叢生芽死亡率也越低（表 6）。 0.1%的 秋水仙素處理下的叢生芽死亡率低

9、，0.5%的秋水仙素處理過(guò)的叢生芽死亡率最高。 0.1%的秋水仙素處理的叢生芽雖然有較低的死 亡率， 但并未得到加倍的叢生芽； 0.5%的秋水仙素處理過(guò)的叢生 芽得到了 2 塊加倍的叢生芽； 0.3%的秋水仙素處理叢生芽后得到 加倍的叢生芽塊數(shù)最多，其中以處理 24 h 的效果較好，誘導(dǎo)率 為 12%。同一濃度的秋水仙素在不同時(shí)間處理下多倍體誘導(dǎo)率并 未呈現(xiàn)常見(jiàn)的先上升后下降趨勢(shì)， 其原因可能是高濃度的秋水仙 素對(duì)叢生芽的傷害大， 使得存活下來(lái)的叢生芽數(shù)減少， 并且生活 力下降，從而使檢測(cè)到加倍的叢生芽塊數(shù)相應(yīng)很少。2.5 多倍體鑒定對(duì)三葉木通正常的根尖和叢生芽進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)， 得出正常 的三

10、葉木通染色體數(shù)2n=2x=16，為二倍體（圖3）,這與熊大勝 等得出的結(jié)果 4 一致。成功加倍成多倍體的叢生芽染色體數(shù)為 2n=4x=32，為四倍體（圖4）。這說(shuō)明用秋水仙素誘導(dǎo)三葉木通 獲得多倍體的方法是有效的。3 結(jié)論與討論沈國(guó)林等以三葉木通葉片、 莖段為外植體進(jìn)行愈傷組織的誘 導(dǎo)，但污染率高 5 。本試驗(yàn)選用三葉木通幼嫩種子為外植體， 建立三葉木通組織培養(yǎng)體系。 選用幼嫩種子為外植體具有材料多（1個(gè)果實(shí)約有種子150200粒）、污染率低（幼嫩種子在果 實(shí)里處于一種相對(duì)無(wú)菌的環(huán)境）等優(yōu)勢(shì)。繼代增殖培養(yǎng)是組織培養(yǎng)的關(guān)鍵， 篩選合適的增殖培養(yǎng)基才 能達(dá)到離體快繁目的 6 。在無(wú)菌苗的繼代增殖過(guò)

11、程中， 6-BA 和 NAA組合是常用的激素組合7-8。在三葉木通無(wú)菌苗繼代增殖 培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)使用 NAA不能使無(wú)菌苗增殖，單獨(dú)使用 6-BA 可以使無(wú)菌苗增殖，附加 NAA后增殖系數(shù)提高，表明6-BA在三 葉木通繼代增殖培養(yǎng)中起主導(dǎo)作用。叢生芽結(jié)構(gòu)完整、材料幼嫩，可直接形成小植株，而且成苗 率高，經(jīng)化學(xué)誘變劑誘導(dǎo)處理后，易于獲得純的多倍體植株，所 以本試驗(yàn)采用了叢生芽作為誘導(dǎo)材料。 秋水仙素是常用的化學(xué)誘 變劑，通過(guò)抑制紡錘體微管的形成而導(dǎo)致染色體不能移向細(xì)胞兩 極從而產(chǎn)生多倍體。 秋水仙素對(duì)不同的植物和植物不同部位的誘 導(dǎo)所需要的濃度和處理時(shí)間不同。 三葉木通為木質(zhì)藤本， 對(duì)秋水 仙素

12、處理的濃度要求較高，在本試驗(yàn)中體現(xiàn)在 0.1%的秋水仙素 處理叢生芽 24、 48、 72 h 均未檢測(cè)到多倍體細(xì)胞。雖然較高濃 度秋水仙素處理過(guò)的叢生芽存活率小，但憑借其快速增殖的優(yōu) 勢(shì)，能獲得大量的加倍的叢生芽。三葉木通多倍體的研究國(guó)內(nèi)僅見(jiàn)熊大勝等用秋水仙素處理 種子和幼苗的報(bào)道 9-10 。熊大勝等對(duì)加倍誘導(dǎo)的材料只進(jìn)行了 生理學(xué)和形態(tài)學(xué)鑒定。目前流式細(xì)胞儀能用于鑒定植株的倍性 11-12 ，使得常規(guī)誘導(dǎo)多倍體方法有了可靠的鑒定方法。但組 培技術(shù)和化學(xué)誘導(dǎo)相結(jié)合的離體培養(yǎng)誘導(dǎo)法已成為一種最常用 的染色體加倍方法。離體培養(yǎng)誘導(dǎo)法與常規(guī)的誘變育種方法相 比，具有明顯的優(yōu)越性。 首先在組織培養(yǎng)條件下可以反復(fù)大批量