【】CBG糖脂代謝穩(wěn)態(tài)調(diào)控的分子機(jī)制

1、項(xiàng)目名稱：糖脂代謝穩(wěn)態(tài)調(diào)控的分子機(jī)制首席科學(xué)家：林圣彩 廈門大學(xué)起止年限：2011.1至2015.8依托部門：教育部二、預(yù)期目標(biāo)1. 總體目標(biāo) 確定機(jī)體和細(xì)胞在不同生理狀況和環(huán)境因素下維持糖脂代謝穩(wěn)態(tài)的分子機(jī)制，闡明在細(xì)胞生長和應(yīng)激反應(yīng)中起重要作用的調(diào)節(jié)因子調(diào)控細(xì)胞代謝的信號通路網(wǎng)絡(luò)，為糖脂代謝紊亂造成的肥胖、脂肪肝、糖尿病和癌癥的早期診斷和治療提供理論依據(jù)。 2. 五年預(yù)期目標(biāo) (1) 建立對實(shí)驗(yàn)動物代謝相關(guān)的生理生化指標(biāo)分析的技術(shù)平臺，發(fā)現(xiàn)相關(guān)基因敲 除或轉(zhuǎn)基因小鼠造成糖脂代謝紊亂的信號通路。 (2) 較系統(tǒng)地描述在逆境下機(jī)體和細(xì)胞調(diào)控糖脂代謝的分子網(wǎng)絡(luò)以及調(diào)控過程中關(guān)鍵蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)復(fù)合

2、體的動態(tài)調(diào)控機(jī)制。(3) 發(fā)現(xiàn)新的參與代謝調(diào)控的基因，為代謝性疾病和腫瘤的防治提供新的分子靶標(biāo)。 (4) 培養(yǎng)高質(zhì)量博士研究生20-30名，培養(yǎng)3-5名享有國際知名度的專家和 5-8名中青年學(xué)術(shù)帶頭人。 (5) 在國際重要刊物發(fā)表SCI論文15-25篇，其中爭取在Cell、Nature、Science或其子刊等影響因子10以上雜志發(fā)表研究論文5-10篇，申請發(fā)明專利3-5項(xiàng)。三、研究方案1. 總體研究方案 細(xì)胞能量代謝是細(xì)胞最基本、最重要的活動之一，與細(xì)胞的繁殖、分化、凋亡、運(yùn)動、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及多種重要疾病的發(fā)生密切相關(guān)，是生命科學(xué)的一個重要領(lǐng)域。細(xì)胞要通過能量感應(yīng)系統(tǒng)隨時(shí)監(jiān)測其能量水平狀態(tài)，在不

3、同的物質(zhì)和能量狀態(tài)下要不斷地通過細(xì)胞內(nèi)的代謝調(diào)控途徑來調(diào)節(jié)其代謝水平以達(dá)到一種穩(wěn)態(tài)。同時(shí)，細(xì)胞在面對內(nèi)外界一些不良因素時(shí)也會做出相應(yīng)的代謝變化，這些應(yīng)激反應(yīng)對細(xì)胞正常的生長和功能是極其重要的。如果這些應(yīng)激反應(yīng)失調(diào)，就會使細(xì)胞代謝發(fā)生異變，導(dǎo)致如前所述的多種人類重大疾病的發(fā)生。本項(xiàng)目的總體研究方案擬利用我們在蛋白質(zhì)科學(xué)、細(xì)胞代謝、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等研究領(lǐng)域的研究優(yōu)勢和技術(shù)手段，結(jié)合細(xì)胞生物學(xué)、動物生理學(xué)等學(xué)科的研究方法，集中力量多層次、多角度地研究與細(xì)胞代謝調(diào)控相關(guān)的信號通路網(wǎng)絡(luò)，分離和鑒定參與細(xì)胞代謝調(diào)控的新的基因和信號通路，探討各個信號通路之間的動態(tài)調(diào)控機(jī)制，并研究細(xì)胞異常代謝的信號通路，揭示代

4、謝異常與糖尿病、腫瘤等重大疾病的關(guān)系。項(xiàng)目總體研究方案如下圖1： 圖1. 項(xiàng)目總體研究方案2技術(shù)路線 由于代謝調(diào)控常常涉及多種組織、器官乃至整個機(jī)體，因此利用基因敲除小鼠模型來確證基因在代謝過程中的生理功能已成為“金標(biāo)準(zhǔn)”。本項(xiàng)目組已經(jīng)擁有或正在構(gòu)建各種基因敲除小鼠和轉(zhuǎn)基因小鼠模型，包括TNKS2、PTEN、CKIP-1、cideb、p53、Lkb1、Tip60基因敲除小鼠以及cidea轉(zhuǎn)基因小鼠。我們將利用這些小鼠模型，比較研究代謝調(diào)控在正常生理狀況以及不同內(nèi)外因素的刺激下細(xì)胞能量代謝的變化及其調(diào)控的信號通路網(wǎng)絡(luò)。同時(shí)，我們也將借助體外細(xì)胞培養(yǎng)，特別是比較研究正常細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞在低氧狀況下

5、和目前常規(guī)培養(yǎng)狀況下代謝調(diào)控的異同，并與機(jī)體內(nèi)生理?xiàng)l件下代謝調(diào)控的情況相比較，尋找適合代謝調(diào)控研究的細(xì)胞培養(yǎng)模型。在此基礎(chǔ)上驗(yàn)證從動物模型得到的結(jié)果，并在分子水平上進(jìn)一步深入研究影響細(xì)胞代謝的信號通路網(wǎng)絡(luò)和調(diào)控機(jī)制。此外，我們將通過酵母雙雜交、分子篩層析、免疫共沉淀和質(zhì)譜等等蛋白質(zhì)研究手段捕捉并鑒定與代謝調(diào)控相關(guān)的蛋白質(zhì)復(fù)合體及其組份，從而為闡明代謝調(diào)控中各種蛋白質(zhì)復(fù)合體的動態(tài)組裝奠定基礎(chǔ)。同時(shí)，利用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析來揭示各種蛋白質(zhì)復(fù)合體中蛋白質(zhì)的相互作用關(guān)系。故，項(xiàng)目的總體技術(shù)路線如圖2： 圖2. 項(xiàng)目的總體技術(shù)路線3. 創(chuàng)新與特色 本項(xiàng)目擬利用已有或正在進(jìn)行的各種基因敲除小鼠模型，在動物個體

6、的基礎(chǔ)上闡明代謝調(diào)控的機(jī)理和生理作用。同時(shí)，借助我們在脂質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、功能基因組學(xué)方面的研究基礎(chǔ)和優(yōu)勢，對調(diào)控糖脂代謝穩(wěn)態(tài)的分子機(jī)制進(jìn)行研究，探索細(xì)胞在不同逆境（低氧、缺氧、高脂等）下的代謝方式的轉(zhuǎn)變及其調(diào)控信號通路網(wǎng)絡(luò)的動態(tài)變化，特別是深入探討細(xì)胞生長和應(yīng)激反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子對細(xì)胞代謝的調(diào)控作用，將在分子水平、細(xì)胞水平以及動物個體水平上增進(jìn)我們對代謝調(diào)控以及異常代謝與細(xì)胞異常增殖之間的關(guān)系的認(rèn)識。為最終闡明細(xì)胞糖脂代謝穩(wěn)態(tài)調(diào)控的分子機(jī)制和相關(guān)重大疾病的防治提供理論基礎(chǔ)。4課題設(shè)置課題1 糖脂轉(zhuǎn)運(yùn)及其穩(wěn)態(tài)調(diào)控的的分子機(jī)制 研究內(nèi)容：細(xì)胞內(nèi)糖脂代謝的穩(wěn)態(tài)調(diào)控是維持細(xì)胞或機(jī)體基本生

7、命活動的基礎(chǔ)，糖脂代謝的紊亂與糖尿病、肥胖、脂肪肝、心血管疾病、細(xì)胞異常增殖以及癌癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。本課題將在分子、細(xì)胞和基因敲除小鼠水平上研究Axin、AMPK、TNKS2、PTEN、Cideb、Cidea等基因?qū)ζ咸烟寝D(zhuǎn)運(yùn)、脂肪合成和儲存、脂滴的形成等代謝途徑的調(diào)節(jié)作用及其與肥胖癥、脂肪肝和細(xì)胞異常增殖的關(guān)系。從細(xì)胞學(xué)的角度來看，肥胖的發(fā)生是由于脂肪細(xì)胞數(shù)量的增加以及脂肪細(xì)胞中脂滴變大兩個方面引起的。研究表明，伴隨著脂滴的變大，脂肪細(xì)胞變大，導(dǎo)致細(xì)胞炎癥因子分泌的變化，例如resistin、TNF和游離脂肪酸等分泌的增加，最終導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)胰島素抵抗和糖尿病的發(fā)生。因此，對脂滴的形成過程

8、的研究，不僅有助于我們了解脂滴的生物學(xué)功能，而且對肥胖及肥胖引起的其它代謝綜合癥疾病，有深遠(yuǎn)意義。課題1擬開展以下幾個方面的研究： 1. 糖代謝的穩(wěn)態(tài)調(diào)控 通過前期工作，我們發(fā)現(xiàn)Axin和AMPKb能相互作用并增強(qiáng)AMPK響應(yīng)能量缺失的刺激，即AMPK的第172位蘇氨酸的磷酸化。Axin敲低的細(xì)胞在受到低糖刺激的情況下，AMPKa的第172位蘇氨酸的磷酸化水平增加幅度與正常細(xì)胞相比大幅降低。這表明Axin是應(yīng)對糖穩(wěn)態(tài)變化的重要因子，且在AMPK活性調(diào)控的過程中扮演了重要角色。我們擬進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)，深入闡明Axin、AMPK和糖穩(wěn)態(tài)調(diào)控的關(guān)系： (1) 研究Axin調(diào)控AMPK活性的分子機(jī)制 研究

9、Axin調(diào)節(jié)AMPK的激活是通過影響AMPK上游激酶與AMPK的相互作用還是影響了AMPK三個亞基之間的相互作用。 (2) 應(yīng)用小鼠模型研究Axin缺失或突變導(dǎo)致的AMPK活性的變化 利用腺病毒感染系統(tǒng)特異性地敲低小鼠肝臟或肌肉中的Axin，或利用條件性基因敲除技術(shù)敲除小鼠肝臟或肌中的Axin，對這些小鼠施以饑餓等影響能量水平的刺激，觀察動物體內(nèi)AMPK活性的變化。 (3) 應(yīng)用小鼠模型研究Axin缺失或突變導(dǎo)致的糖穩(wěn)態(tài)平衡的改變 對上述小鼠進(jìn)行糖代謝相關(guān)生化指標(biāo)的測定以及AMPK參與糖代謝相關(guān)基因的表達(dá)水平的檢測。 (4) 研究Aurora在Axin調(diào)控AMPK活性中的作用 Aurora是在

10、生長中起重要作用的激酶，能調(diào)控Axin在中心粒上的定位，因此，我們擬研究Aurora是否在Axin調(diào)控AMPK活性中也起作用。 2. 研究葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和脂肪細(xì)胞生成的分子機(jī)制以及糖脂代謝異常與肥胖和胰島素抵抗的關(guān)系 (1) 研究Axin和TNKS2對葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)節(jié)機(jī)理 我們通過酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Axin能與TNKS2相互作用；TNKS2與Kif3a之間相互作用；Axin與Kif3a之間也存在相互作用。Kif3是由Kif3a、Kif3b和KAP3構(gòu)成的異源三聚體。它是一種依賴于微管的馬達(dá)動力蛋白質(zhì)復(fù)合體，可以向微管正極定向移動，在細(xì)胞內(nèi)承擔(dān)膜性細(xì)胞器或生物大分子復(fù)合物的運(yùn)輸功能。已有的研究表明在

11、3T3-L1脂肪細(xì)胞中Kif3參與胰島素調(diào)節(jié)的Glut4向細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)。TNKS2與GSV (Glut4 storage vesicle)上的IRAP有相互作用。我們將通過免疫熒光實(shí)驗(yàn)確定Kif3a、TNKS2、Axin和Glut4之間是否有共定位，而且在胰島素刺激下是否有向細(xì)胞膜共轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象。同時(shí)，我們將用siRNA 干擾C2C12細(xì)胞中TNKS2、Axin及Kif3a的表達(dá)，觀察細(xì)胞對胰島素刺激下葡萄糖吸收的反應(yīng)。另外，用TNKS2抑制劑XAV939（由廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院沈月毛教授合成）刺激C2C12細(xì)胞，觀察該抑制劑是否能降低胰島素刺激引起的葡萄糖的吸收。通過上述實(shí)驗(yàn)我們將證明Kif3

12、a、TNKS2、Axin是否通過形成復(fù)合體來調(diào)控胰島素刺激的Glut4的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而調(diào)節(jié)葡萄糖的吸收。 (2) 分離TNKS2的新的蛋白質(zhì)復(fù)合體 為了更全面的找到以TNKS2為核心的調(diào)節(jié)糖脂代謝的分子網(wǎng)絡(luò)，我們擬構(gòu)建TNKS2不同片段的餌，使其覆蓋TNKS2全蛋白質(zhì)序列，進(jìn)行大規(guī)模的酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)。另一方面，我們擬以小鼠的肌肉、脂肪組織為原料，采用以高效液相色譜為核心的生化分離手段結(jié)合蛋白質(zhì)譜分析技術(shù)，分離鑒定出不同生理水平下TNKS2復(fù)合體中的蛋白質(zhì)組份，并用免疫共沉淀、免疫熒光共定位及 GST- pulldown等方法進(jìn)一步驗(yàn)證這些蛋白質(zhì)與TNKS2的相互作用。 (3) 研究TNKS2的多聚

13、ADP核糖化酶活性在調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)及脂肪細(xì)胞生成中的作用。 首先我們將通過質(zhì)譜手段檢測胰島素是否調(diào)控TNKS2的翻譯后修飾，進(jìn)而研究該修飾是否影響TNKS2的多聚ADP核糖化酶的活性及TNKS2和其相互作用蛋白質(zhì)的結(jié)合。此外，由于TNKS2具有多聚ADP核糖化酶的活性，我們將考察TNKS2是否介導(dǎo)與其相互作用的蛋白質(zhì)的多聚ADP核糖化修飾。在此基礎(chǔ)上我們將構(gòu)建TNKS2的多聚ADP核糖化酶活性缺失的表達(dá)載體，研究其形成復(fù)合體的能力及調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和脂肪細(xì)胞生成的作用。 (4) 在動物水平上研究調(diào)控葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)及脂肪細(xì)胞生成的分子機(jī)制。 全面分析TNKS2基因敲除小鼠與代謝相關(guān)的表型，包括小鼠在不

14、同生長時(shí)期、不同生長條件（饑餓或飽食、缺氧等）下的體重、體溫、不同部位脂肪組織的重量和脂肪細(xì)胞的數(shù)量、內(nèi)臟器官的重量等。同時(shí)測定小鼠血液中血糖、甘油三酯、不飽和脂肪酸、胰島素、胰高血糖素及瘦素的含量；脂肪組織中脂肪的含量；肝臟和肌肉中糖原的含量等。此外，對小鼠進(jìn)行葡萄糖耐受試驗(yàn)、丙酮酸耐受試驗(yàn)及胰島素耐受試驗(yàn)，測定小鼠脂肪和肌肉的葡萄糖吸收效率。 由于腺病毒感染系統(tǒng)可以特異性地攻擊肝臟和肌肉，我們將利用該系統(tǒng)在小鼠的肝臟和肌肉中導(dǎo)入針對Axin及上述新發(fā)現(xiàn)的TNKS2的復(fù)合體的組份的siRNA，測定小鼠與代謝相關(guān)的表型，確定這些分子及其復(fù)合體在調(diào)控葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)及脂肪細(xì)胞生成中的作用。同時(shí)，我們將

15、建立上述基因的條件性敲除或敲入小鼠，分析這些小鼠與糖脂代謝相關(guān)的表型，為分子及細(xì)胞水平的研究結(jié)果提供生理證據(jù)。另一方面，我們擬與廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院合作，在肥胖癥、糖尿病等代謝相關(guān)疾病的病人中檢測脂肪組織中TNKS2的表達(dá)及基因突變情況，以期為代謝相關(guān)性疾病的早期分子診斷提供依據(jù)。3. 脂代謝穩(wěn)態(tài)調(diào)控的機(jī)制 研究Cide家族蛋白質(zhì)（Cidea，Cideb 和Fsp27），PTEN和AMPK在脂肪細(xì)胞和肝細(xì)胞中脂代謝穩(wěn)態(tài)包括脂儲存，脂分解和分泌中的作用，運(yùn)用轉(zhuǎn)基因和基因敲除模型在動物水平上研究脂代謝與脂肪肝發(fā)生，肝組織纖維化，炎癥反應(yīng)，細(xì)胞異常增殖之間關(guān)系。(1) Cide家族蛋白質(zhì)在脂肪細(xì)胞中

16、脂滴形成、融合與水解的作用及其機(jī)制 我們通過Fsp27基因敲除小鼠，小鼠胚胎纖維細(xì)胞和脂肪細(xì)胞株3T3-L1的研究表明Fsp27蛋白質(zhì)定位于脂滴表面，可控制脂肪細(xì)胞中脂滴的形成，脂水解，并在脂肪細(xì)胞中基因表達(dá)調(diào)控以及胰島素的敏感性中起重要作用。但其作用的分子機(jī)制還不清楚。我們將通過生物化學(xué)方法分離和純化Fsp27以及脂滴，建立體外脂滴融合體系，并通過細(xì)胞影像系統(tǒng)活體詳細(xì)研究脂滴的動態(tài)變化過程。我們將采用酵母雙雜交、免疫共沉淀的方法，尋求與Fsp27相互作用的蛋白質(zhì)，研究其與Fsp27相互協(xié)調(diào)調(diào)控脂滴的動態(tài)變化。同時(shí)，我們還將建立脂肪細(xì)胞特異過表達(dá)Fsp27的轉(zhuǎn)基因小鼠，研究在Fsp27過表達(dá)后

17、動物脂肪細(xì)胞的脂滴的大小、脂水解的活性、脂肪細(xì)胞的分化以及胰島素敏感性、血脂的含量以及脂肪過量積累對肝臟和骨骼肌的脂代謝等的關(guān)系；并用脂質(zhì)組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組學(xué)等方法研究Fsp27調(diào)控脂肪細(xì)胞脂代謝的分子機(jī)制。 (2) CIDE蛋白質(zhì)、PTEN、AMPK等調(diào)控肝臟細(xì)胞脂代謝的機(jī)制 利用我們現(xiàn)有的Cide家族敲除小鼠和將建立的PTEN肝臟特異敲除小鼠，我們將研究： CIDE家族蛋白質(zhì)和PTEN在肝臟細(xì)胞中脂肪積累、脂肪合成、脂肪酸氧化以及VLDL分泌等脂代謝的調(diào)控機(jī)制；肝臟脂代謝穩(wěn)態(tài)調(diào)控與脂肪肝的發(fā)生； 利用酵母雙雜交、免疫共沉淀、基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)等手段找尋在肝臟中與CIDE家族蛋白質(zhì)相

18、互作用蛋白質(zhì)以及受CIDE蛋白質(zhì)調(diào)控的代謝網(wǎng)絡(luò)。 利用化學(xué)誘變劑促使肝臟細(xì)胞發(fā)生癌變。研究從脂肪肝發(fā)生后到肝臟的癌變過程中糖脂代謝的變化，炎癥因子的變化情況及致癌相關(guān)基因的表達(dá)情況。檢測脂肪肝發(fā)生、組織纖維化、癌變以及與炎癥反應(yīng)之間關(guān)系。 利用原代肝細(xì)胞或肝細(xì)胞系為模型詳細(xì)研究CIDE蛋白質(zhì)、PTEN和AMPK在肝細(xì)胞中脂肪積累、脂代謝的調(diào)控、細(xì)胞增殖和凋亡的分子機(jī)制。從轉(zhuǎn)基因和肥胖小鼠中分離原代肝細(xì)胞及利用實(shí)驗(yàn)室已有的肝細(xì)胞系，用各種因子如炎癥因子、脂肪酸、細(xì)胞凋亡因子等刺激，詳細(xì)研究肝細(xì)胞的脂肪積累、細(xì)胞增殖和凋亡的機(jī)制，在細(xì)胞和分子水平上解釋肝臟的脂肪積累和其病變的關(guān)系。 4. 研究甘油

19、代謝限速酶GK、胰島素信號通路重要節(jié)點(diǎn)分子Akt1以及肝臟重要轉(zhuǎn)錄因子HNF1在糖尿病發(fā)生、發(fā)展、與調(diào)控過程中的分子機(jī)制。(1) GK/TR3相互作用在肝細(xì)胞糖原異生代謝的影響：GK與TR3相互作用的特性，如相互作用結(jié)構(gòu)域、影響因素、特異性等；GK對TR3調(diào)控功能的影響，包括TR3的轉(zhuǎn)錄活性及DNA結(jié)合活性；GK/TR3相互作用對肝細(xì)胞功能及糖異生代謝的影響；應(yīng)用轉(zhuǎn)基因小鼠分析GK/TR3相互作用對糖異生代謝及胰島素水平等的影響。 (2) 研究Akt蛋白質(zhì)復(fù)合體功能：擬通過串聯(lián)親和純化技術(shù)聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)的實(shí)驗(yàn)策略純化鑒定人肝癌細(xì)胞的Akt1蛋白質(zhì)復(fù)合體，獲得一批Akt1的候選相互作用蛋白質(zhì)。(3

20、) HNF1/14-3-3相互作用的分子機(jī)制及其在HNF1選擇性調(diào)控基因表達(dá)中的作用進(jìn)行深入研究：HNF1/14-3-3相互作用的特性（如作用位點(diǎn)、特異性、影響因素等）及相互作用的功能（如促進(jìn)二聚化、穩(wěn)定磷酸化、增強(qiáng)DNA的結(jié)合、增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄激活活性、介導(dǎo)泛素化、以及是否介導(dǎo)HNF1與其它蛋白質(zhì)的協(xié)同調(diào)控等）。研究目標(biāo)：1. 鑒定5-10個與糖脂代謝相關(guān)的基因的功能，并闡述其在維持糖脂代謝穩(wěn)態(tài)的過程中的分子機(jī)制；2. 闡述以上基因是如何通過調(diào)控糖脂代謝穩(wěn)態(tài)而影響肥胖、糖尿病、細(xì)胞異常增殖的發(fā)生發(fā)展的。 承擔(dān)單位： 廈門大學(xué)、清華大學(xué)、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所課題負(fù)責(zé)人： 林圣彩學(xué)術(shù)骨干： 李蓬、宋

21、詠梅、楊叔禹、林舒勇、李丹課題經(jīng)費(fèi)比例： 33%課題2 調(diào)節(jié)細(xì)胞生長及應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵因子調(diào)控能量代謝的分子機(jī)制 研究內(nèi)容：細(xì)胞在異常增殖和應(yīng)激反應(yīng)下會發(fā)生能量代謝的改變，但是導(dǎo)致代謝改變的分子機(jī)理仍不清楚。目前的研究表明調(diào)節(jié)細(xì)胞生長及應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵因子在調(diào)控能量代謝中也起重要作用，如我們發(fā)現(xiàn)CKIP-1可以影響肥胖的發(fā)生和痩素的分泌；p53被發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞代謝特別是腫瘤細(xì)胞的異常代謝中具有重要的功能，通過對不同靶基因表達(dá)的調(diào)控和參與調(diào)節(jié)mTOR、NF-B等代謝核心信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來調(diào)控氧化磷酸化、糖酵解等過程；TR3除了調(diào)節(jié)糖異生途徑外，還參與調(diào)控糖酵解、糖原分解和磷酸甘油的穿梭轉(zhuǎn)運(yùn)。此外，低氧是典型

22、的逆境應(yīng)激反應(yīng)；適度低氧所引起的細(xì)胞代謝的變化和能量的產(chǎn)生及利用不同于以往的缺氧效應(yīng)。低氧引起細(xì)胞代謝改變的分子機(jī)制及生化過程目前仍不清楚。本課題擬以CKIP-1、p53、TR3和HIF1信號通路為中心，深入探討細(xì)胞在各種應(yīng)激反應(yīng)中能量代謝的變化和分子機(jī)制。課題2擬開展的研究內(nèi)容如下：1. 研究CKIP-1在肥胖和瘦素分泌過程中的地位以及TGF超家族信號通路在能量代謝穩(wěn)態(tài)調(diào)控中的作用 利用CKIP-1-/-小鼠模型研究CKIP-1在肥胖和瘦素分泌過程中的地位以及TGF超家族信號通路在能量代謝穩(wěn)態(tài)調(diào)控中的作用，闡明其發(fā)揮功能的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。(1) 前期研究發(fā)現(xiàn)，在正常飲食下，CKIP-1+/+

23、與CKIP-1-/-小鼠體重增加并無二致；而在高脂飲食下，CKIP-1-/-小鼠體重顯著增加。我們首先擬開展實(shí)驗(yàn)的是檢測高脂飲食下的血糖穩(wěn)態(tài)維持有無異常，即以空腹血糖，葡萄糖耐受和胰島素抵抗等指標(biāo)來確定CKIP-1-/-小鼠是否具有型糖尿病表型。此外，檢測CKIP-1+/+ 與CKIP-1-/-小鼠血清中甘油三酯、總膽固醇、高密度和低密度載脂蛋白質(zhì)含量，以確定CKIP-1是否影響了血脂代謝。另一方面，我們也會對高脂飲食下CKIP-1-/-小鼠體重顯著增加的原因作出探究，擬對兩種基因型小鼠攝食量，活動性，呼吸熵，線粒體氧化效率等反映能量利用的指標(biāo)做出評估，以期找到CKIP-1-/-小鼠肥胖易感的

24、原因。 (2) 我們擬研究正常和高脂飲食下CKIP-1+/+ 與CKIP-1-/-小鼠脂肪組織總量、脂肪細(xì)胞個體大小以及脂肪細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子如瘦素(leptin)、脂聯(lián)素(adiponectin)、抵抗素(resistin)等重要指標(biāo)的變化，檢測兩種基因型小鼠肝細(xì)胞內(nèi)甘油三酯儲存量以及調(diào)控其儲存的關(guān)鍵蛋白質(zhì)如PPAR等的表達(dá)水平，明確CKIP-1基因?qū)χ炯?xì)胞、肝細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞功能的調(diào)控作用。同時(shí)，進(jìn)行兩種基因型小鼠骨骼肌能量代謝指標(biāo)的比較，評估氧化磷酸化過程中重要蛋白質(zhì)UCP家族的表達(dá)變化差異。 (3) 闡明CKIP-1基因調(diào)控細(xì)胞代謝的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，研究在正常和高脂飲食下CKIP-1缺

25、失對JNK通路及PI3K-AKT-mTOR通路的影響；研究CKIP-1對于p53在代謝調(diào)控中作用的影響及其信號通路；并研究CKIP-1是否可以通過調(diào)節(jié)泛素連接酶Smurf1降解Smad1來影響TGF/BMP超家族信號通路對于能量穩(wěn)態(tài)的維持。 2. 異常細(xì)胞代謝的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及調(diào)控的分子機(jī)制以p53為節(jié)點(diǎn)分子尋找選擇性調(diào)控p53代謝相關(guān)途徑的分子，并對這些分子的功能及作用機(jī)制進(jìn)行研究，揭示在細(xì)胞變異及在逆境應(yīng)激反應(yīng)中p53參與代謝調(diào)控的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及調(diào)控機(jī)制。(1) KRAB型鋅指蛋白質(zhì)家族中代謝相關(guān)的p53選擇性調(diào)控分子篩選： 第一輪篩選：比照Apak的功能特點(diǎn)，即在應(yīng)激信號下，發(fā)生磷酸化與p53

26、解離，解除對p53的抑制功能，提供生物信息學(xué)分析，將含有各種應(yīng)激信號相關(guān)激酶磷酸化位點(diǎn)的成員克隆及確認(rèn)表達(dá)； 第二輪篩選：通過報(bào)告基因活性測定篩選出能抑制p53轉(zhuǎn)錄活性的成員； 第三輪篩選：通過實(shí)時(shí)定量PCR及ChIP實(shí)驗(yàn)篩選能夠選擇性調(diào)控p53代謝相關(guān)靶基因表達(dá)的成員；(2) 代謝相關(guān)的p53選擇性調(diào)控分子的功能及作用機(jī)制研究：A經(jīng)過以上三輪篩選，得到p53選擇性代謝調(diào)控分子成員后，檢測它們?nèi)绾握{(diào)控p53的活性、穩(wěn)定性，是否影響p53的翻譯后修飾；針對細(xì)胞代謝途徑，選擇性的檢測它們對糖代謝途徑、合成代謝途徑、細(xì)胞自噬、脂類代謝等途徑的調(diào)控功能及變化等進(jìn)行系統(tǒng)研究。 B.分析在細(xì)胞異變及在逆境

27、應(yīng)激反應(yīng)，如缺氧及營養(yǎng)匱乏等條件下，調(diào)控分子與p53的結(jié)合狀態(tài), p53活性的變化及變化機(jī)制等。(3) 對p53選擇性代謝調(diào)控分子進(jìn)行組織細(xì)胞表達(dá)譜分析： 通過Northern blot、q-PCR、Western blot等手段分析相關(guān)成員的細(xì)胞、組織、器官表達(dá)譜，揭示它們的分布規(guī)律，不同成員之間的重疊性。(4) 對p53選擇性代謝調(diào)控分子進(jìn)行功能協(xié)同關(guān)系研究： 對于組織表達(dá)譜有重疊的p53選擇性代謝調(diào)控分子，通過單一和聯(lián)合RNAi技術(shù)敲低一個或多個成員的表達(dá)，檢測它們在p53調(diào)控中的功能重疊度。 3. 細(xì)胞在逆境應(yīng)激反應(yīng)中能量代謝的調(diào)控機(jī)制 我們將在低氧和缺氧條件下研究細(xì)胞代謝的變化及其分

28、子機(jī)制。利用不同的類型的細(xì)胞為模型，明確低氧和缺氧與細(xì)胞行為的關(guān)系，分離鑒定參與低氧和缺氧逆境中的能量代謝調(diào)控的關(guān)鍵因子分子并闡明其分子機(jī)制。 (1) 揭示細(xì)胞在低氧或缺氧環(huán)境中能量代謝的變化比較分析細(xì)胞在低氧或缺氧環(huán)境中能量代謝的變化與細(xì)胞行為的關(guān)系，以及對HIF1信號通路和代謝調(diào)控相關(guān)的酶的調(diào)節(jié)作用。 研究細(xì)胞在低氧和缺氧環(huán)境中的代謝變化。主要檢測氧化磷酸化水平，葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)和酵解，糖原的合成和ATP的產(chǎn)生和利用等；以及對低氧誘導(dǎo)因子（HIF1）和下游靶基因如調(diào)控氧化磷酸化和糖酵解相關(guān)酶的活性和表達(dá)的變化和調(diào)控關(guān)系。 從缺氧的另一方面，研究缺氧誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生過程中，對細(xì)胞損傷修復(fù)具有重要調(diào)

29、節(jié)作用的APE/Ref-1的作用和對代謝的調(diào)節(jié)。確認(rèn)缺氧誘導(dǎo)的ROS是否引起APE/Ref-1的泛素化修飾，及該泛素化途徑是否通過p53-MDM2通路介導(dǎo)。探討APE/Ref-1可否被缺氧誘導(dǎo)的ROS磷酸化，及ROS清除劑是否具有抑磷酸化作用，并在此基礎(chǔ)上探討該作用是否為其泛酸化的前提。探究氧化應(yīng)激中APE/Ref-1在低氧或缺氧環(huán)境中對細(xì)胞能量代謝的調(diào)節(jié)和調(diào)控機(jī)制的研究(2) 探究細(xì)胞在低氧或缺氧環(huán)境中對細(xì)胞能量代謝調(diào)節(jié)的分子機(jī)制，篩選鑒定在不同氧濃度條件下參與能量代謝的重要的蛋白質(zhì)激酶、蛋白質(zhì)磷酸酶及泛素連接酶 蛋白質(zhì)激酶、蛋白質(zhì)磷酸酶和泛素連接酶篩選：通過2D gel/DIGE法篩選蛋白

30、質(zhì)激酶。在常氧、正常低氧、低氧和無氧的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，提取細(xì)胞提取物，然后利用ATP-sepharose親和層析柱子來分離、富集蛋白質(zhì)激酶。利用DIGE技術(shù)在2D膠上分離顯示差異表達(dá)的蛋白質(zhì)激酶，用質(zhì)譜蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)來鑒定這些差異表達(dá)的蛋白質(zhì)激酶。 過表達(dá)篩選：構(gòu)建HRE(hypoxia response element)-luciferase 報(bào)告基因，然后與蛋白質(zhì)激酶cDNA表達(dá)文庫、蛋白質(zhì)磷酸酶cDNA表達(dá)文庫以及泛素連接酶cDNA表達(dá)文庫共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。通過比較在常氧、正常低氧、低氧和無氧的細(xì)胞培養(yǎng)條件下luciferase的表達(dá)差異來篩選能夠誘導(dǎo)激活HRE的蛋白質(zhì)激酶、蛋白質(zhì)磷酸酶以及泛

31、素連接酶。 在細(xì)胞中瞬間過表達(dá)蛋白質(zhì)激酶、蛋白質(zhì)磷酸酶以及泛素連接酶cDNA表達(dá)文庫，然后在常氧、正常低氧、低氧和無氧的條件下培養(yǎng)這些細(xì)胞。然后利用乳糖產(chǎn)生的檢測報(bào)導(dǎo)系統(tǒng)來比較細(xì)胞中乳糖產(chǎn)生量的不同來篩選出能夠調(diào)節(jié)糖酵解的蛋白質(zhì)激酶、蛋白質(zhì)磷酸酶和泛素連接酶。 在細(xì)胞中瞬間過表達(dá)蛋白質(zhì)激酶、蛋白質(zhì)磷酸酶以及泛素連接酶cDNA表達(dá)文庫，然后在常氧、正常低氧、低氧和無氧的條件下培養(yǎng)這些細(xì)胞。用葡萄糖熒光類似物2-NBDG(2-N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino-2-deoxy- glucose)來標(biāo)記細(xì)胞。比較2-NBDG被轉(zhuǎn)運(yùn)的不同來篩選能夠調(diào)節(jié)

32、糖酵解的蛋白質(zhì)激酶、蛋白質(zhì)磷酸酶和泛素連接酶。 (3) 對參與低氧或缺氧環(huán)境中細(xì)胞能量代謝調(diào)控的蛋白質(zhì)激酶、蛋白質(zhì)磷酸酶和泛素連接酶的信號通路和分子機(jī)制的研究 通過RNAi技術(shù)，用這些候選基因的siRNA來敲低它們在細(xì)胞中的表達(dá)，在常氧、正常低氧、低氧和無氧的條件下培養(yǎng)這些細(xì)胞。然后檢測HRE-luciferase的表達(dá)、乳糖的產(chǎn)生或?qū)?-NBDG轉(zhuǎn)運(yùn)的影響來進(jìn)一步核實(shí)這些候選基因是否參與了在低氧或缺氧環(huán)境中對細(xì)胞能量代謝的調(diào)節(jié)。如果數(shù)目太多，將會根據(jù)這些基因的具體情況分別挑選4-5個蛋白質(zhì)激酶、蛋白質(zhì)磷酸酶、泛素連接酶做進(jìn)一步的生化功能研究。對于挑選的蛋白質(zhì)激酶，尋找它們參與的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑、

33、作用底物以及作用底物的磷酸化位點(diǎn)。作用底物被磷酸化后對底物的亞細(xì)胞定位、酶活性等等功能的影響。對于挑選的蛋白質(zhì)磷酸酶，同樣的要尋找它們作用的底物以及底物上被影響的磷酸化位點(diǎn)，這些位點(diǎn)對底物的亞細(xì)胞定位、酶活性等的影響。對于挑選的泛素連接酶，通過Yeast-2-Hybrid，TAP-tag (Tandem-affinity-purification)方法來幫助鑒定這些連接酶的底物。在這基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究泛素連接酶與它們蛋白質(zhì)底物的相互作用及調(diào)節(jié)（比如這種作用是否受其它蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)譯后修飾（例如磷酸化）的調(diào)節(jié)）。這些蛋白質(zhì)底物被泛素化后的命運(yùn)（是被降解了還是影響它們的亞細(xì)胞定位還是其它影響）。 進(jìn)一步生

34、化研究的候選蛋白質(zhì)激酶、蛋白質(zhì)磷酸酶和泛素連接酶以及它們作用的底物，在細(xì)胞水平上將做進(jìn)一步的功能研究，探討它們的生化特性在不同氧濃度培養(yǎng)的條件下如何發(fā)生變化，這些變化與整個細(xì)胞的能量代謝變化之間的關(guān)系，包括氧的利用、糖的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、糖酵解的變化。 4. 核受體TR3對細(xì)胞代謝的調(diào)節(jié)作用前期研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)利用高脂飼料分別喂養(yǎng)TR3 野生型和敲除型小鼠時(shí)，TR3野生型小鼠在總脂肪含量、血液甘油三酯、游離脂肪酸、白色脂肪細(xì)胞大小等肥胖指標(biāo)上，都表現(xiàn)出高于TR3敲除小鼠的表型。這些結(jié)果提示TR3在機(jī)體脂肪代謝調(diào)控上發(fā)揮了一定的作用。此外，TR3除了調(diào)節(jié)糖異生途徑外，還參與調(diào)控糖酵解、糖原分解和磷酸甘油的穿

35、梭轉(zhuǎn)運(yùn)。因此，我們將開展以下研究： (1) TR3通過影響AMPK通路調(diào)控糖代謝 在前期實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)在正常肝細(xì)胞中過表達(dá)TR3可以抑制AMPK的磷酸化水平；而用siRNA抑制TR3的表達(dá)，則AMPK的磷酸化水平上升。但是，AMPK蛋白質(zhì)水平則不受影響，說明TR3參與調(diào)控AMPK的磷酸化。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)TR3能與AMPK結(jié)合。因此，我們將進(jìn)一步研究TR3與AMPK的結(jié)合是如何調(diào)節(jié)AMPK的活性并影響糖代謝穩(wěn)態(tài)的。 (2) TR3 對脂肪代謝的調(diào)控作用 在前期研究中我們發(fā)現(xiàn)TR3能與STAT3相互作用，而Leptin-STAT3通路在脂肪代謝調(diào)節(jié)中起重要作用。我們將研究TR3對Leptin刺激

36、下STAT3轉(zhuǎn)錄激活活性的影響，闡明TR3對于Leptin誘導(dǎo)下STAT3轉(zhuǎn)錄激活活性的調(diào)控作用。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)野生型小鼠肝臟中STAT3的磷酸化水平低于敲除型小鼠。因此，我們將深入地分析TR3調(diào)控STAT3磷酸化的分子機(jī)制和信號通路。 (3) TR3的激動劑在調(diào)節(jié)糖脂代謝中的作用 我們實(shí)驗(yàn)室最近從植物內(nèi)生真菌Dothiorell sp.的菌絲中分離得到一種化合物，稱為cytosporone B(Csn-B)，發(fā)現(xiàn)它能特異性結(jié)合到TR3配體結(jié)合區(qū)，誘導(dǎo)TR3蛋白質(zhì)構(gòu)象改變，提高TR3的轉(zhuǎn)錄激活活性。動物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明Csn-B還能在小鼠體內(nèi)發(fā)揮調(diào)節(jié)血糖的生理功能。因此，我們將以Csn-B作為母體

37、結(jié)構(gòu)，人工合成大量的Csn-B系列衍生物，從這些衍生物中篩選出有效的治療糖尿病的潛在藥物。同時(shí)，通過小鼠模型研究該系列化合物在血糖和脂肪代謝中的獨(dú)特作用，為以TR3為靶點(diǎn)的藥物篩選提供理論依據(jù)。研究目標(biāo)：1. 闡明CKIP-1、TR3、KZNF等調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的關(guān)鍵因子在不同逆境應(yīng)激反應(yīng)中調(diào)控能量代謝的分子機(jī)制； 2. 揭示p53、HIF1、AMPK等應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子在不同逆境應(yīng)激反應(yīng)中參與細(xì)胞代謝調(diào)控的信號通路及相關(guān)分子機(jī)制。 承擔(dān)單位： 中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所、中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所、廈門大學(xué)、浙江大學(xué)課題負(fù)責(zé)人： 朱玲玲學(xué)術(shù)骨干： 田春艷

38、、吳喬、夏總平、吳麗穎、于淼、陳航姿課題經(jīng)費(fèi)比例： 34%課題3 ： 重要代謝調(diào)節(jié)因子的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和調(diào)節(jié)機(jī)制 研究內(nèi)容：細(xì)胞代謝的調(diào)控主要是通過蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用來實(shí)現(xiàn)的。因此，對于在代謝調(diào)控中起重要作用的調(diào)節(jié)因子如能量感應(yīng)分子AMPK、腫瘤抑制因子p53和Axin等、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白質(zhì)TNKS等及其復(fù)合體的分子結(jié)構(gòu)研究將對我們深入了解并闡明這些蛋白質(zhì)分子及其復(fù)合體本身的調(diào)節(jié)機(jī)制以及在代謝調(diào)控信號通路網(wǎng)絡(luò)中相互作用的分子機(jī)理具有非常重要的意義。對于AMP調(diào)節(jié)AMPK活力的分子機(jī)理，特別是AMPK三聚體全酶的活力調(diào)控機(jī)制目前仍待進(jìn)一步探討和闡明。除了作為能量的感應(yīng)分子來調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的能量狀態(tài)，A

39、MPK能夠通過其它信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來調(diào)控細(xì)胞的生長水平，特別是AMPK的激活可以抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長。然而，關(guān)于AMPK調(diào)控細(xì)胞生長的機(jī)理還很不清楚。另外，越來越多的證據(jù)表明AMPK在調(diào)節(jié)細(xì)胞衰老和死亡方面也具有重要的作用。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)AMPK可以通過影響Wnt信號途徑來調(diào)控細(xì)胞周期，從而影響細(xì)胞的生長；體軸發(fā)育抑制因子Axin（Axis inhibitor）和組蛋白質(zhì)乙酰轉(zhuǎn)移酶Tip60都可以與AMPK發(fā)生相互作用，并且AMPK可以在Axin存在的條件下磷酸化Tip60。我們之前的研究表明Tip60參與Axin和HIPK2（homeodomain-interacting protein

40、kinase 2）介導(dǎo)的p53信號通路，來決定細(xì)胞在不同的DNA損傷的情況下是進(jìn)行DNA修復(fù)還是凋亡，因此，AMPK有可能是通過調(diào)節(jié)Tip60的磷酸化來選擇性地調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長停滯或凋亡。此外，最近的研究結(jié)果表明，TNKS可以通過調(diào)節(jié)GLUT4的外吐來調(diào)控葡萄糖的吸收，因此在葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)中起著重要的作用。通過對TNKS基因敲除小鼠的研究，發(fā)現(xiàn)在這些小鼠中表現(xiàn)出能量消耗、脂肪酸氧化以及胰島素誘導(dǎo)的葡萄糖利用效率增加。最新發(fā)表在Nature上的研究結(jié)果和我們的研究結(jié)果都發(fā)現(xiàn)TNKS可以與體軸抑制因子Axin結(jié)合，更令人感興趣的是我們發(fā)現(xiàn)Axin可以介導(dǎo)AMPK與TNKS的相互作用。因此，Axin/A

41、MPK/TNKS復(fù)合體結(jié)構(gòu)的研究對于揭示葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的分子機(jī)制具有重要的意義。圍繞這些問題，我們將進(jìn)行以下研究：1. AMPK活性調(diào)控的分子機(jī)制我們從大鼠、果蠅、酵母等多個物種中分別克隆了不同來源的AMPKa、b 和 三種亞基，構(gòu)建了各種包含激酶結(jié)構(gòu)域的長短各異的三聚體復(fù)合物，并嘗試進(jìn)行亞基的不同isoform或不同物種之間的排列組合，并進(jìn)行了初步晶體學(xué)研究，已經(jīng)獲得了一些AMPK的晶體，并且正在進(jìn)一步優(yōu)化中。我們希望能解析出AMPK異源三聚體全酶的晶體結(jié)構(gòu)，從原子水平上全面闡明AMPK的激活機(jī)制。 2. 參與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控的蛋白質(zhì)復(fù)合體的分子結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)機(jī)制 為了進(jìn)一步研究AMPK與TNKS的作

42、用機(jī)制以及AMPK是否可以通過磷酸化TNKS以調(diào)節(jié)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)，我們擬進(jìn)行三個方面的研究： (1) 確定AMPK調(diào)控TNKS的磷酸化位點(diǎn)。我們將用免疫共沉淀的辦法純化比較在Axin存在和缺失的情況下的TNKS，應(yīng)用MALDI-TOF質(zhì)譜來確定TNKS中AMPK的特異的磷酸化位點(diǎn)，并用定點(diǎn)突變結(jié)合Phospho-mapping的方法來驗(yàn)證其磷酸化位點(diǎn)。(2) 研究AMPK是否可以通過磷酸化TNKS來控制GLUT4或其它家族成員的細(xì)胞定位和功能，進(jìn)而調(diào)節(jié)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)，并闡明其具體的分子調(diào)節(jié)機(jī)制和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。 (3) 共結(jié)晶AMPK、TNKS和Axin，在Axin的存在下，分別取得AMPK和無活性

43、的AMPK（dominant inactive mutant）與TNKS相互作用的蛋白質(zhì)復(fù)合體晶體，從而闡明AMPK對TNKS的磷酸化的位點(diǎn)以及磷酸化對TNKS構(gòu)象造成的影響。 3. AMPK代謝通路對細(xì)胞生長及死亡的調(diào)控機(jī)理(1) 首先，我們將確定AMPK和Wnt信號通路之間的交互關(guān)系，AMPK是如何影響Wnt信號通路的。我們擬通過應(yīng)用LUMIER （Luminescence-based Mammalian Interactome Mapping）的手段，檢測AMPK或其下游靶點(diǎn)蛋白質(zhì)與Wnt信號通路中的節(jié)點(diǎn)蛋白質(zhì)分子以及各種調(diào)節(jié)因子的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用，并應(yīng)用免疫沉淀的方法加以驗(yàn)證，從而

44、明確AMPK調(diào)節(jié)Wnt信號途徑的分子機(jī)理，并在此基礎(chǔ)上探討能量代謝信號是如何通過AMPK和Wnt信號途徑來調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和細(xì)胞生長的。(2) 由于細(xì)胞通常是通過多渠道、多方面的調(diào)控以達(dá)到一個有效、精確的效果，因此，除了研究AMPK和Wnt信號通路之間的聯(lián)系，我們也將考察AMPK是否對其它如p53和細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長因子TGFb等這些在細(xì)胞生長調(diào)控中起重要作用的信號通路也存在調(diào)控作用，并且闡明AMPK對這些信號通路的調(diào)節(jié)作用和分子機(jī)制，從而得到一個相對全面的、具有整體性的能量代謝與細(xì)胞生長調(diào)控信號通路之間的關(guān)系。 (3) 確定AMPK調(diào)控的Tip60的磷酸化位點(diǎn)。我們將用免疫共沉淀的辦法分別純化出在AM

45、PK活性被激活或被抑制條件下的Tip60，并且應(yīng)用MALDI-TOF質(zhì)譜來確定Tip60中AMPK的特異的磷酸化位點(diǎn)，并用定點(diǎn)突變結(jié)合Phospho-mapping的方法來驗(yàn)證其磷酸化位點(diǎn)。 (4) 確定Tip60的磷酸化對于Axin和HIPK2調(diào)控的p53信號通路的影響，探討其在細(xì)胞生長停滯和細(xì)胞凋亡選擇中的作用，進(jìn)而探討AMPK在細(xì)胞凋亡中的作用和調(diào)控機(jī)制。 (5) 闡明能量代謝信號、特別是能量的異常代謝通過能量感應(yīng)分子AMPK調(diào)控細(xì)胞凋亡的信號途徑和分子機(jī)理，并探討在腫瘤細(xì)胞中是否存在異常代謝的機(jī)制使得能量代謝信號通過AMPK調(diào)控細(xì)胞凋亡的作用被抑制，從而使腫瘤細(xì)胞得以異常增生。研究目標(biāo)

46、：1. 闡明AMPK三聚體全酶的活性調(diào)節(jié)的分子機(jī)制；2. 闡明AMPK、Axin、TNKS之間相互作用的分子機(jī)制；3. 揭示AMPK通過Wnt、Tip60或其它信號通路調(diào)控細(xì)胞生長與死亡的分子機(jī)理。 承擔(dān)單位： 清華大學(xué)、廈門大學(xué)課題負(fù)責(zé)人： 吳嘉煒學(xué)術(shù)骨干： 王志新、王洪睿、周海夢、丁鳳、尹震宇課題經(jīng)費(fèi)比例： 33%5各課題間的相互關(guān)系本項(xiàng)目將圍繞糖、脂代謝在細(xì)胞和機(jī)體內(nèi)的穩(wěn)態(tài)調(diào)控機(jī)制及細(xì)胞在不同環(huán)境因素（如低氧、能量缺乏或過剩等）刺激下糖脂代謝調(diào)控的機(jī)制及其結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，在細(xì)胞和動物水平上開展以下研究：1. 闡明在不同的生理狀況和環(huán)境因素下機(jī)體和細(xì)胞調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和脂肪代謝的分子機(jī)制；闡明在這

47、些不同的條件下機(jī)體和細(xì)胞維持代謝穩(wěn)態(tài)的機(jī)理；闡明Axin、Cidea及與其相互作用的蛋白質(zhì)（復(fù)合體）調(diào)節(jié)糖脂轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝的分子機(jī)理，并揭示其生理功能。2. 探討細(xì)胞發(fā)生代謝異常的內(nèi)在因素和環(huán)境因素，從分子水平上揭示外來刺激如何通過影響調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵因子如p53、KRAB、CKIP-1、TR3等的功能來調(diào)控代謝穩(wěn)態(tài)，并研究細(xì)胞異常增生影響代謝調(diào)控信號通路的分子機(jī)制，初步建立細(xì)胞異常增生和異常代謝之間相互影響的信號通路網(wǎng)絡(luò)。3. 重要代謝調(diào)節(jié)因子如能量感應(yīng)分子AMPK、腫瘤抑制因子p53和Axin、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白質(zhì)TNKS等及其復(fù)合體的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和調(diào)節(jié)機(jī)制。根據(jù)以上研究內(nèi)容，本項(xiàng)目共

48、設(shè)置以下3個課題： 課題1. 糖脂轉(zhuǎn)運(yùn)及其穩(wěn)態(tài)調(diào)控的的分子機(jī)制。系統(tǒng)研究糖、脂代謝的穩(wěn)態(tài)調(diào)控機(jī)制，包括葡萄糖和脂肪的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制、機(jī)體和細(xì)胞維持其糖、脂代謝處于相對穩(wěn)定狀態(tài)的分子機(jī)制。著重分離和鑒定參與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和脂肪肝形成的新基因和蛋白質(zhì)復(fù)合體，并研究這些蛋白質(zhì)（復(fù)合體）與其它蛋白質(zhì)（復(fù)合體）的相互作用。 課題2. 調(diào)節(jié)細(xì)胞生長及應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵因子調(diào)控能量代謝的分子機(jī)制。研究機(jī)體和細(xì)胞在各種逆境因素下，特別是低氧條件下能量代謝調(diào)控的機(jī)制，同時(shí)探討調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵因子對細(xì)胞代謝變化的影響以及調(diào)控這些變化的信號通路和反應(yīng)機(jī)制。 課題3. 重要代謝調(diào)節(jié)因子的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和調(diào)節(jié)機(jī)制。以結(jié)構(gòu)生物學(xué)

49、和生物化學(xué)為平臺，研究重要代謝調(diào)節(jié)因子如能量感應(yīng)分子AMPK、腫瘤抑制因子p53和Axin、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白質(zhì)TNKS、脂類代謝相關(guān)蛋白質(zhì)Cide、缺氧應(yīng)激因子HIF1等及其復(fù)合體的分子結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)機(jī)制，深入探索細(xì)胞通過這些節(jié)點(diǎn)蛋白質(zhì)感應(yīng)并調(diào)控糖、脂代謝穩(wěn)態(tài)的分子途徑。這3個課題之間既有承上啟下的關(guān)系，又相互補(bǔ)充支持，從不同的角度研究細(xì)胞糖脂代謝穩(wěn)態(tài)調(diào)控的分子機(jī)理，構(gòu)成了一個相對完整的研究項(xiàng)目。 四、年度計(jì)劃研究內(nèi)容預(yù)期目標(biāo)第一年1采用分子和細(xì)胞生物學(xué)手段，確定在糖脂代謝中起重要作用的蛋白質(zhì)及網(wǎng)絡(luò)通路，鎖定其中重要蛋白分子深入研究。2.構(gòu)建一系列參與糖脂代謝穩(wěn)態(tài)調(diào)控的分子的表達(dá)載體，包括Axi

50、n、TNKS2、Cide、CKIP-1、AMPK、KZNF家族成員等及新篩選到的與這些分子相互作用的蛋白的表達(dá)載體。3.研究低/缺氧環(huán)境中細(xì)胞的代謝變化情況，篩選低/缺氧條件下差異表達(dá)的蛋白質(zhì)激酶。4嘗試AMPK異源三聚體的晶體學(xué)研究，對構(gòu)建的各種包含激酶結(jié)構(gòu)域的長短各異的三聚體復(fù)合物進(jìn)行結(jié)晶篩選和晶體優(yōu)化。1.確定在糖脂代謝穩(wěn)態(tài)中起重要作用的蛋白質(zhì)分子。2.確定以上蛋白質(zhì)分子在糖脂代謝中的通路，包括糖脂的儲存、水解、吸收、分泌與轉(zhuǎn)運(yùn)等。3.獲得若干個可顯著調(diào)控p53下游細(xì)胞代謝相關(guān)靶基因及細(xì)胞學(xué)效應(yīng)的KZNF家族成員。4.明確TR3與AMPK、STAT3等相互作用的時(shí)空效應(yīng)。5確定在低/缺氧

51、時(shí)細(xì)胞能量代謝變化的特點(diǎn)，初步篩選到因氧濃度不同而差異表達(dá)的蛋白激酶。6.在SCI刊物上發(fā)表文章2-4篇。第二年1.研究Axin通過調(diào)節(jié)AMPK調(diào)控糖代謝穩(wěn)態(tài)的機(jī)理；研究AMPK是否可以通過磷酸化TNKS來控制GLUT4的轉(zhuǎn)運(yùn)。2.嘗試對Axin、TNKS及AMPK復(fù)合體進(jìn)行結(jié)晶。3建立Cide成員中多基因敲除小鼠以及組織特異性表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠模型。4.研究糖脂代謝中起重要功能的蛋白質(zhì)的定位與轉(zhuǎn)位過程。5.研究正常和高脂飲食下CKIP-1缺失對糖脂代謝的影響。6.研究KZNF家族中的成員通過調(diào)控p53的功能調(diào)節(jié)糖脂代謝的機(jī)理。7.研究TR3影響AMPK磷酸化的分子機(jī)理。8.研究低/缺氧下產(chǎn)生的R

52、OS對APE/Ref-1泛素化的影響;篩選低/缺氧誘導(dǎo)激活HRE的蛋白激酶。9.研究Aurora-A的異常表達(dá)對于Wnt信號通路關(guān)鍵蛋白的影響。1.揭示Axin通過調(diào)節(jié)AMPK調(diào)控糖代謝穩(wěn)態(tài)的機(jī)理。2.確定糖脂代謝中起重要功能的蛋白質(zhì)的定位與轉(zhuǎn)位過程。3.發(fā)現(xiàn)由Aurora-A調(diào)控的Wnt信號通路的關(guān)鍵蛋白。4.明確CKIP-1基因?qū)χ炯?xì)胞等不同類型細(xì)胞功能的調(diào)控作用。5.在生化和細(xì)胞學(xué)水平明確KZNF家族中的成員通過調(diào)控p53的功能調(diào)節(jié)糖脂代謝的機(jī)理。6.初步闡明闡明TR3影響AMPK磷酸化的分子機(jī)理。7.探討低/缺氧導(dǎo)致ROS積累后對誘導(dǎo)APE/Ref-1泛素化的可能作用。8.初步篩選到

53、能調(diào)控HRE的蛋白激酶。9.在SCI刊物上發(fā)表4-6篇論文。第三年1.研究基于Axin、TNKS2和Kif3a的復(fù)合體在調(diào)控Glut4轉(zhuǎn)運(yùn)中的機(jī)理；2.研究Cide家族在脂肪合成、脂肪積累、脂肪分泌等過程中的作用；3.繼續(xù)AMPK及AMPK-axin-TNKS復(fù)合體的蛋白質(zhì)晶體研究。4.探討CKIP-1在瘦素、JNK、AP-1、AKT及NF-B等代謝相關(guān)信號途徑中的調(diào)控作用及機(jī)制。5.在逆境應(yīng)激條件下，KZNF家族中的成員與p53的動態(tài)變化及機(jī)理。6.闡明TR3通過AMPK對糖代謝的調(diào)控機(jī)理。7.探討MDM2是否介導(dǎo)了APE/Ref-1的泛素化修飾。8.篩選能調(diào)控HRE、 糖酵解、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的

54、泛素連接酶。9.研究Aurora-A影響 Wnt信號通路相關(guān)蛋白的分子機(jī)制。1.闡明基于Axin、TNKS2和Kif3a的多蛋白復(fù)合體調(diào)節(jié)糖代謝穩(wěn)態(tài)的機(jī)理。2.闡明Cide家族蛋白在脂肪分泌、水解、合成與儲存中的作用機(jī)制。3.闡明CKIP-1調(diào)控糖脂代謝的機(jī)制。明確在逆境條件下，KZNF家族成員調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝的機(jī)制。4.闡明TR3通過AMPK調(diào)控糖代謝的機(jī)理。5.確認(rèn)P53-MDM2是否參與低/缺氧對APE/Ref-1的泛素化調(diào)節(jié)。6.篩選到能調(diào)控HRE及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的泛素連接酶。7.提供1-2個以AMPK分子啟發(fā)新藥開發(fā)的候選靶標(biāo)。8.揭示Aurora-A影響 Wnt信號通路相關(guān)蛋白的分子機(jī)制；

55、9.在SCI刊物上發(fā)表4-6篇論文,爭取在Science、Nature、Cell或其系列雜志上發(fā)表1-2篇研究論文。第四年1.研究基于Axin、TNKS2的多蛋白復(fù)合體在脂肪生成中的作用。2.探討TNKS2與肥胖癥、糖尿病的關(guān)系。3.研究Cide家族在脂滴形成、融合與脂滴成熟及脂肪積累等過程中作用。4.建立CKIP-1組織特異性敲除小鼠模型。5.分析KZNF家族中p53選擇性代謝調(diào)控分子的組織細(xì)胞表達(dá)譜。6.研究TR3調(diào)控脂代謝的分子機(jī)理。7.探討低/缺氧條件下APE/Ref-1泛素化與能量代謝的關(guān)系。8.研究調(diào)控HRE、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白激酶在調(diào)控低/缺氧時(shí)能量代謝中的關(guān)鍵作用。9.研究AMPK對Tip60的調(diào)控作用;確定Tip60被AMPK磷酸化的位點(diǎn)并建立體外磷酸化反應(yīng)。1.闡明基于Axin、TNKS2的多蛋白復(fù)合體在脂肪生成中的作用。2.揭示TNKS2的表達(dá)和功能異常與肥胖癥及糖尿病的關(guān)系。3.闡明Cide家族蛋白在脂肪水解、合成與儲存中的作用及機(jī)制。4建立CKIP-1組織特異性敲除小鼠模型。5明確KZNF家族中p53選擇性代謝調(diào)控分子的組織細(xì)胞表達(dá)譜。6.揭示T