C0016乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測試劑盒

1、乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測試劑盒產(chǎn)品編號產(chǎn)品名稱包裝C0016乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測試劑盒100次產(chǎn)品簡介:碧云天的乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測試劑盒(LDH Cytotoxicity Assay Kit)，也稱乳酸脫氫酶檢測試劑盒(LDH Assay Kit)或乳酸脫氫酶釋放檢測試劑盒(LDH Release Assay Kit)，是一種基于diaphorasd崔化的INT顯色反應(yīng)，通過比色法檢測細(xì)胞毒性時釋放 的乳酸脫氫酶活性或檢測其它樣品中的乳酸脫氫酶活性的試劑盒。本試劑盒可以用于常規(guī)的乳酸脫氫酶活性的檢測，更常用于以LDH釋放為指標(biāo)的細(xì)胞毒性檢測。同時，基于細(xì)胞總?cè)樗崦摎涿富钚缘臋z測，本試劑盒也

2、可以用于檢測細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性檢測。細(xì)胞凋亡或壞死而造成的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞會導(dǎo)致細(xì)胞漿內(nèi)的酶釋放到培養(yǎng)液里，其中包括酶活性較為穩(wěn)定的乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)。通過檢測從質(zhì)膜破裂的細(xì)胞中釋放到培養(yǎng)液中的LDH的活性，就可以實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞毒性的定量分析。LDH釋放被看做細(xì)胞膜完整性的重要指標(biāo)，并被廣泛用于細(xì)胞毒性檢測。LDH釋放被認(rèn)為是以前使用放射性的51Cr標(biāo)記細(xì)胞，隨后通過51Cr釋放進(jìn)行細(xì)胞膜完整性檢測的安全有效的替代方法。本試劑盒的基本原理是，在乳酸脫氫酶的作用下，NAD+被還原生成NADH，NADH和INT (2-p-iodophenyl-3-nit

3、rophenyltetrazolium chloride)被硫辛酰胺脫氫酶(diaphorase)催化反應(yīng)生成NAD+和強(qiáng)生色物甲臜(formazan)，在490nm波長下產(chǎn)生吸收 峰，從而可以通過比色來定量乳酸脫氫酶的活性。吸光度與乳酸脫氫酶活性成線性正相關(guān)。該酶聯(lián)反應(yīng)原理的示意圖如下：LDHLactate acid> Pyruvic acidNAD*忖 ADH + H*Formaza n(red)DiaphoraseTetrazolium INT(yellow)可檢測細(xì)胞培養(yǎng)液、細(xì)胞裂解液等樣品中乳酸脫氫酶的活性。一個試劑盒可進(jìn)行100次檢測包裝清單：產(chǎn)品編號'1產(chǎn)品名稱包裝

4、C0016-1LDH釋放試劑1.5mlC0016-2乳酸溶液2mlC0016-3酶溶液1ml >2C0016-4INT溶液(10X)0.2mlC0016-5INT稀釋液2ml一說明書1份保存條件：-20C保存，一年有效。C0016-3需注意避免反復(fù)凍融。 C0016-4需避光保存。試劑盒解凍后可以短期4C存放，2-3天內(nèi)有效。注意事項(xiàng)：冷凍會使樣品中部分乳酸脫氫酶失活，4C可放置2-3天。建議樣品準(zhǔn)備好后盡量當(dāng)天完成測定。如果檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中的乳酸脫氫酶，由于血清含有乳酸脫氫酶，建議血清的使用濃度不要超過1%,并最好使用熱滅活血清。如果一定需要使用10%血清，在檢測時一定要設(shè)置沒有細(xì)胞，

5、但加入了相同體積培養(yǎng)液的對照孔，以用于消除背景。細(xì)胞過度生長、密度過高、離心速度過大、培養(yǎng)箱內(nèi)外溫差過大，都會造成細(xì)胞釋放乳酸脫氫酶增加。如果希望進(jìn)行乳酸脫氫酶活性的絕對定量，用戶需自備乳酸脫氫酶標(biāo)準(zhǔn)品。為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。使用說明：1. 樣品的準(zhǔn)備：方法一：LDH釋放檢測a. 根據(jù)細(xì)胞的大小和生長速度將適量細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，使待檢測時細(xì)胞密度不超過80-90%滿。b. 吸去培養(yǎng)液，用PBS夜洗滌一次。換新鮮培養(yǎng)液(推薦使用含1%血清的低血清培養(yǎng)液或適當(dāng)?shù)臒o血清培養(yǎng)液)，將各培養(yǎng)孔分成如下幾組：包括無細(xì)胞的培養(yǎng)液孔(背景空白對照孔)，未經(jīng)藥物處理的對照

6、細(xì)胞孔(樣品對照孔)，未經(jīng)藥物處理的用于后續(xù)裂解的細(xì)胞孔（樣品最大酶活性對照孔），以及藥物處理的細(xì)胞孔（藥物處理樣品孔），并做好標(biāo)記。按照實(shí)驗(yàn) 需要給予適當(dāng)藥物處理（如加入0-10卩左右特定的藥物刺激，可設(shè)置不同濃度，不同處理時間，對照孔中需加入適當(dāng)?shù)乃幬锶軇φ眨?，繼續(xù)按常規(guī)培養(yǎng)。到預(yù)定的檢測時間點(diǎn)前1小時，從細(xì)胞培養(yǎng)箱里取岀細(xì)胞培養(yǎng)板，在“樣品最大酶活性對照孔”中加入試劑盒提供的LDH釋放試劑，加入量為原有培養(yǎng)液體積的10%。加入LDH釋放試劑后，反復(fù)吹打數(shù)次混勻，然后繼續(xù)在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。c. 到達(dá)預(yù)定時間后，將細(xì)胞培養(yǎng)板用多孔板離心機(jī)400g離心5min。分別取各孔的上清液120山，

7、加入到一新的96孔板相應(yīng)孔中，隨即進(jìn)行樣品測定。方法二：細(xì)胞內(nèi)總LDH的檢測a. 細(xì)胞毒性檢測：根據(jù)細(xì)胞的大小和生長速度將適量細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)孔板中，使待檢測時細(xì)胞密度不超過80-90%滿。加入不同藥物進(jìn)行處理，并設(shè)置適當(dāng)對照。藥物刺激完畢后，將細(xì)胞培養(yǎng)板用多孔板離心機(jī)400g離心5min。盡量吸除上清，加入150卩用PBS稀釋了 10咅的試劑盒提供的LDH釋放試劑（10體積PBS中加入1體積LDH釋放試劑并混勻），適當(dāng) 搖晃培養(yǎng)板混勻，然后繼續(xù)在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1小時。隨后將細(xì)胞培養(yǎng)板用多孔板離心機(jī)400g離心5min。分別取各孔的上清液120 d，加入到一新的96孔板相應(yīng)孔中，隨即

8、進(jìn)行樣品測定。b. 細(xì)胞增殖檢測：根據(jù)細(xì)胞的大小和生長速度將適量細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)孔板中，使促進(jìn)細(xì)胞增殖的藥物刺激后細(xì)胞不超過80-90%滿為宜。使用不同的藥物刺激細(xì)胞，并設(shè)置適當(dāng)對照。藥物刺激完畢后，將細(xì)胞培養(yǎng)板用多孔板離心機(jī) 400g 離心5min。盡量吸除上清，加入150卩用PBS稀釋了 10倍的試劑盒提供的LDH釋放試劑（10體積PBS中加入1體積LDH釋放 試劑并混勻），適當(dāng)搖晃混勻，然后繼續(xù)在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1小時。隨后將細(xì)胞培養(yǎng)板用多孔板離心機(jī) 400g離心5min。分別取各孔上清液120 d，加入到一新的96孔板相應(yīng)孔中，隨即進(jìn)行樣品測定。注：LDH釋放檢測更加常用一些，

9、細(xì)胞內(nèi)總 LDH檢測通?？梢允褂肕TT、WST-1或CCK-8等方法替代。2. 試劑盒的準(zhǔn)備工作：a. INT溶液（1X）的配置：根據(jù)所需的INT溶液（1X）的量，取適量INT溶液（10X）用INT稀釋液稀釋至1X。例如，取20d INT溶 液（10X）,加入180d INT稀釋液，混勻后即配置為 200d INT溶液（1X）。INT溶液（1X）宜現(xiàn)配現(xiàn)用，配置后4C保存可于當(dāng) 天使用，不宜配置后凍存。b. LDH檢測工作液的配制：根據(jù)待測定的樣品數(shù)（含對照），參考下表在臨檢測前新鮮配制適量的檢測工作液。注意：LDH檢測工作液必須現(xiàn)配現(xiàn)用，配制和使用過程中均要注意適當(dāng)避光。檢測次數(shù)1次10次2

10、0次50次乳酸溶液20卩1200 dl400 dl1mlINT 溶液(1X)20卩1200 dl400 dl1ml酶溶液20 dl200 dl400 dl1ml總體積60 dl600 dl1.2 ml3mlc. （選做）如果希望進(jìn)行LDH酶活性的絕對定量，需自備LDH標(biāo)準(zhǔn)品，并新鮮配制不同濃度LDH標(biāo)準(zhǔn)品，如10mU/ml、5mU/ml、2.5mU/ml、1.25mU/ml、0.65mU/ml、0 mU/ml。3.樣品測定：a. 各孔分別加入60 d LDH檢測工作液。b. 混勻，室溫（約25C）避光孵育30min（可用鋁箔包裹后置于水平搖床或側(cè)擺搖床上緩慢搖動）。然后在490nm處測定吸光度

11、。使用600nm或大于600nm的任一波長作為參考波長進(jìn)行雙波長測定。c. 計算（測得的各組吸光度均應(yīng)減去背景空白對照孔吸光度）細(xì)胞毒性或死亡率（）=（處理樣品吸光度-樣品對照孔吸光度）/ （細(xì)胞最大酶活性的吸光度-樣品對照孔吸光度）X100d. 可繪制細(xì)胞毒性曲線：縱座標(biāo)為實(shí)際吸光度，橫坐標(biāo)為藥物濃度；據(jù)此可計算該藥物作用特定時間的半致死劑量LD50。附1：可同時測定一已知濃度的LDH酶標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)的吸光度值，參考以下公式粗略計算岀樣品中LDH酶活力：待測樣品中LDH活力單位（mU/ml）=（樣品孔吸光度背景空白對照孔吸光度）/ （標(biāo)準(zhǔn)管吸光度標(biāo)準(zhǔn)空白管吸光度）x標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mU/ml ）；根據(jù)計算結(jié)果可以比較不同樣品處理組間有無統(tǒng)計學(xué)差異等。附2：若需準(zhǔn)確計算岀LDH酶活性的絕對活性，可通過一系列 LDH標(biāo)準(zhǔn)品及相應(yīng)測得的吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲 線相應(yīng)公式計算岀樣品中LDH的酶活性。各孔數(shù)值減去空白對照后，以檢測的吸光度（OD490）為縱坐標(biāo)，LDH酶活力（mU）為橫坐標(biāo)，繪制LDH標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時計算出該趨勢線的公式。o.sW400EOOHODLimLDH Activity (