真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)(自動(dòng)保存)

1、4000字。技術(shù)方法類（包括分析方法類）釋文提綱：（1）定義及概述（不設(shè)標(biāo)題）（2）技術(shù)或方法原理（及發(fā)展歷史）（3）應(yīng)用及注意事項(xiàng)意見：基本符合百科全書的要求。真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) （Eukaryotic expression system）運(yùn)用基因工程技術(shù)手段，在體外將外源基因分子插入病毒、質(zhì)粒等載體分子，形成新的遺傳物質(zhì)組合，并導(dǎo)入真核細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)外源基因蛋白表達(dá)的技術(shù)系統(tǒng)。按照宿主細(xì)胞類型，真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)包括酵母表達(dá)系統(tǒng)、絲狀真菌表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)是重組蛋白表達(dá)的有利工具，在基礎(chǔ)科學(xué)及醫(yī)藥領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用。技術(shù)或方法原理（及發(fā)展歷史）酵母表

2、達(dá)系統(tǒng) 酵母是低等的單細(xì)胞真核模式生物，已完成基因組測序，遺傳背景清晰，具有生長繁殖快，成本低，易于實(shí)現(xiàn)高密度培養(yǎng)和大規(guī)模發(fā)酵的優(yōu)點(diǎn)。目前發(fā)展成熟的酵母表達(dá)系統(tǒng)主要包括釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)和畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)。釀酒酵母在食品工業(yè)領(lǐng)域的使用已有數(shù)千年歷史，被美國FDA確認(rèn)為安全性生物。1981年，Hitzeman等將成功將人干擾素基因?qū)脶劸平湍讣?xì)胞，揭開了釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)的研究和應(yīng)用歷史，迄今已有多種外源蛋白在釀酒酵母中獲得表達(dá)。然而釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)存在缺乏強(qiáng)啟動(dòng)子，質(zhì)粒易丟失，分泌效率低，且富含高甘露糖型超糖基化等不足，導(dǎo)致表達(dá)產(chǎn)物存在過度糖基化的局限性，而逐漸被巴斯德畢赤酵母等甲醇營養(yǎng)型酵母表達(dá)

3、系統(tǒng)所取代。巴斯德畢赤酵母來源于野生型石油酵母NRRL-Y11430，為子囊菌類單倍體酵母，富含甲醇代謝必須的醇氧化酶、過氧化氫酶、二羥丙酮合成酶的過氧化物酶系，能在以甲醇為唯一碳源的簡單培養(yǎng)基上快速生長，屬于甲醇營養(yǎng)型酵母的一種?；蚬こ坛Ｓ玫漠叧嘟湍妇曛饕℅S115（Mut+His）、X-33（Mut+His+）、KM71（Muts His）、SMD1168（his4 pep4）等。目前畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的啟動(dòng)子有醇氧化酶AOX1啟動(dòng)子(Ellis et al., 1985)及三磷酸甘油醛脫氫酶GAP啟動(dòng)子，外源基因通過同源重組整合到酵母染色體基因組上,外源蛋白表達(dá)水平受甲醇或葡萄糖的

4、嚴(yán)格調(diào)控。表達(dá)產(chǎn)物有胞內(nèi)表達(dá)和胞外分泌兩種方式，胞內(nèi)表達(dá)適合于通常在胞漿中表達(dá)或不含二硫鍵的非糖基化蛋白，胞內(nèi)表達(dá)載體有 pPIC3、pPSC3k、pHIL-D1、pAO815 等5。分泌型表達(dá)載體在酵母因子信號(hào)肽的引導(dǎo)下，將成熟的蛋白質(zhì)分泌到細(xì)胞外，分泌型表達(dá)載體有pPIC9K、pHIL-S1p、YAM7SP6、pGAPZa、pPICZ 等。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)具有操作簡便、遺傳穩(wěn)定、表達(dá)量高、對(duì)目的蛋白質(zhì)進(jìn)行糖基化、二硫鍵形成等翻譯后修飾功能，使表達(dá)的重組蛋白具有同天然蛋白相似的生物學(xué)功能，在非糖活性蛋白生產(chǎn)上具有顯著優(yōu)勢。昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) 昆蟲細(xì)胞具有與高等真核生物細(xì)胞相似的翻譯后修飾、加工

5、及轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)的能力。昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)主要利昆蟲細(xì)胞、昆蟲整體和桿狀病毒結(jié)構(gòu)基因中多角體蛋白的強(qiáng)啟動(dòng)子構(gòu)建的表達(dá)載體,可使很多真核目的基因得到有效甚至高水平的表達(dá)。它具有真核表達(dá)系統(tǒng)的翻譯后加工功能,如二硫鍵的形成、糖基化及磷酸化等, 使重組蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上更接近天然蛋白; 其最高表達(dá)量可達(dá)500mg/L;可表達(dá)非常大的外源性基因(- 200kD); 具有在同一個(gè)感染昆蟲細(xì)胞內(nèi)同時(shí)表達(dá)多個(gè)外源基因的能力; 對(duì)脊椎動(dòng)物安全。由于病毒多角體蛋白在病毒總蛋白中的含量非常高, 至今已有很多外源基因在此蛋白的強(qiáng)大啟動(dòng)子作用下獲得高效表達(dá)。昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)是一個(gè)利用桿狀病毒作為外源基因的載體通過感

6、染昆蟲細(xì)胞或者昆蟲幼蟲來表達(dá)外源蛋白的系統(tǒng)。該系統(tǒng)自上世紀(jì)八十年代開發(fā)成功以來，在過去的二十年里得到了迅速的發(fā)展，已被證明為高效的真核表達(dá)系統(tǒng)之一1，目前在重組蛋白表達(dá)生產(chǎn)、工程疫苗和蛋白質(zhì)組學(xué)研究等領(lǐng)域得到了越來越多的應(yīng)用。昆蟲表達(dá)系統(tǒng)是一類應(yīng)用廣泛的真核表達(dá)系統(tǒng),它具有同大多數(shù)高等真核生物相似的翻譯后修飾加工以及轉(zhuǎn)移外源蛋白的能力。利用重組桿狀病毒在昆蟲細(xì)胞體系中表達(dá)外源蛋白是目前較為流行的表達(dá)方式,其表達(dá)的蛋白水平高達(dá)1500mgPL,但受到諸多因素的限制和影響,如培養(yǎng)基質(zhì)量、供氧情況、保證對(duì)數(shù)生長等;此系統(tǒng)的主要缺點(diǎn)是外源蛋白表達(dá)處于極晚期病毒啟動(dòng)子的調(diào)控之下,而這時(shí)由于病毒感染,細(xì)胞

7、開始死亡。解決辦法是適當(dāng)?shù)膯?dòng)子調(diào)控下的基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。另一類新型的昆蟲表達(dá)系統(tǒng)是建立在對(duì)果蠅等昆蟲細(xì)胞進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)上的,在穩(wěn)定和表達(dá)效率方面有更為突出的優(yōu)點(diǎn)。利用轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)化昆蟲細(xì)胞,目前已借助herm、hobo、mariger、piggyBac等轉(zhuǎn)座子完成了對(duì)果蠅、伊蚊等雙翅目昆蟲細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化,然而其對(duì)鱗翅目昆蟲卻沒有效果14。此系統(tǒng)可用于大量制備有功能活性的目的蛋白,其表達(dá)水平高于哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng),并且在表達(dá)真核蛋白時(shí),可以進(jìn)行翻譯后修飾,其優(yōu)越性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)。昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是目前國內(nèi)外十分推崇的真核表達(dá)系統(tǒng)。主要利昆蟲細(xì)胞、昆蟲整體和桿狀病毒結(jié)構(gòu)基因中多角體蛋白的強(qiáng)啟

8、動(dòng)子構(gòu)建的表達(dá)載體, 可使很多真核目的基因得到有效甚至高水平的表達(dá)。它具有真核表達(dá)系統(tǒng)的翻譯后加工功能, 如二硫鍵的形成、糖基化及磷酸化等, 使重組蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上更接近天然蛋白; 其最高表達(dá)量可達(dá)昆蟲細(xì)胞蛋白總量的 50%; 可表達(dá)非常大的外源性基因(- 200kD); 具有在同一個(gè)感染昆蟲細(xì)胞內(nèi)同時(shí)表達(dá)多個(gè)外源基因的能力; 對(duì)脊椎動(dòng)物安全。由于病毒多角體蛋白在病毒總蛋白中的含量非常高, 至今已有很多外源基因在此蛋白的強(qiáng)大啟動(dòng)子作用下獲得高效表達(dá)。鄧寧(1996) 報(bào)道, 桿狀病毒是最大的環(huán)狀 DNA 病毒,其基因組在 90230kb 之間, 具有編碼上百種蛋白質(zhì)的能力。桿狀病毒不僅是研究

9、細(xì)胞分子生物學(xué)的重要工具, 也是許多真核和原核基因在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的中間載體。桿狀病毒轉(zhuǎn)染的昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng), 表達(dá)重組蛋白量可高達(dá) 5000mg/L; 具有與哺乳動(dòng)物系統(tǒng)相同的翻譯后修飾過程, 因而產(chǎn)生的重組蛋白與哺乳動(dòng)物蛋白的抗原性、免疫性、功能基本一致; 易于鑒定純化重組病毒及重組蛋白產(chǎn)物, 使該系統(tǒng)成為一個(gè)有效的真核表達(dá)系統(tǒng)。昆蟲表達(dá)系統(tǒng)建立于 1983 年，利用苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica)核型多角體桿狀病毒(Baculoviridae)作為外源基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染昆蟲草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的一個(gè)細(xì)胞系，用于人-干擾素的生

10、產(chǎn)(Rai and Padh, 2001)。此后，由于桿狀病毒具有啟動(dòng)子序列在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)沒有活性、對(duì)脊椎動(dòng)物無傳染性(這對(duì)于表達(dá)腫瘤相關(guān)基因以及有潛在毒性的蛋白是很有利的)、能同時(shí)克隆多個(gè)外源基因、懸浮培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞可增殖到很高的滴度、多數(shù)表達(dá)的蛋白在昆蟲體內(nèi)能保持可溶狀態(tài)、重組體桿狀病毒在自然界生存短暫從而可以保證生物安全等優(yōu)點(diǎn)，使該系統(tǒng)發(fā)展迅速，建立了當(dāng)今比較流行的重組桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)和昆蟲細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)化表達(dá)系統(tǒng)，在重組蛋白表達(dá)生產(chǎn)、工程疫苗和蛋白質(zhì)組學(xué)研究等領(lǐng)域得到越來越多的應(yīng)用。在表達(dá)更多目基因包括致癌基因方面較上述兩個(gè)系統(tǒng)略勝一籌(Mahmoud, 2007)。重組桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)

11、中最常用的載體是多核多角體病毒(Multiple nuclear polyhedrosis virus)，其原型是苜蓿銀紋夜蛾多(核殼體)核型多角體病毒(Autographica californica MNPV, AcMNPV)。能在受感染的細(xì)胞內(nèi)形成大量的多角體蛋白衍生蛋白，約占宿主細(xì)胞總蛋白的 30%50%。但它并不是必需蛋白，因此可以用外源蛋白的開放讀碼框(ORF)替代多角體蛋白 ORF 來構(gòu)建表達(dá)載體。但是，桿狀病毒分子量大(80200 kb)，不能象質(zhì)粒載體那樣利用多克隆位點(diǎn)進(jìn)行基因重組，只能利用桿狀病毒和帶有目的基因序列的質(zhì)粒載體進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，借助攜帶目的基因的質(zhì)粒載體中人為引入的

12、桿狀病毒多角體蛋白兩翼序列的同源序列，利用昆蟲宿主細(xì)胞的相關(guān)酶系和蛋白質(zhì)因子，通過同源重組實(shí)現(xiàn)目的基因?qū)Σ《径嘟求w蛋白基因的取代。但是，以野生型桿狀病毒DNA進(jìn)行共轉(zhuǎn)染時(shí)重組頻率極低,只有 0.1%，利用線形化的病毒載體可將重組率提高到 30%。目前，已經(jīng)構(gòu)建了多種各有特色的桿狀病毒載體以及昆蟲細(xì)胞系如sf9、sf21、s2、HighFiveTM、expressSF+誖細(xì)胞系等.國內(nèi)已有相關(guān)綜述(尹長城等, 2001)。另外一種昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)是基于對(duì)宿主細(xì)胞基因組進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的昆蟲細(xì)胞核基因轉(zhuǎn)化表達(dá)系統(tǒng)。寄主細(xì)胞主要來自雙翅目昆蟲，通常是果蠅和蚊子，如來自果蠅的 Schneider2 和 Kc 細(xì)胞系以及來自白紋伊蚊(Aedes albopictus)的 C7 細(xì)胞系等。2007 年，第一個(gè)由昆蟲細(xì)胞生產(chǎn)的抗人乳頭淋瘤病毒疫苗在英國葛蘭素史克(GlaxoSmithKline)公司獲得生產(chǎn)許