db33t539-2019飼料中萊克多巴胺的測定

1、db33 t 539-2019飼料中萊克多巴胺的測定本標(biāo)準(zhǔn)是在參閱了國內(nèi)外文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)我國技術(shù)發(fā)展水平研究制定的，采用了酶聯(lián)免疫法、 高效液相色譜-熒光檢測法和氣相色譜-質(zhì)譜法。本標(biāo)準(zhǔn)由浙江省農(nóng)業(yè)廳提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)由浙江省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心、浙江省疾病預(yù)防控制中心負(fù)責(zé)起草，浙江一星集團(tuán)飼料有限責(zé)任公司參與起草。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：陳慧華、吳平谷、應(yīng)永飛、任玉琴、屈健、周文海、陳勇、浦琴華。飼料中萊克多巴胺的測定1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了以酶聯(lián)免疫ELISA法、高效液相色譜HPLC法和氣相色譜質(zhì)譜GC- MS法 檢測飼料中萊克多巴胺的方法，規(guī)定GC- MSI為仲裁法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于飼料和飼料添加

2、劑中萊克多巴胺的測定。酶聯(lián)免疫ELISA法為篩選方法，檢測限為 0.01mg/kg，高效液相色譜HPLC法和氣相色譜質(zhì) 譜GC- MS法為定量方法，定量限 HPL（法為0.1mg/kg、GC- MSt為0.05mg/kg。線性范圍：酶聯(lián)免疫ELISA法為0.005ng-0.05ng，高效液相色譜HPLC法為2.5ng-10ng，氣相色譜質(zhì)譜GC- MS 法為 0.05ng-1.0ng 。2規(guī)范性引用文件以下文件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單不包括勘誤的內(nèi)容或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最

3、新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T14699.1飼料采樣方法3試樣制備按GB/T14699.1抽取有代表性的飼料樣品，用四分法縮減取約200g，粉碎至過0.45mm孔徑的分析篩，混勻，裝入磨口瓶中備用。第一法酶聯(lián)免疫法4原理與方法4.1 原理本測定方法是酶聯(lián)免疫法中的競爭性測定法，其主要原理是：吸附在孔內(nèi)的萊克多巴胺與標(biāo)準(zhǔn)或樣品中的萊克多巴胺競爭性地與萊克多巴胺抗體相結(jié)合，與標(biāo)準(zhǔn)品或樣品相結(jié)合的萊克多巴胺抗體被洗滌 去除后， 只剩下與微孔內(nèi)藥物相結(jié)合的抗體， 其再與加入的酶標(biāo)記的第二抗體相結(jié)合， 酶底物在酶作用 下產(chǎn)生藍(lán)

4、色產(chǎn)物，吸光度的高低與樣品中萊克多巴胺的含量成反比。4.2 方法 采用萊克多巴胺酶聯(lián)免疫試劑盒或類似產(chǎn)品，按試劑盒的使用說明操作。5 試劑和溶液5.1 除非另有說明，本法所用試劑均為分析純，水為去離子水，符合 GB/T6682 二級水的規(guī)定。5.2 PBS緩沖液：用水10倍稀釋廠商提供的濃縮PBS緩沖液。5.3 工作洗液：用水 20 倍稀釋廠商提供的濃縮洗液。5.4 乙酸乙酯。5.5 碳酸鹽緩沖液：稱取 4.3g碳酸鈉Na2CG?10fO，2.9g碳酸氫鈉NaHCO,加水至1000mL 搖勻，調(diào)節(jié)pH值至9.5。5.6 提取液：取10mL甲醇，力口 90mLPBS緩沖液，搖勻。5.7 甲醇。5

5、.8 第二抗體工作液：用第二抗體稀釋液 2500倍稀釋第二抗體。6 儀器與設(shè)備6.1 微孔板酶標(biāo)儀（帶450nm濾光片）。6.2 振蕩器。6.3 冷凍離心機。6.4 微量加樣器及配套吸頭：20卩L,50卩L,100卩L,200卩L。6.5 冰箱。6.6 洗板機。6.7 生化培養(yǎng)箱。6.8 氮吹儀。6.9 分析天平：感量 0.01g。7 測定步驟7.1 考前須知 不同品牌的試劑盒其操作步驟可能略有差別,具體操作步驟可根據(jù)試劑盒使用說明書略作調(diào)整。7.2 試樣處理取3g試樣于50mL離心管中，加入6mL提取液5.5，上下手搖數(shù)次，加入6ml碳酸鹽緩沖液5.4， 再加入8mL乙酸乙酯5.3，振蕩30

6、min ;以4000rpm的轉(zhuǎn)速離心5min，移取2.0mL上層有機相至另一新 試管中，氮吹至干。加入 50卩L甲醇5.6溶解殘余物后，再加入 450卩LPBSS沖液5.1，即為供試 溶液，取50卩L進(jìn)行ELISA測定。7.3 測試程序7.3.1 根據(jù)所測定樣品及標(biāo)準(zhǔn)數(shù),計算出所需微孔條數(shù),將微孔條插入微孔架,標(biāo)準(zhǔn)和樣品做兩個孔 的平行重復(fù),記錄標(biāo)準(zhǔn)和樣品的位置。7.3.2 加入50卩L的標(biāo)準(zhǔn)品和處理好的樣品到各自的微孔中，標(biāo)準(zhǔn)和樣品做兩個平行重復(fù)。7.3.3 加入100卩L第一抗體溶液到每一個微孔中，在37C孵育30分鐘后倒出孔中的液體，將微孔架倒置在洗水紙上拍打每輪拍打3次以保證完全除去孔

7、中的液體，再加入工作洗液5.2250卩L,重復(fù)操作兩遍。最后用吸水紙吸干。7.3.4 加入150卩L稀釋的酶標(biāo)記的第二抗體 5.737C孵育30分鐘后倒出孔中的液體， 將微孔架倒置在洗水紙上拍打每輪拍打 3次以保證完全除去孔中的液體，再加入工作洗液5.2250卩L,重復(fù)操作兩遍。最后用吸水紙吸干。735 加入100卩L酶底物液到微孔中，充分混合并在室溫孵育5-10min。736 加入50卩L反應(yīng)終止液到微孔中，混合后在450nm處測量吸光度值。8結(jié)果計算以空白濃度為0的標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度值為100%十算，折算出各標(biāo)準(zhǔn)和樣品的相對吸光度值。 標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值（或樣品）相對吸光度值%=x 100空白的吸

8、光度值計算出的標(biāo)準(zhǔn)相對吸光度值繪成為一個對應(yīng)濃度（ng/L）的半對數(shù)坐標(biāo)系統(tǒng)曲線圖，校正曲線在200-2000ng/L范圍內(nèi)應(yīng)當(dāng)成為線性。相對應(yīng)每一個樣品的濃度（ng/L）可以從校正曲線上讀出。第二法高效液相色譜法9方法原理用2%氨/甲醇溶液提取試樣中的萊克多巴胺，經(jīng)固相萃取柱凈化，濃縮后用2%乙酸溶液定容，用高效液相色譜-熒光檢測法分離測定。10試劑和溶液10.1 除非另有說明，本法所用試劑均為分析純，水為去離子水，符合GB/T6682二級水的規(guī)定。10.2 乙腈：色譜純。10.3 甲醇。10.4 乙腈。10.5 乙酸乙酯。10.6 冰醋酸。10.7 無水硫酸鈉。10.8 戊烷磺酸鈉：色譜級

9、。10.9 正己烷。10.10 氨水。10.11 50%乙腈/乙酸乙酯溶液：取 250mL乙腈加乙酸乙酯至 500mL,混勻。10.12 50%甲醇/乙酸乙酯溶液：取 250mL甲醇加乙酸乙酯至 500mL,混勻。10.13 2 %乙酸溶液：取 5mL冰醋酸加水至 250mL,混勻。10.14 固相萃取柱固相萃取柱的填充料為聚苯乙烯。：每根柱填料量為 500mg柱體積5mL。10.15 2%氨/甲醇溶液：取 20mL氨水加甲醇至1000mL,混勻。10.16 戊烷磺酸鈉溶液：取 800mL水，力口 20mL冰醋酸和0.87g戊烷磺酸鈉GHnOSNaPHO，混勻。10.17 萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)溶液1

10、0.17.1 萊克多巴胺貯備液250卩g/mL精密稱取萊克多巴胺對照品25mg,置100mL容量瓶中，用甲醇10.2丨溶解并定容至刻度，置-20 C冰箱中，可保存3個月。10.17.2 萊克多巴胺稀釋液（5卩g/mL）精密量取1mL萊克多巴胺貯備液10.16.1，置50m蹤色容量瓶中，用甲醇10.2稀釋并定容至 刻度，為萊克多巴胺工作液。10.17.3 萊克多巴胺工作溶液分別準(zhǔn)確吸取一定量的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液10.16.2，用2%乙酸溶液10.12丨稀釋、定容，配制成濃度為 0.10g/mL、0.20 卩 g/mL、0.50 卩 g/mL、1.0 卩 g/mL、2.0 卩 g/mL、5.0 卩 g/m

11、L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。11儀器設(shè)備11.1 高效液相色譜儀配熒光檢測器。11.2 冷凍離心機能達(dá)到 5000rpm。11.3 振蕩器。11.4 離心管 50mL, 10mL11.5 微孔濾膜0.45 i m11.6 渦旋混合器。11.7 分析天平精度0.0001g。11.8 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。11.9 雞心瓶50mL=11.10 氮吹儀。12測定步驟12.1 試樣提取稱取試樣3.0g ,準(zhǔn)確加入2 %氨/甲醇溶液10.1425mL,渦旋振蕩1min ,超聲振蕩10min , 5000rpm 離心5min,取上清液10mL至雞心瓶中，50C旋轉(zhuǎn)蒸干。12.2 試樣凈化用2mL甲醇10.2丨和2mL正己烷10.

12、8丨溶解雞心瓶中的殘余物，重復(fù)一次，棄去上層；再加入2mL正己烷10.8，重復(fù)一次，分出甲醇至10mL離心管中，45C下氮氣吹干。用5mL乙酸乙酯10.4丨溶解，加少量無水硫酸鈉10.6丨，5000rpm離心3min。洗滌液過固相萃取柱10.13，先經(jīng)5mL乙酸乙 酯潤洗用3mL50%乙腈/乙酸乙酯溶液10.10丨洗滌柱子，然后用5mL50%甲醇/乙酸乙酯溶液10.11 洗脫收集，氮吹至干。12.3 定容用2%乙酸溶液10.12定容到1mL,過膜，上機。12.4 測定12.4.1 高效液相色譜條件色譜柱：Ge柱，長250mm內(nèi)徑4.6mm,粒度5 i m,或相當(dāng)者。保護(hù)柱：Ge柱,長20mm內(nèi)

13、徑3.9mm,粒徑5 i m,或相當(dāng)者。流動相：戊烷磺酸鈉溶液10.15丨：乙腈10.1= 80 : 20 ,使用前脫氣。流速：1.0mL/min 。激發(fā)波長：226nm。發(fā)射波長：306nm。進(jìn)樣量：50i L。12.4.2 上機測定萊克多巴胺對照溶液和試液分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積進(jìn)行計算。13結(jié)果計算試樣中萊克多巴胺的含量按下式計算：n x Ai x Csx VsX=AsX M式中：n樣品稀釋倍數(shù)；Ai 樣品峰面積；As對照溶液峰面積；Vs定容體積mL；C 對照溶液濃度口 g/mL;M樣品重量g；X試樣中萊克多巴胺的含量mg/kg；3 位有效數(shù)字。測定結(jié)果用平行測定

14、的算術(shù)平均值表示，保留14 精密度14.1 重復(fù)性 實驗室內(nèi)平行測定間的相對偏差不大于 10。14.2 再現(xiàn)性 實驗室間測定的相對偏差不大于 15。第三法氣相色譜 - 質(zhì)譜法15 方法原理試樣中萊克多巴胺先用 2%氨/甲醇溶液提取，甲醇和正己烷分配脫脂，然后用柱凈化，BSTFA雙三甲基硅基三氟乙酰胺+TMCS三甲基氯硅烷衍生，最后用GC- MSt進(jìn)行定性定量分析。16 儀器與試劑16.1 氣- 質(zhì)聯(lián)用儀。16.2 烘箱。16.3 BSTFA雙三甲基硅基三氟乙酰胺+1%TMCS三甲基氯硅烷。16.4 萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液5mg/mL：準(zhǔn)確稱取50mg萊克多巴胺于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定

15、容至刻度，存放在冰箱中備用。16.5 萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：取萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液，用甲醇稀釋至所需濃度。16.6 甲苯。16.7 其它儀器，同 11。16.8 其它試劑，同 10。17 測定步驟17.1 試樣提取同 HPLCS 12.1 o17.2 試樣凈化同 HPLCS 12.2 o17.3 試樣衍生蒸發(fā)剩余物加0.1mLBSTFA+1%TMS6.3，加蓋后于旋渦混合器上震蕩，在80C的烘箱中加熱1.0h，氮氣吹干，加0.2mL甲苯16.5溶解。取適量的萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)工作溶液 16.4，氮氣吹干，與試樣同法進(jìn)行衍生化。17.4 色譜條件色譜柱：5%苯基甲基聚硅氧烷彈性石英毛細(xì)管柱(30mx 0.25mmx 0.25 口 m),或相當(dāng)者。進(jìn)樣口溫度：300 Co柱溫程序：初溫150C，保持3min,然后以10C/min升至230C，保持10min,再以20C/min 升至280C保持10min。載氣：高純氦氣99.999%。流速：1.0mL/min，不分流進(jìn)樣。進(jìn)樣量：1.0丄。17.5 質(zhì)譜條件EI源：源溫230Co電子能量：70eV。接口溫度：280 Co電子倍增器電壓：1506V。質(zhì)量掃描范圍：30550Uo選擇離子監(jiān)測方式SIM。監(jiān)測離子m/z： 267、2