保健食品中西地那非和他達(dá)拉非快速檢測,膠體金免疫層析法

1、保健食品中西地那非和他達(dá)拉非快速檢測，膠體金免疫層析法(KJ202101)附件 1保健食品中西地那非和他達(dá)拉非的快速檢測膠體金免疫層析法(KJ202101) 1范圍本方法規(guī)定了保健食品中西地那非和他達(dá)拉非的膠體金免疫層析快速篩 查方法。 本方法適用于聲稱具有抗疲勞、調(diào)節(jié)免疫等功能的保健食品中西地那非和他達(dá)拉非成分的快速篩查。2 原理本方法采用競爭抑制免疫層析原理。樣品中的西地那非和他達(dá)拉非等物質(zhì)經(jīng)提取后與膠體金標(biāo)記的特異性抗體結(jié)合，抑制抗體和試纟氏條或檢測卡中檢 測線 (T 線)上抗原的結(jié)合，從而導(dǎo)致檢測線顏色深淺的變化。通過檢測線 與控制線(C線)顏色深淺比擬，對樣品中西地那非和他達(dá)拉非成分

2、進行定 性判定。3試劑材料 3. 1試劑除另有規(guī)定外，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T6682 規(guī)定的二級水。3. 1. 1 甲醇：色譜純。3. 1.2三輕甲基氨基甲烷， Tris 緘。3. 1. 3 濃鹽酸。3. 1. 4 吐溫-20 。3. 1.5鹽酸溶液：量取濃鹽酸(3.1.3)16. 7mL,用水溶解并稀釋至100mL。3. 1.6緩沖液：稱取 12. IgTris 緘(3.1.2),加適量水溶解，混勻，用鹽酸溶液(3.1.5)調(diào)節(jié)pH至&0,參加5? 0g吐溫-20 (3. 1.4)攪拌均勻，定容至 lOOOmLo3.2參考物質(zhì)參考物質(zhì)的中文名稱、英文名稱、 CAS 登

3、錄號、分子式、相對分子 量見 表1,純度均八99%。表1參考物質(zhì)信息表序號中文名稱英文名稱CAS登錄號分子式相對分子量1西地那非Sildenafi 1139755-83-2C22H30N604S474. 58序號中文名稱英文名稱 CAS登錄號分 子式相對分子量 2他達(dá)拉非Tadalafi 1171596-29-5C22H19N304389. 40 注：或等同可溯源物質(zhì)。3. 3標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 3.3. 1 西地那非標(biāo)準(zhǔn)儲藏液 (1.0mg/mL)： 精密稱取適量西地 那非參考物質(zhì) 3.2,用甲醇 溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度為 1.Omg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲藏液。 -2TC 避光保存，有效期

4、1 年。3. 3.2西地那非標(biāo)準(zhǔn)工作液 lOug/mL ：精密移取適量西地那非標(biāo)準(zhǔn)儲藏液1. Omg/mL 3. 3. 1分別置于 10mL 容量瓶中，用甲醇 3. 1.1稀釋至刻 度,搖勻，配制成濃度為10 y g/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。-20 ；避光保存，有效期3個月。3. 3. 3他達(dá)拉非標(biāo)準(zhǔn)儲藏液0. 5mg/mL:精密稱取適量他達(dá)拉非參考物質(zhì)3. 2,用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度為0. 5mg/niL的標(biāo)準(zhǔn) 儲藏液。 -2 TC 避光保存，有效期 1 年。3. 3. 4 他達(dá)拉非標(biāo)準(zhǔn)工作液 lOug/niL ： 精密移取適量他達(dá)拉非標(biāo)準(zhǔn)儲藏液 0. 5mg/mL3. 3.3分

5、別置于10mL容量瓶中,用甲醇3. 1. 1稀釋至刻 度，搖勻，制成濃度為10 u g/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。-2TC避光保存，有效期3個月。3. 4 材料西地那非膠體金免疫層析試劑盒及配套的試劑可選，適用基質(zhì)為保健食品。 他達(dá)拉非膠體金免疫層析試劑盒及配套的試劑可選，適用基質(zhì)為保健食品。4設(shè)備與儀器4. 1設(shè)備4. 1. 1天平：感量為0. lmg和0. Olgo4. 1 . 2渦族混合器。4. 1. 3 移液器:20-200 u L, 100-1000 uL, 5mL04. 1.4離心機：轉(zhuǎn)速可達(dá) 4000r/min 以上。4.2儀器 4. 2. 1讀數(shù)儀：產(chǎn)品配套可使用的檢測儀器可選。環(huán)境條

6、件：溫度10-40 C,相對濕度 W80%。5 分析步驟 5. 1 試樣制備液體樣品充分混勻，固體樣品充分粉碎混勻。5. 2試樣提取和凈化5. 2. 1液體基質(zhì)量取0. 5mL ±. 02mL試樣于15mL離心管中，參加4mL緩沖液,渦旋混合30s作為待測液。5. 2. 2固體基質(zhì)5. 2. 2. 1檢測西地那非準(zhǔn)確稱取試樣 0. 5g ±01g于15mL離心 管中， 力口 ImL甲醇，渦旋30s, 4000rpm離心2min或靜置加in。取250p L上清液于2mL離心管中，參加750卩L緩沖液3. 1.6,渦旋混合30s作為待測液。5. 2. 2. 2檢測他達(dá)拉非準(zhǔn)確稱

7、取試樣 0. 5g ±01g于15mL離心管中，加lmL甲 醇,渦旋30s, 4000rpm離心加in或靜置2min°取200n L上清液 于15mL離 心管中,參加3mL緩沖液3. 1.6,渦旋混合30s作為待測液。注：試樣提取和凈化 5.2過程可按照試劑盒說明書操作，不做限定。5. 3測定步驟5. 3. 1試紙條與金標(biāo)微孔測定步驟吸取 200八L樣品待測液于金標(biāo) 微孔中， 抽吸 510 次使混合均勻，室溫溫育 5min；溫育結(jié)束后， 將試紙條吸水海綿端垂直向下插入金標(biāo)微孔中， 室溫溫育 5min, 從微孔中 取出試纟氏條，去掉試紙條下端的吸水海綿，進行結(jié)果判定。注：測定

8、步驟建議按照試劑盒說明書。5. 3. 2檢測卡與金標(biāo)微孔測定步驟吸取 200 u L上述待測液于金標(biāo)微孔中，上下 抽吸 510次使混合均勻。室溫溫育 5mi n,將反響液全部參加到檢測卡的加樣孔中，將金標(biāo)微孔中全部溶液滴加到檢測卡上的加樣孔中，溫育 5min, 進行結(jié)果判定。注：測定步驟建議按照試劑盒說明書。5. 4質(zhì)控試驗每批樣品應(yīng)同時進行空白試驗和加標(biāo)質(zhì)控試驗。5. 4. 1空白試驗準(zhǔn)確稱取固體空白試樣 0. 5g ±01g或量取液體空白試樣0. 5mL ±. 02mL于15mL離心管中，按照5. 2和5. 3步驟與試樣同法操作。5. 4. 2加標(biāo)質(zhì)控試驗準(zhǔn)確稱取固體空

9、白試樣0. 5g ±Olg或量取液體空白試樣0. 5mL ±. 02mL于15mL離心管中，參加適量標(biāo)準(zhǔn)工作液 ,使西地 那非參 考物質(zhì)濃度為 l.On g/g 或 l.On g/mL, 按照 5. 2和 5. 3步驟與試樣 同法操作。準(zhǔn)確稱取固體空白試樣 0. 5g ± Olg或液體空白試樣0. 5mL d0. 02mL于15mL離 心管 中，參加適量標(biāo)準(zhǔn)工作液 ,使他達(dá)拉非參考物質(zhì)濃度為1. On g/g或1. On g/mL,按照5. 2和5. 3步驟與試樣同法操作°6 結(jié)果判定通過比照控制線 C 線和檢測線 T 線的顏色深淺進行結(jié)果判定。目視判定

10、示意圖見圖 1 。結(jié)果判定也可根據(jù)產(chǎn)品說明書進行。6.1 無效控制線 C 線不顯色，說明不正確操作或試纟氏條無效。6. 2陰性結(jié)果控制線C線顯色，檢測線T線顏色比控制線C線顏色深 或 檢測線T線顏色與控制線C線顏色相當(dāng)，均表示樣品中不含待測 組分或含量 低于方法檢測限，判為陰性。6. 3陽性結(jié)果控制線C線顯色，檢測線T線顏色比控制線C線顏色明 顯 淺或檢測線T線不顯色，均表示樣品中待測組分含量髙于方法檢測限，判為陽性。6. 4 質(zhì)控試驗要求空白試驗測定結(jié)果應(yīng)為陰性，加標(biāo)質(zhì)控試驗測定結(jié)果應(yīng)為陽性。1 目視判定示意圖 7 結(jié)論當(dāng)檢測結(jié)果為陽性時，應(yīng)對結(jié)果進行確證。8 性能指標(biāo) 8. 1 檢出限固體

11、樣品 l.Ong/g, 液體樣品 1.0ug/mLo8.2靈敏度靈敏度> 95%o8. 3特異性特異性 > 90%o8. 4假陰性率假陰性率 W5%。8. 5假陽性率假陽性率 W10%。注：性能指標(biāo)計算方法見附錄 A 。9 其他本方法分析步驟和結(jié)果判定可以根據(jù)廠家試劑盒的說明書進行，但應(yīng)符合或優(yōu)于本方法規(guī)定的性能指標(biāo)。本方法所述試劑、試劑盒信息及操作步驟是為給方法使用者提供方便，在使用本 方法 時不做限定。但方法使用者應(yīng)使用經(jīng)過驗證的滿足本方法規(guī)定的各項性 能指標(biāo)的 試劑、試劑盒。本方法參比標(biāo)準(zhǔn)為食品補充檢驗方法 BJS202110?保健食品中75種非法添加化 學(xué)藥物 的檢測?、藥

12、品檢驗補充檢驗方法 2021030?補腎壯陽類中成藥中 PDE-5型抑制 劑的快速檢測方法?。本方法使用西地那非試劑盒可能與那莫西地那非、 豪莫西地那非、 輕基豪莫西地 那非、 偽伐地那非、伐地那非、硫代艾地那非存在交叉反響；他達(dá)拉非試劑盒可能與氨基他達(dá)拉非、去甲基他達(dá)拉非存在交叉反響； 當(dāng)結(jié)果判定為陽性應(yīng)對結(jié)果進行確證。附錄A定性方法性能指標(biāo)計算表表 A. 1性能指標(biāo)計算方法樣品情況 a檢測結(jié)果b總數(shù)陽性陰性陽性 N11N12N1.=N11+N12陰性N21N22N2.二N21+N22總數(shù)N. 1 二 N11+N12N. 2 二 N21+N22N 二 Nl. +N2.或 N. 1+N. 2 顯著性差異 (c2)c2= ( % N12-N21%-1)2/( N12+N21)，自由度(df)二 1 靈敏度(p+, %)p+=Nll/Nl. 特異性 (p-, %)p-=N22/N2.假陰性率(pf-, %)pf-=N12/Nl.=100- 靈敏度假陽性率 (pf+, %)pf+=N21/N2. =100-特異性相對準(zhǔn)確度， %c (N11+N22) /(N1.+N2.)注：a由參比方法檢驗得到的結(jié)果或者樣品中實際的公議值結(jié)果；b由待確認(rèn)方法檢驗得到的結(jié)果。靈敏度的計算使用確