含氯釕(ii)多吡啶配合物的合成及其生物活性研究--洪冰

1、gdpu本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）含氯釕（11）多吡啶配合物的合成及其生物活性研究藥科學(xué)院藥學(xué)日語(yǔ)特色2008級(jí)0803504115黃宏靚2012年4月二級(jí)學(xué)院專 業(yè)班 級(jí) 學(xué)生 姓 名學(xué) 號(hào) 指導(dǎo)教師誠(chéng)信聲明我聲明，所呈交的畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）是本人在老師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及 取得的研允成果。據(jù)我査證，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文（設(shè) 計(jì)）屮不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的研宄成果，也不包含為獲得其他教育機(jī) 構(gòu)的學(xué)位或證書(shū)而使用過(guò)的材料。我承諾，論文（設(shè)計(jì)）中的所有內(nèi)容均真實(shí)、 可信。畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）作者（簽名）：_含氯釕(i i)多吡啶配合物的合成及其生物活性研究【摘要】本論文研究了多毗

2、啶金屬配合物ru(bpy)2(cpip)(c104)2、ru(phen)2(cpip)(c104)2、ru(dip)2(cpip)(c104)2的合成和它在生物活性方面的 研宄。對(duì)所合成的配合物進(jìn)行了表征，采用凝膠電泳研宄配合物與dna的作用， 采用mtt法研宂了配合物的體外細(xì)胞毒性，結(jié)果表明三個(gè)配合物能使dna發(fā)生裂 解，對(duì)體外細(xì)胞具有較強(qiáng)的毒性。另外，這些配合物能有效清除羥基自由基?！娟P(guān)鍵詞】釕(ii)配合物；抗氧化活性；抗腫瘤synthesis and bioactivity studies of ruthenium(ii)polypyridyl complexes containing

3、 chloride atomabstract three ruthenium(ii) polypyridyl complexes ru(bpy)2(cpip)(clo4)21、ru(phcn)2(cpip)(clo4)2 2, ru(dip)2(cpip)(clo4)23 were synthesized and characterized byelemental analysis ， es-ms and h nmr. the dna binding behaviors were studied byphotocleavage upon irradiation. the antioxidant

4、 activity against hydroxyl radical of the complexeswere investigated. the cytotoxicity in vitro towards a549，bel-7402, hela and skbr-3 werestudied by mtt assay. the results show that these complexes show high cytotoxic activity.keywords ruthenium (ii) complex antioxidant activity cytotoxicity invitr

5、o前言.1實(shí)驗(yàn)部分.5.儀器與試劑.51. 1.儀器.52.1.2.試劑.62.2.配體及配合物的制備.62.2.1.配體cpip的合成.62.2.2.配合物ru(dip)2(cpip)(c104)2、ru(bpy)2(cpip)(c104)2、ru(phcn)2(cpip)(c104)2的合成及純化.72.3.配合物的生物活性研宄.82.3.1.抗氧化性實(shí)驗(yàn).83.2.凝膠電泳實(shí)驗(yàn).82.體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn).8結(jié)果與討論.91.配合物合成與表征.9配合物的抗氧化性實(shí)驗(yàn).9配合物的凝膠電泳實(shí)驗(yàn).11配合物的體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn).12靴14參考文獻(xiàn).15翻.17隱.181前言核酸是生物體遺傳信息的載體

6、，參與生物遺傳信息在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)并合成代 謝過(guò)程所必須的蛋白質(zhì)和其它牛.物活性物質(zhì)，進(jìn)而控制生物體內(nèi)的各種反應(yīng)和調(diào) 節(jié)體內(nèi)生理機(jī)制。由于核酸介入了生物的成長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖等各種生命活動(dòng)，并 與致癌等病理過(guò)程密切相關(guān)。因此，研宄dna的結(jié)構(gòu)、功能及其與藥物的作用方 式等，將有助于人們戰(zhàn)勝各種疾病并從分子水平上揭開(kāi)生命現(xiàn)象的本質(zhì)1。自從20世紀(jì)60年代以來(lái)，無(wú)機(jī)化學(xué)與生物化學(xué)、有機(jī)化學(xué)、物理化學(xué)、分 析化學(xué)、醫(yī)學(xué)臨床化學(xué)、營(yíng)養(yǎng)化學(xué)、環(huán)境化學(xué)等學(xué)科相互滲透、相互融合，形成了諸如生物無(wú)機(jī)化學(xué)，金屬有機(jī)化學(xué)等具有廣闊前景的交叉學(xué)科。小分子金屬配 合物與dna相互作用的研宂正是生物無(wú)機(jī)化學(xué)的研宂熱點(diǎn)，它從分

7、子水平上研允dna與無(wú)機(jī)化合物相互作用的各種方式和作用機(jī)理，分析測(cè)定這些生物化合物結(jié) 構(gòu)和性能以及它們?cè)诨铙w中的作用的一門(mén)學(xué)科。自從1979年順鉑作為抗腫瘤藥物進(jìn)入臨床以來(lái)， 金屬配合物的合成以及抗 腫瘤活性研宄激起了科學(xué)家們極大的興趣，但是順鉑類合成的藥物具有毒副作用 十分明顯，如腎毒性、骨髓毒性、耳毒性、外周神經(jīng)毒性、催吐性及長(zhǎng)期使用產(chǎn) 生的耐藥性等等缺陷，極大地限制y這類藥物的發(fā)展。近年來(lái)研究者把目光轉(zhuǎn)向了非鉑類藥物的開(kāi)發(fā)，釕配合物便是艿中的佼佼者。釕是繼順鉑之后最有希望成 為活性高、毒性低的金屬之一。合成和發(fā)現(xiàn)高效低毒的抗癌藥物，研究其作用機(jī)理以及在分子和細(xì)胞水平上 研宂癌癥的起因，這

8、項(xiàng)工作在醫(yī)學(xué)，生物學(xué)，和化學(xué)等科學(xué)領(lǐng)域有著重要的理論 意義。這些年來(lái)，一類新型抗癌藥一一金屬配合物抗癌藥的研究，日益受到廣大 藥學(xué)工作者和化學(xué)工作者的重視，他們?cè)诶^續(xù)研究順鉑類藥物的同吋，還在蘇它 金屬類配合物抗癌藥等方面開(kāi)展了大量的工作。近年來(lái)，小分子配合物，尤其是含氯釕（11）多毗啶配合物與生物大分子dna相互作用的研宂已經(jīng)成為生物無(wú)機(jī)化學(xué)非?；钴S的研宂領(lǐng)域，并取得了許多舉世 矚目的成就。含氯釕（tt）多毗啶配合物可用作核酸結(jié)構(gòu)的探針、核酸非放射性的發(fā)光或電 化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物以及分子光開(kāi)關(guān)，它可幫助我們了解dna損傷和修復(fù)機(jī)理，對(duì)開(kāi) 發(fā)治療與基因突變有關(guān)疾病的藥物具有指導(dǎo)作用，這使得含氯釕（

9、ii）多毗啶配合 物在治療癌癥、艾滋病、某些遺傳性疾病以及抗菌消炎方面具奮潛在的應(yīng)用前景。金屬配合物與核酸相互作用的研究之所以引起無(wú)數(shù)科研工作者極大的研究 熱情，是因?yàn)榻饘倥浜衔锊粌H可以作為dna結(jié)構(gòu)探針，dna足跡試劑，特定dna系列的斷裂劑，還可作為潛在的抗癌藥物25。自從人類認(rèn)識(shí)到dna是細(xì)胞活動(dòng) 和功能的操控者6以來(lái)，大量的研究集屮在小分子物質(zhì)與dna相互作用這一領(lǐng)域。 而釕（tt）配合物能夠吸引如此眾多研宄者的注意不僅要?dú)w因于它們能與dna特 定的位置結(jié)合，還考慮到這類化合物能夠作為抗癌藥物7_13。事實(shí)上，很多抗癌、 抗瘧疾、抗病毒藥物的藥理活性都與藥物和dxa的作用有關(guān)f141，

10、因而很多研究 者將注意力集中到dna結(jié)合作用的機(jī)制上來(lái)。研允表明，釕（ii）配合物能通過(guò)共 價(jià)鍵和非共價(jià)鍵（包括靜電結(jié)合、溝槽結(jié)合、插入作用）與dna發(fā)生作用。近年來(lái), 釕（tt）配合物作為抗腫瘤藥物的研究被廣泛報(bào)道研究中發(fā)現(xiàn)一些釕（tt）多 毗啶配合物對(duì)某些特定的腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出良好的抗腫瘤活性。釕（11）多毗啶配合物在合成方面研宄較早，一開(kāi)始主要是為了研究相應(yīng)的光 化學(xué)、光物理、電化學(xué)等方而的性質(zhì)，但是，到了90年代中期，有報(bào)道化合物mer-ru（terpy）cl3（terpy為2,2，6,2-三聯(lián)毗陡）對(duì)ls/bl鼠腹水癌表現(xiàn)出活性15。 更令人欣喜的是，從90年代末期大量的多毗啶類配合物

11、被合成，常見(jiàn)的如ru（bpy）2（l） 2+（l = ip,pip, hpip, dppz等）（見(jiàn)圖1化合物7,8,9,10）,并且對(duì)這類 化合物進(jìn)行了bel-7402肝癌、hl-60白血病、kb鼻咽癌、hela宮頸癌等瘤株 的體外活性篩選，結(jié)果都表現(xiàn)出不同程度的活性，有的甚至與順鍆相當(dāng)16。中山大學(xué)計(jì)亮年研究小組對(duì)多吡啶類化合物的研究其為全面，從九十年代屮期就開(kāi)始 致力于釕多毗啶配合物的設(shè)計(jì)、合成及蘇生物活性研究pj。他們系統(tǒng)的合成了 數(shù)酉個(gè)釕配合物，并對(duì)其進(jìn)行了廣泛的體外活性篩選。 有研宄者把多毗啶釕配合 物與卟啉化合物鍵合,得到了釕的卟啾配合物，如ru（bpy）2（mpytpp）cl，m

12、pytp，p =四苯基卟啉18ru（bpy）2（mpy3m4hpp）cl，mpy3m4hpp = 3-甲氧基-4-羥基 四苯基卟啉19（見(jiàn)圖1化合物11，12）。由于卟啉及其金屬衍生物對(duì)腫瘤組織具 有特殊的親和力，能夠?qū)δ[瘤細(xì)胞實(shí)現(xiàn)靶向進(jìn)攻；并且由于卟啉環(huán)具奮強(qiáng)的親脂 性，能夠提高釕配合物的脂水分配系數(shù)，增強(qiáng)其透過(guò)細(xì)胞膜的能力。圖1多毗啶釕配合物的分子結(jié)構(gòu)金屬配合物與dna有多種結(jié)合方式，其屮共價(jià)結(jié)合是較強(qiáng)的方式。鉑系配合物大都是通過(guò)這種方式與dna分子交聯(lián)，從而干擾dna的生理功能，達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的目的。但是也有些金屬配合物如釕配合物與dna是非共價(jià)結(jié)合，包括插入作用、溝面結(jié)合和靜電作用等

13、模式，研究表明這些配合物能夠以插入、靜電和溝面結(jié)合三種方式與dna作用，其中插入模式最為重要,因?yàn)榕浜衔锏暮芏嘈再|(zhì)都與插入結(jié)合有關(guān)2q。本文屮提到三個(gè)新合成的含氯釕(ii)多毗啶配合物:ru(bpy)2(cpip)(clo4)2、ru(phen)2(cplp)(clo4)2 ru(dip)2(cpip)(c104)2,其 結(jié)構(gòu)分別如下圖2a、圖2b、圖2c。圖 2aru(bpy)2(cpip)(c104) )2hnnhn12圖2b ru(phen)2(cpip)(c104)20 2c ru(dip)2(cpip)(c104)22實(shí)驗(yàn)部分2.1儀器和試劑2.1.1儀器名稱型號(hào)廠家萬(wàn)分之一電子天平

14、cp3245德國(guó)sartorious旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器zqf-85a上海醫(yī)械專機(jī)廠循環(huán)水式多用真空泵shz-d(iii)天津華鑫儀器廠恒溫水浴鍋b220上海雅榮化工設(shè)備儀器有限公司恒溫磁力加熱攪拌器85-2金壇市宏華儀器廠電子節(jié)能控溫儀0607051河南豫華儀器有限公司電熱驚溫鼓風(fēng)干燥箱gzx-9140mbe上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療氮?dú)鉁p壓器yqd-6上海減壓器廠紫外分光光度計(jì)uv-2500pc島津series2.1.2試劑試劑規(guī)格廠家乙腈分析純天津市科盟化工工貿(mào)有限公司甲苯化學(xué)純天津市富宇精細(xì)化工有限公司乙醇分析純廣州化學(xué)試劑廠屮性氧化鋁100-200目上海試劑廠dna上海生工氨水分析純廣州化學(xué)試劑

15、廠乙醚分析純廣州化學(xué)試劑廠冰乙酸化學(xué)純汕頭光華化學(xué)廠乙酸銨分析純阿拉丁試劑有限公司對(duì)氯苯甲醛分析純阿拉丁試劑有限公司高氯酸鈉分析純上海潤(rùn)捷化學(xué)試劑廠2.2配體及配合物的制備2.2.1配體cpip的合成2. 2.1.1鄰菲咯啉_5,6-二酮合成路線將2.0 g鄰菲咯啉和2. 0溴化鉀拌勻置于圓底燒瓶中然后滴加冷的濃h2so4(20 ml)和濃hnos (20 ml)的混和酸，滴加完畢后維持溫度在80-85 c反應(yīng)3小時(shí)，冰水冷卻，將反應(yīng)液移到燒杯，加入適量的naoh溶液屮核至ph = 7左 右。用3 ru(bpy)2(cpip)(clo4)2、ru(dip)2(cplp)(c104)2,均為紅色

16、晶體。將合成的配合物進(jìn)行了質(zhì)譜分析，從圖 譜中看出配合物都出現(xiàn)了分子離子峰。其次質(zhì)譜以及核磁共振氫譜對(duì)配合物的表 征結(jié)果顯示，所合成的化合物與目標(biāo)配合物的結(jié)構(gòu)一致。3.2配合物的抗氧化性實(shí)驗(yàn)?zāi)芤l(fā)氧化還原反應(yīng)的自由基如羥基自由基、雙氧自由基會(huì)引起人體細(xì)胞內(nèi)dna的損傷。這種損傷會(huì)導(dǎo)致人的衰老和乜括腫瘤，慢性炎癥的等疾病。所 有的這些自由基當(dāng)中，羥基自由基被認(rèn)為是破壞性最強(qiáng)的一種。因此，消除這種 自由基是抗氧化性實(shí)驗(yàn)的主要目標(biāo)。我們依據(jù)化合物消除由fcton反應(yīng)產(chǎn)生的羥 基自由基能力的大小考察y這些化合物的抗氧化性能力。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表la、表lb、表lc所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示：表1 ru(phe

17、n)2(cpip)(c104)2抗氧化性數(shù)據(jù)phencpipconcentration (pm)absorbanceac-ao清除率ao0.01ac0.4310.421a12.50.0360.0626.2%a23.750.0770.15915.9%a35.00.1030.22122.1%a46.250.1680.37537.5%a57.50.2230.50650.6%a68.750.2630.60160.1%a7100.3220.74174.1%表2 ru(bpy)2(cpip)(c104)2抗氧化性數(shù)據(jù)bpycpipconcentration (pm)absorbanceac-ao清除率ao

18、0.011ac0.430.419a10.250.0210.0242.40%a20.750.0970.20520.50%a31.250.160.35635.60%a41.750.1960.44244.20%a52.250.240.54754.70%a62.750.2720.62362.30%a73.250.3120.71871.80%表3 rti(dip)2(cnp)(c104)2抗氧化性數(shù)據(jù)dipcpipconcentration (gm)absorbanceac-ao清除率ao0.01ac0.4280.418a11.250.0230.0313.10%a220.0480.0919.10%a32

19、.750.0750.15615.60%a43.50.110.23923.90%a54.250.1740.39239.20%a650.2980.68968.90%a75.750.3270.75875.80%pycpp phencpippcpip由結(jié)果圖3可以看出，ru(phen)2(cpip)(c104)2 ru(bpy)2(cpip)(c104)2和ru(diph(cpip爪c1o4)2抗氧化性能力，而且隨著配合物濃度的增大，抗氧化性能 力越來(lái)越強(qiáng)。3.3配合物的凝膠電泳實(shí)驗(yàn)瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)用于幫助了解小分子金屬配合物與dna作用機(jī)理，己有大量文獻(xiàn)報(bào)道了有關(guān)ru(ii,iii)、co(ii)

20、、cu(ii)等金屬配合物斷裂dna。當(dāng)配 合物以溝面或靜電作用與dna結(jié)合時(shí)，一般不會(huì)引起dna超螺旋的解旋。對(duì) 于以插入模式與dna結(jié)合的配合物，它們與雙螺旋dna具奮較強(qiáng)的結(jié)合能力， 并且含有一個(gè)具有氧化還原活性的中心金屬離子。這些配合物對(duì)氧化劑相對(duì)比較 穩(wěn)定，而對(duì)光則比較敏感，因此可以利用光輻射使這些配合物成為光裂解試劑， 產(chǎn)生單線態(tài)氧，或者脫去氫原子生成自由基，而使dna裂解。而dna分子在 高于其等電點(diǎn)的ph緩沖液屮帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)作用卜將向正極移動(dòng)。在凝膠屮 具有不同分子量的dna的遷移率是不同的，分子量越小，遷移率越大。而對(duì)于 不同構(gòu)型的dna，即使分子量相同，dna在電泳中的

21、遷移率也會(huì)明顯不同。如 質(zhì)粒dna中存在的三種構(gòu)型。其中共價(jià)閉環(huán)的超螺旋form i的結(jié)構(gòu)最為緊密， 遷移率最大，走在最前而。線形的form iii走在其次。而開(kāi)環(huán)缺刻的form ii由oooooooos s 7 76 6 5 5 4 4 3 3 2 2 1 10.250.751.251.752.252.753.25concentration (pm)fig. 3 scavenging ratio (%) of complexes 1 and 2 against hydroxyl radical.experiments wereperformed in trilicate.圖3配合物的抗氧化活

22、性圖于結(jié)構(gòu)比較松散，走在最后而。當(dāng)配合物以插入模式與超螺旋質(zhì)粒dna作用后，如果能引起dna閉環(huán)超螺旋的解旋，閉環(huán)form i就變成開(kāi)環(huán)缺刻的form ii構(gòu)型，使得dna在凝膠中的遷移率減小，直到超螺旋消失。當(dāng)超螺旋dna上的一條鏈上出現(xiàn)一個(gè)缺刻時(shí)，超螺旋結(jié)構(gòu)就被松開(kāi)，形成開(kāi)環(huán)缺刻型結(jié)構(gòu)。而當(dāng)兩條鏈在同一位置被斷裂時(shí)，就變成線形結(jié)構(gòu)。通過(guò)觀察pbr322 dna的三種構(gòu)型之間的轉(zhuǎn)化，就可以判斷配合物對(duì)dna的斷裂情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4。bpycpip (p.m)phencpip (jxm)dipcpip (p.m)由 圖4可 以 看 出 ， 在365 nm光 照45 min的 條 件 下 ，r

23、u(phen)2(cpip)(c104)2、ru(bpy)2(cpip)(clo4)2和ru(dip)2(ctip)(clo4)2能使dna發(fā)生有效斷裂，而且 隨著配合物濃度的增大，斷裂效果越來(lái)越明顯。3.4配合物的體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)我們采用mtt比色法測(cè)試了化合物對(duì)抗肺癌細(xì)胞(a-549)、肝癌細(xì)胞(bel-7402)、子宮頸癌細(xì)胞(hcla)、乳腺癌細(xì)胞(skbr-3)增殖的活性。mtt比色法，是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的方法。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測(cè)、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及腫瘤放射敏感性測(cè)定等。其檢測(cè)原理是：活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性mtt還原

24、為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚(formazan)并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功 能。二甲基亞砜(dmso)能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm波長(zhǎng) 處測(cè)定其光吸收值。由于在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，mtt結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成 正比，因此該方法可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。配合物對(duì)4種體外細(xì)胞(a-549、bel-7402、hela、skbr-3)毒性實(shí)驗(yàn)的ic5q數(shù)據(jù)見(jiàn)表2,其結(jié)果分別為圖5a、50厶03020-02520j55忿r(nóng)lpo0-63125 6 25 12 5 2550100 200concentration (pm)2000200080801 11 122 2t2t爰=3=36040

25、20604020bpycpep phoncpipadipcpcp1.2 2 1 13.3.6.2512.525concentration (um)00001 15050o o o o o o o o o o o o 2 2 0 0 8 8 6 6 4 4 2 210080604020003.125 6.2512.52550100concentration (um)phencjmp-a-apcpvok)2)ook)2)o o o 20486442048644 2 21 1 1 10 3.1256.25 12.5 2550 100 200concentration _p9了表征，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與理論計(jì)算

26、值基本一致；采用瓊脂糖凝膠電泳 研宂三個(gè)配合物與dna的作用，結(jié)果表明三個(gè)配合物在一定條件下能夠使dna發(fā)生裂解，通過(guò)mtt方法研究表明配合物對(duì)腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的抑制作用，抗 氧化性實(shí)驗(yàn)表明配合物能奮效清除羥基自由基。參考文獻(xiàn)2.%2.曾承輝.釕（tt）多毗啶配合物的合成、dna作用及抗腫瘤、 抗氧化活性研究d.廣州：廣東藥學(xué)院，2010.3.%2.k. e. erkkila，d. t. odem, j. k. barton, chem. rev. 1999, 99: 2777-2796.4.%2.y. j. liu, c.h. zeng, z. h. liang, j. h. yao, h.

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