國家基金申報書：惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的細(xì)胞表觀遺傳機(jī)制0-G---1

1、項(xiàng)目名稱：惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的細(xì)胞表觀遺傳機(jī)制首席科學(xué)家：尚永豐 北京大學(xué)起止年限：2011.1至2015.8依托部門：教育部二、預(yù)期目標(biāo)總體目標(biāo)：本項(xiàng)目瞄準(zhǔn)表觀遺傳學(xué)研究的前沿，整合國內(nèi)優(yōu)秀研究人員，系統(tǒng)深入地開展惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移的表觀遺傳學(xué)研究。本項(xiàng)目的總體目標(biāo)如下：闡明表觀遺傳關(guān)鍵機(jī)制即DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNA對基因表達(dá)調(diào)控的影響；明確表觀遺傳調(diào)控在乳腺癌、肺癌發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中的作用；揭示EMT過程中的表觀遺傳學(xué)變化及細(xì)胞重編程機(jī)制；闡明細(xì)胞微環(huán)境在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用及機(jī)制；整合各種信息數(shù)據(jù)，描繪乳腺癌、肺癌發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。通過本項(xiàng)目的實(shí)施，建

2、立和完善表觀遺傳學(xué)研究的新的技術(shù)體系，實(shí)現(xiàn)我國在生命科學(xué)及醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的理論創(chuàng)新，為惡性腫瘤預(yù)警、診斷、治療和藥物篩選提供新思路、新途徑和新靶標(biāo)，發(fā)現(xiàn)幾個潛在的可以用于乳腺癌、肺癌診斷的分子標(biāo)志物及藥物治療的分子靶標(biāo)，并在本項(xiàng)目的實(shí)施過程中建立一支具有國際競爭力的研究團(tuán)隊(duì)。五年預(yù)期目標(biāo)：1、 發(fā)現(xiàn)一批新的組蛋白修飾因子，探明組蛋白修飾與DNA甲基化之間相互作用的分子機(jī)制，篩選一批腫瘤相關(guān)ncRNA，鑒定一批具有潛在臨床應(yīng)用價值的腫瘤診斷及治療的新的ncRNA分子靶標(biāo)；鑒定一批新的EMT關(guān)鍵調(diào)控因子；發(fā)現(xiàn)針對轉(zhuǎn)移型乳腺癌、肺癌的新的有效治療靶點(diǎn)。2、 建立一整套適應(yīng)于惡性腫瘤表觀遺傳學(xué)研究的技術(shù)

3、平臺和技術(shù)體系。3、 培養(yǎng)一批中青年學(xué)術(shù)帶頭人和學(xué)術(shù)骨干；培養(yǎng)研究生（含碩、博）50名以上、博士后12名以上。4、 在國際一流雜志（IF>10）發(fā)表論文8篇以上，在有影響力的雜志（IF>5）上發(fā)表論文25篇以上。三、研究方案本項(xiàng)目分為六個課題，將全面系統(tǒng)地研究乳腺癌和肺癌發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移的表觀遺傳機(jī)制，為乳腺癌和肺癌的預(yù)防、診斷、治療提供分子標(biāo)志及藥物靶標(biāo)。前三課題分別從DNA甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA三個不同角度，分析腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中表觀遺傳學(xué)改變，研究其相互之間的作用關(guān)系及分子調(diào)控機(jī)理；第四課題將對腫瘤轉(zhuǎn)移過程中非常重要的現(xiàn)象即上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換的細(xì)胞重編程機(jī)制進(jìn)行探

4、討；第五課題從腫瘤微環(huán)境的角度，探討腫瘤微環(huán)境中基質(zhì)細(xì)胞及細(xì)胞因子對腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為尤其是侵襲轉(zhuǎn)移的影響；第六課題整合所有的信息，描繪乳腺癌和肺癌發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。六個部分各有側(cè)重，又緊密銜接，團(tuán)結(jié)合作，互相促進(jìn)。課題一：DNA甲基化變化在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中的作用本研究將篩選腫瘤細(xì)胞中高甲基化并失活的基因并分析其啟動子區(qū)域組蛋白的修飾狀況，探討DNA甲基化與組蛋白修飾的先后關(guān)系。篩選出影響DNA甲基化酶和DNA結(jié)合的關(guān)鍵性因子或蛋白；明確相關(guān)關(guān)鍵性因子或蛋白與DNA甲基化酶及DNA結(jié)合蛋白作用的分子機(jī)制，進(jìn)一步明確特定基因發(fā)生DNA甲基化的分子機(jī)制，進(jìn)而揭示組蛋白修

5、飾與DNA甲基化相互作用的分子機(jī)制。另外在腫瘤組織，CBX7等PcG蛋白的正常組合關(guān)系被破壞，并且這種PcG蛋白組合紊亂與腫瘤相關(guān)基因失活之間可能存在因果關(guān)系。本研究還將以多種器官的正常組織和腫瘤組織為對象，了解正常組織細(xì)胞中PcG蛋白的正常組合關(guān)系，研究這種正常組合關(guān)系破壞與腫瘤發(fā)生的關(guān)系及其與腫瘤相關(guān)基因組蛋白修飾、核小體定位和DNA甲基化發(fā)生的關(guān)系。表觀遺傳重編程不僅在體細(xì)胞去分化和獲得多能“干性”方面發(fā)揮關(guān)鍵性作用，也是細(xì)胞癌變過程中獲得無限增殖和侵襲/轉(zhuǎn)移能力的物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究將在開展腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)DNA甲基化組學(xué)研究的基礎(chǔ)上，篩選并鑒定出影響腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的關(guān)鍵性DNA甲基化變化位

6、點(diǎn)及其網(wǎng)絡(luò)，了解其在癌細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)移能力重編程過程中作用，建立預(yù)測惡性腫瘤轉(zhuǎn)移能力的表觀遺傳分子分型體系?？傮w研究方案如下：腫瘤DNA甲基化組和應(yīng)用研究DNA甲基化形成機(jī)制研究代表性腫瘤及非瘤組織標(biāo)本收集>500例腫瘤DNA甲基化組測定啟動子芯片基因功能分析生物信息學(xué)分析確定腫瘤發(fā)生/轉(zhuǎn)移/侵襲相關(guān)的甲基化網(wǎng)絡(luò)驗(yàn)證研究：大樣本患者隨訪、模式動物建立腫瘤轉(zhuǎn)移能力的DNA甲基化分型體系RLGS/MeDIP/Promoter array等方法分析腫瘤基因組甲基化譜式分析腫瘤細(xì)胞中異常甲基化的啟動子區(qū)域組蛋白修飾的狀況ProfileProfile篩選影響DNMT和DNA結(jié)合及組蛋白修飾的關(guān)鍵蛋白探

7、討關(guān)鍵蛋白活性和自身修飾的變化明晰特異基因發(fā)生DNA甲基化的分子機(jī)制和組蛋白修飾調(diào)控DNA甲基化的分子機(jī)制探明關(guān)鍵蛋白與DNMT和DNA結(jié)合蛋白相互作用的分子機(jī)制課題負(fù)責(zé)人：朱衛(wèi)國，北京大學(xué)學(xué)術(shù)骨干：鄧大君，北京大學(xué)伍會健，大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院課題二：組蛋白修飾異常在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中的作用本課題將常規(guī)方法和高通量技術(shù)相結(jié)合，從篩選乳腺癌和肺癌中新的組蛋白修飾調(diào)控因子及其復(fù)合物出發(fā)，逐步揭示所獲得的候選基因?qū)τ诮M蛋白修飾的作用和調(diào)控機(jī)理，并進(jìn)一步闡明這些基因在調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及其機(jī)制。將以功能基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的方法篩選乳腺癌和肺癌中發(fā)生突變或者表達(dá)異常

8、的組蛋白修飾酶以及轉(zhuǎn)錄因子，同時針對MLL1等相關(guān)的甲基化酶復(fù)合物組分，LSD1等去甲基化酶、EYA去磷酸化酶和磷酸化激酶、轉(zhuǎn)錄因子Smad4和ER及其轉(zhuǎn)錄輔助因子等，篩選新的組蛋白修飾基因或miRNA，利用各種蛋白質(zhì)間相互作用方法驗(yàn)證篩選獲得的組蛋白修飾復(fù)合物中各成員間的相互作用。利用基因過量表達(dá)和敲低/敲除技術(shù)、基因突變技術(shù)、組蛋白甲基化、磷酸化和乙?；治觥hIP-seq等技術(shù)檢測分離的組蛋白修飾因子對組蛋白修飾和基因表達(dá)的影響及其在基因表達(dá)調(diào)控中的分子機(jī)制。在此基礎(chǔ)上，利用動物模型和臨床標(biāo)本對組蛋白修飾候選因子在腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中的作用做深入分析?？傮w研究方案如下：組蛋白修飾異

9、常機(jī)制與腫瘤發(fā)生發(fā)展篩選新的組蛋白修飾復(fù)合物/因子甲基化酶、磷酸酶、Smad4和ER轉(zhuǎn)錄因子等相互作用分析組蛋白修飾分析靶基因表達(dá)分析建立腫瘤發(fā)生發(fā)展侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的組蛋白修飾網(wǎng)絡(luò)高通量芯片、酵母雙雜交、免疫沉淀-質(zhì)譜課題負(fù)責(zé)人：葉棋濃，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所學(xué)術(shù)骨干：楊曉，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所課題三：非編碼RNA在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中的作用研究ncRNA作用機(jī)制的一個關(guān)鍵就是鑒定與之相互作用的靶分子，特別是蛋白分子。本課題將以乳腺癌細(xì)胞系、腫瘤組織、腫瘤啟動細(xì)胞為模型，利用自主建立的RNA-SELEX-seq技術(shù)平臺系統(tǒng)地發(fā)現(xiàn)和鑒定與腫瘤相關(guān)蛋白（特別是其中的轉(zhuǎn)錄因子和表

10、觀修飾酶）發(fā)生相互作用的ncRNA；還將采用不同大小的ncRNA的cDNA文庫（size-fractioned RNA library）鑒定腫瘤啟動細(xì)胞特異的ncRNA。采用球囊形成實(shí)驗(yàn)、二維平皿及三維Matrigel培養(yǎng)以及免疫缺陷鼠體內(nèi)種植和腫瘤組織等研究體系，系統(tǒng)深入地研究ncRNA和蛋白間的相互作用、它們所構(gòu)成的結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)、調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、以及這些相互作用的生理功能，剖析ncRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在腫瘤發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中的作用與意義。與此同時，選擇其中一些有重要功能的ncRNA，結(jié)合大量的腫瘤患者的標(biāo)本及臨床資料，研究將其作為藥靶或生物標(biāo)記物的可能性。非編碼RNA與腫瘤發(fā)生發(fā)展研究腫瘤相關(guān)蛋白結(jié)合的ncR

11、NA的研究闡明ncRNA-蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系RNA-SELEX-seq技術(shù)平臺鑒定與腫瘤相關(guān)蛋白結(jié)合的ncRNASize-fractioned RNA library鑒定腫瘤啟動細(xì)胞特異ncRNA探討ncRNA-蛋白相互作用及對相關(guān)信號通路的調(diào)控利用體外培養(yǎng)、免疫缺陷小鼠腫瘤移植、腫瘤病理組織檢測等進(jìn)行功能研究課題負(fù)責(zé)人：宋旭，四川大學(xué)學(xué)術(shù)骨干：宋爾衛(wèi)，中山大學(xué)李沁桐，四川大學(xué)課題四：上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換的機(jī)理及惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的細(xì)胞重編程機(jī)制以乳腺癌細(xì)胞系、腫瘤組織及癌旁正常組織為模型，探討EMT的細(xì)胞重編程作用機(jī)理及其在乳腺癌轉(zhuǎn)移及化療藥物耐受中的作用。選取永生化的正常乳腺細(xì)胞系（如

12、MCF-10A），ER陽性低轉(zhuǎn)移性細(xì)胞系（如MCF-7，T47-D等），ER陰性高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系（如MDA-MB-231，SUM1315等），以及ER陽性但對三苯氧胺耐藥的BT-474細(xì)胞等為主要細(xì)胞模型，并通過lentivirus介導(dǎo)的shRNA抑制或過表達(dá)E-cadherin在這些細(xì)胞系中分別誘導(dǎo)或抑制EMT表型。比較不同細(xì)胞系在EMT前后其基因表達(dá)譜變化，用MeDIP-seq法比較基因組范圍內(nèi)DNA甲基化變化情況，并用ChIP-seq法比較與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的主要的組蛋白修飾標(biāo)志如激活性的組蛋白乙?；?、H3K4甲基化，抑制性的H3K9，H3K27，H4K20甲基化等在全基因組范圍內(nèi)的分布變化規(guī)律。在

13、此基礎(chǔ)上，對差異表達(dá)的新基因及特異性組蛋白修飾酶在EMT以及在乳腺癌轉(zhuǎn)移及藥物耐受中的作用做深入分析。同時，選取兩種以上高轉(zhuǎn)移性細(xì)胞系，以TGFb或TNFa刺激細(xì)胞或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染b-catenin分別激活TGFb、NFkB以及Wnt信號通路誘導(dǎo)EMT。用基因表達(dá)譜、蛋白質(zhì)譜及全蛋白磷酸化譜分析在三種條件下共同變化的靶基因及蛋白分子。這些共同通路分子是各信號通路間的交互作用節(jié)點(diǎn)及潛在的EMT關(guān)鍵調(diào)控因子，對它們的作用機(jī)理進(jìn)行進(jìn)一步細(xì)胞及分子水平上的分析。建立可誘導(dǎo)表達(dá)熒光標(biāo)記的E-cadherin或其它EMT誘導(dǎo)因子的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，以在細(xì)胞及分子水平上實(shí)時觀察細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的改變對EMT及細(xì)胞轉(zhuǎn)移能

14、力的影響。總體研究方案如下：上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換的機(jī)理及表觀遺傳機(jī)制建立低轉(zhuǎn)移性、高轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞系及人工改變E-cadherin水平誘導(dǎo)或抑制EMT后的細(xì)胞系以TGFb或TNFa刺激細(xì)胞或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染b-catenin分別誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生EMTMeDIP-seq檢測DNA甲基化變化ChIP-seq檢測主要轉(zhuǎn)錄相關(guān)組蛋白修飾基因表達(dá)譜差異磷酸化修飾蛋白質(zhì)組學(xué)差異蛋白質(zhì)譜差異差異表達(dá)基因總體特征分析病毒介導(dǎo)的穩(wěn)定過表達(dá)及shRNA抑制候選基因后，細(xì)胞表型及小鼠乳腺癌轉(zhuǎn)移模型的行為變化功能域分析；質(zhì)譜檢測并驗(yàn)證相互作用蛋白；靶基因檢測；與已知EMT基因關(guān)系新基因功能分析及特異性組蛋白修飾酶在EMT中的作用尋找

15、高轉(zhuǎn)移性乳腺癌及對現(xiàn)有化療藥物不敏感性的乳腺癌的治療靶點(diǎn)課題負(fù)責(zé)人：尚永豐，北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部學(xué)術(shù)骨干：梁靜，北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部張華，中國航天員科研訓(xùn)練中心課題五：細(xì)胞微環(huán)境與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移以乳腺癌為模型，分別從腫瘤細(xì)胞微環(huán)境中的腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞、浸潤的免疫細(xì)胞（腫瘤相關(guān)性巨噬細(xì)胞）和基質(zhì)分子（細(xì)胞因子TGF）入手，研究腫瘤微環(huán)境對腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為尤其是侵襲轉(zhuǎn)移的影響。分離乳腺良性增生患者及各種不同類型不同分期的乳腺癌患者組織微環(huán)境中的成纖維細(xì)胞及腫瘤相關(guān)性巨噬細(xì)胞，分析miRNA及mRNA的表達(dá)譜；研究這些差異表達(dá)的基因或miRNA對成纖維細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響；建立三維細(xì)胞

16、培養(yǎng)模型，將腫瘤細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)，盡量模擬體內(nèi)環(huán)境，并應(yīng)用免疫分子及免疫細(xì)胞缺陷小鼠構(gòu)建小鼠骨髓嵌合體動物模型，研究這些差異表達(dá)的基因或miRNA對共培養(yǎng)后腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響；采用基因工程小鼠模型，從分子、細(xì)胞、動物三個層面研究TGF信號通路在腫瘤微環(huán)境中與REGg蛋白酶體激活因子、p53等重要腫瘤因子動態(tài)相互作用及其動態(tài)調(diào)控的分子機(jī)制。在解析這些調(diào)控機(jī)制的生理病理意義的基礎(chǔ)上，通過腫瘤模型研究進(jìn)一步闡明腫瘤微環(huán)境中重要生物學(xué)因子對腫瘤發(fā)生發(fā)展的決定性作用。具體方案如下： mRNA及miRNA表達(dá)譜分析正常乳腺組織及不同類型的乳腺癌組織建立基質(zhì)細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的三維細(xì)胞培養(yǎng)模型明確基

17、質(zhì)細(xì)胞的基因/miRNA對腫瘤轉(zhuǎn)移的影響腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)TGF信號通路/REGg-蛋白酶體動物水平Smad2亞等位基因表達(dá)小鼠模型闡明REGg-蛋白酶體與TGF信號通路間的相互作用細(xì)胞微環(huán)境與腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移基質(zhì)細(xì)胞、細(xì)胞因子在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用分子、細(xì)胞水平基因/miRNA的功能研究基因敲除建立腫瘤與細(xì)胞微環(huán)境網(wǎng)絡(luò)體系腫瘤相關(guān)性巨噬細(xì)胞免疫缺陷小鼠骨髓嵌合體動物模型構(gòu)建 課題負(fù)責(zé)人：劉芝華，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所學(xué)術(shù)骨干：李曉濤，華東師范大學(xué)生命科學(xué)研究所曲春楓，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所課題六：惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)利用腫瘤基因表達(dá)和表觀遺傳學(xué)數(shù)據(jù)，采用

18、計算生物學(xué)方法推測在惡性腫瘤、干細(xì)胞中發(fā)生變化的表觀遺傳學(xué)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。為了更深入地研究腫瘤發(fā)生發(fā)展過程的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，還需要從以下幾個方面進(jìn)一步發(fā)展基于貝葉斯網(wǎng)絡(luò)的因果推斷方法。（1）考慮到實(shí)驗(yàn)方法與手段的多樣性，需要開發(fā)能夠自動整合并利用多個異質(zhì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的因果推斷方法。這部分工作涉及去除反映單個數(shù)據(jù)源自身特征的背景信號，子網(wǎng)絡(luò)的拼接與集成，觀測型實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與(基因敲除、RNA沉默等)干預(yù)型實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的因果信息集成等多個問題；（2）通過開發(fā)根據(jù)數(shù)據(jù)特征自適應(yīng)地調(diào)整網(wǎng)絡(luò)正則化參數(shù)的學(xué)習(xí)算法等方式，以解決如何在具有較高噪聲和不精確性的系統(tǒng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中進(jìn)行可靠因果推斷的實(shí)際問題。對于大規(guī)模因果推斷問題

19、，使用現(xiàn)有的貝葉斯因果推斷方法，還面臨有限的數(shù)據(jù)資源與急劇增大的網(wǎng)絡(luò)搜索空間的矛盾。為了保證學(xué)習(xí)結(jié)果的魯棒性，我們擬開發(fā)一系列能保持因果關(guān)系的特征選擇方法來解決這個問題。（3）不同系統(tǒng)生物學(xué)因素之間的上下游作用關(guān)系可能會隨腫瘤發(fā)生與發(fā)展的過程而動態(tài)地發(fā)生變化，為此我們擬開發(fā)能夠正確推斷這種動態(tài)關(guān)系的貝葉斯網(wǎng)絡(luò)學(xué)習(xí)算法。因?yàn)槟[瘤細(xì)胞有很多具有干細(xì)胞特性，且目前所掌握的胚胎干細(xì)胞數(shù)據(jù)比腫瘤數(shù)據(jù)更豐富也更系統(tǒng),我們將在惡性腫瘤與干細(xì)胞中分別預(yù)測基因表達(dá)與表觀調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)一步比較其異同。通過干擾預(yù)測的上游調(diào)控節(jié)點(diǎn)后以ChIP-PCR和ChIP-seq技術(shù)對下游節(jié)點(diǎn)進(jìn)行檢測，對以上預(yù)測模型中的關(guān)鍵調(diào)控

20、關(guān)系進(jìn)行驗(yàn)證。為了通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證貝葉斯網(wǎng)絡(luò)模型推測出來的因果關(guān)系，我們將把它們作為遺傳學(xué)的上下游關(guān)系處理。這樣就可以人為地提高或降低上游事件的水平，例如，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合或者其他組蛋白修飾水平，而后觀察下游事件，如基因表達(dá)，或者組蛋白或DNA修飾的水平的變化，來證實(shí)我們所預(yù)測的因果關(guān)系。以組蛋白甲基化修飾作用為例，甲基化轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶是可用于干擾網(wǎng)絡(luò)中的特定節(jié)點(diǎn)。譬如我們要證實(shí)H3K27me3抑制基因表達(dá)這一關(guān)系，我們可以通過抑制正常細(xì)胞或者癌細(xì)胞的組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶或者去甲基化酶來調(diào)節(jié)H3K27me3水平，從而觀察下游基因表達(dá)水平的變化（圖2）。實(shí)際上，一些已報道的因果關(guān)系正是利用上述方法和遺

21、傳突變在模式生物或細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的。驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子對某種組蛋白修飾的作用可以通過過表達(dá)或者RNAi轉(zhuǎn)錄因子來直接觀察到。我們將通過過表達(dá)或者RNAi 分別上調(diào)或者下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子，然后利用ChIP-qPCR技術(shù)檢測一些已知的修飾位點(diǎn)或者利用ChIP-seq技術(shù)在全基因水平檢測轉(zhuǎn)錄因子對全基因組范圍內(nèi)組蛋白修飾的影響。圖2：如何通過干擾上游調(diào)控節(jié)點(diǎn)并以ChIP-PCR和ChIP-seq技術(shù)檢測下游基因驗(yàn)證預(yù)測模型中的關(guān)鍵調(diào)控關(guān)系具體方案如下：染色質(zhì)與組蛋白的多種表觀遺傳學(xué)修飾關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子與基因的調(diào)控關(guān)系轉(zhuǎn)錄因子的ChIP-seq實(shí)驗(yàn)基因表達(dá)譜差異分析染色質(zhì)構(gòu)型分析表觀遺傳因子ChIP-seq實(shí)驗(yàn)絕緣子

22、的基因組分布表觀遺傳因子的基因組分布轉(zhuǎn)錄因子的目標(biāo)基因分布染色質(zhì)空間形態(tài)與DNA、組蛋白修飾的因果調(diào)控網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子與目標(biāo)基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)多因素SNP與GWAS分析：鑒定腫瘤發(fā)病相關(guān)的重要基因突變相互關(guān)系惡性腫瘤發(fā)病因素預(yù)測的因果網(wǎng)絡(luò)模型RNAi與基因敲除研究：驗(yàn)證腫瘤發(fā)病相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子與基因的影響范圍惡性腫瘤高通量數(shù)據(jù)的整合與網(wǎng)絡(luò)的計算預(yù)測課題負(fù)責(zé)人：韓敬東，中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所學(xué)術(shù)骨干：吳旻，武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院四、年度計劃研究內(nèi)容預(yù)期目標(biāo)第一年1） 多種手段研究肺癌細(xì)胞腫瘤抑制基因甲基化狀況，開展腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)DNA甲基化標(biāo)志物研究；開展PcG蛋白表達(dá)變異與腫瘤抑制基因表觀遺傳失

23、活關(guān)系研究；2） 利用高通量芯片、ChIP-Chip、ChIP-seq、酵母雙雜交、免疫沉淀結(jié)合質(zhì)譜等技術(shù)，針對TGF和雌激素信號通路相關(guān)因子，如轉(zhuǎn)錄因子Smad4、ER及其轉(zhuǎn)錄輔助因子，篩選新的組蛋白修飾基因或miRNA；3） 利用RNA-SELEX-seq等技術(shù)平臺系統(tǒng)篩選鑒定與腫瘤相關(guān)蛋白相互作用的ncRNA；檢測ncRNA的表達(dá)譜； 4） 誘導(dǎo)或抑制EMT表型。比較不同細(xì)胞系在EMT前后其基因表達(dá)譜變化，用MeDIP-seq法比較基因組范圍內(nèi)DNA甲基化變化情況，并用ChIP-seq法比較與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的主要的組蛋白修飾標(biāo)志如激活性的組蛋白乙酰化、H3K4甲基化，抑制性的H3K9，H3K2

24、7，H4K20甲基化等在全基因組范圍內(nèi)的分布變化規(guī)律。5） 分離乳腺良性增生患者及乳腺癌患者微環(huán)境中的成纖維細(xì)胞、浸潤巨噬細(xì)胞、浸潤的單核巨噬細(xì)胞，分析miRNA及mRNA的表達(dá)譜，研究不同類型的乳腺癌以及不同侵襲轉(zhuǎn)移能力的乳腺癌中上皮細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)譜差異；6） 開發(fā)能夠自動整合并利用多個異質(zhì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的因果推斷方法。包括去除反映單個數(shù)據(jù)源自身特征的背景信號，子網(wǎng)絡(luò)的拼接與集成，觀測型實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與(基因敲除、RNA沉默等)干預(yù)型實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的因果信息集成等多個問題。1） 找出有代表性的腫瘤抑制基因，分析甲基化譜，篩選出一組腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)DNA甲基化標(biāo)志物；掌握腫瘤組織中多種PcG蛋白表達(dá)變異規(guī)律；

25、2） 獲得新的組蛋白修飾組分；3） 篩選出一批腫瘤相關(guān)的ncRNA；并確定ncRNA及相關(guān)蛋白的表達(dá)譜；4） 優(yōu)化EMT表型誘導(dǎo)條件，完成基因表達(dá)譜及MeDIP-seq，ChIP-seq法比較DNA甲基化及主要組蛋白修飾譜變化實(shí)驗(yàn)；5） 發(fā)現(xiàn)與腫瘤發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移相關(guān)的不同間質(zhì)細(xì)胞的表型特征，以及一些重要的免疫相關(guān)蛋白、間質(zhì)細(xì)胞中miRNA及mRNA的表達(dá)改變；6） 建立能夠自動整合并利用多個異質(zhì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，適用于大規(guī)模高噪聲的組學(xué)數(shù)據(jù)的因果推斷方法，并開發(fā)為計算軟件。第二年1） 分析圍繞甲基化基因啟動子周圍的組蛋白修飾狀況，開展核小體在DNA甲基化擴(kuò)展過程中的作用研究；開展腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)甲基化標(biāo)志

26、物多中心驗(yàn)證研究；2） 利用免疫共沉淀、GST pull-down、細(xì)胞內(nèi)共定位等蛋白質(zhì)間相互作用技術(shù)驗(yàn)證篩選獲得的組蛋白修飾復(fù)合物中各成員間的相互作用，定位相互作用的結(jié)構(gòu)域/區(qū)域。3） 研究篩選到的ncRNA與蛋白質(zhì)、DNA或RNA等生物大分子的相互作用；4） 對克隆得到的新的潛在EMT調(diào)控因子用分子生物學(xué)及細(xì)胞生物學(xué)的手段進(jìn)行功能分析；5） 通過基因過表達(dá)或敲降的方法，研究差異表達(dá)的基因或miRNA對成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響，尤其是腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響；6） 對于大規(guī)模因果推斷問題，使用現(xiàn)有的貝葉斯因果推斷方法，還面臨有限的數(shù)據(jù)資源與急劇增大的網(wǎng)絡(luò)搜索空間的矛

27、盾。為了保證學(xué)習(xí)結(jié)果的魯棒性，我們擬開發(fā)一系列能保持因果關(guān)系的特征選擇方法來解決這個問題。1） 探明組蛋白修飾與甲基化DNA之間的關(guān)聯(lián)性，證明核小體在DNA甲基化擴(kuò)展過程中的作用；2） 明確組蛋白修飾復(fù)合物中各成員間的相互作用及其相互作用方式；3） 初步確定ncRNA的作用靶點(diǎn)，特別是與蛋白的相互作用；4） 發(fā)現(xiàn)一些新的潛在EMT調(diào)控因子；5） 發(fā)現(xiàn)幾個間質(zhì)細(xì)胞來源的與腫瘤發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的新的分子；6） 建立能夠自動進(jìn)行因果關(guān)系的特征選擇方法，并開發(fā)為計算軟件。探索推斷腫瘤發(fā)生與發(fā)展動態(tài)關(guān)系的方法；7） 發(fā)表5-6篇IF>5的研究論文,1-2篇IF>10的研究論文。申請專利

28、1-2項(xiàng)。第三年1） 研究影響DNA甲基化和組蛋白修飾的關(guān)鍵酶，找出連接甲基化與組蛋白的蛋白。在不同病變?nèi)梭w組織中腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因DNA甲基化形成、擴(kuò)展和維持規(guī)律研究；2） 利用基因過量表達(dá)和敲低/敲除技術(shù)、組蛋白修飾等分析技術(shù)檢測組蛋白修飾因子對組蛋白修飾的影響及不同修飾間的相互影響。檢測組蛋白修飾候選因子對TGF、雌激素信號通路等相關(guān)的下游靶基因表達(dá)的影響。確定組蛋白修飾復(fù)合物中各成員間物理上的相互作用與功能上的相互作用的關(guān)系；3） 研究ncRNA在表觀遺傳修飾和轉(zhuǎn)錄水平上對基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用；以及ncRNA相關(guān)的信號調(diào)控通路；4） 對克隆得到的新的潛在EMT調(diào)控因子用分子生物學(xué)及細(xì)胞生物

29、學(xué)的手段進(jìn)行功能分析；5） 發(fā)展三維細(xì)胞培養(yǎng)模式，將腫瘤細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)，盡量模擬體內(nèi)環(huán)境，研究這些差異表達(dá)的基因或miRNA對共培養(yǎng)后腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響，探討改變細(xì)胞微環(huán)境對腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的影響；6） 在惡性腫瘤與干細(xì)胞中分別預(yù)測基因表達(dá)與表觀調(diào)控網(wǎng)絡(luò),并進(jìn)一步比較其異同。進(jìn)一步通過自動文獻(xiàn)檢索來檢驗(yàn)網(wǎng)絡(luò)的準(zhǔn)確性。1） 初步論證連接DNA甲基化與組蛋白修飾的關(guān)鍵蛋白和酶。聯(lián)系得到一組能夠準(zhǔn)確預(yù)測腫瘤轉(zhuǎn)移能力的DNA甲基化標(biāo)志物；2） 明確組蛋白修飾候選因子對組蛋白修飾和基因表達(dá)的影響；3） 發(fā)現(xiàn)腫瘤相關(guān)蛋白與ncRNA間相互作用對基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用及具體的分子機(jī)制；4） 建立單核巨

30、噬細(xì)胞特定基因敲除或過表達(dá)的小鼠乳腺癌模型；5） 發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤與干細(xì)胞中分別預(yù)測基因表達(dá)與表觀調(diào)控網(wǎng)絡(luò),的異同；6） 發(fā)表5-6篇IF>5的研究論文,1-2篇IF>10的研究論文。申請專利1-2項(xiàng)。第四年1） 研究DNA甲基化與組蛋白修飾的先后及其相互影響的機(jī)制，開展腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)甲基化標(biāo)志物生物學(xué)功能基礎(chǔ)研究；2） 以過量表達(dá)、RNA干擾和染色體免疫沉淀等技術(shù)手段增加或者降低組蛋白修飾候選因子在細(xì)胞內(nèi)的含量，檢測候選因子對組蛋白修飾復(fù)合物中各成分的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響、對組蛋白修飾酶在靶基因序列上募集的影響和對組蛋白修飾酶活性的影響；3） 利用細(xì)胞模型和裸鼠動物模型系統(tǒng)研究nc

31、RNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用；4） 繼續(xù)進(jìn)行EMT相關(guān)新基因功能分析，并根據(jù)分子生物學(xué)的研究成果，建立必要的動物模型，研究新的EMT調(diào)控分子過表達(dá)或基因敲除后對乳腺癌轉(zhuǎn)移的影響；5） 利用小鼠骨髓嵌合體和乳腺癌動物模型，研究腫瘤相關(guān)間質(zhì)細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的發(fā)展與轉(zhuǎn)移能力的影響。繼續(xù)研究化學(xué)致癌劑在腫瘤易發(fā)及對照小鼠中誘導(dǎo)特定的癌癥模型并研究其病理生理特征以及相關(guān)分子機(jī)制。原位ATC腫瘤異種移植模型的腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制研究；6） 通過干擾預(yù)測的上游調(diào)控節(jié)點(diǎn)后以ChIP-PCR和ChIP-seq技術(shù)對下游節(jié)點(diǎn)進(jìn)行檢測，對貝葉斯網(wǎng)絡(luò)模型推測出的關(guān)鍵調(diào)控關(guān)系進(jìn)行驗(yàn)證。1） 確定影響DNA甲基化與組蛋白修飾的蛋白

32、作用機(jī)制，確定DNA甲基化標(biāo)志物影響腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的機(jī)制；2） 確定組蛋白修飾候選因子在基因表達(dá)調(diào)控中的分子機(jī)制；3） 發(fā)現(xiàn)腫瘤相關(guān)蛋白與ncRNA間的相互作用在細(xì)胞生長、分化、腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中的作用；4） 原位ATC腫瘤異種移植模型的腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制研究取得重大進(jìn)展；5） 驗(yàn)證并估算得到貝葉斯網(wǎng)絡(luò)的預(yù)測準(zhǔn)確性；6） 發(fā)表5-6篇IF>5的研究論文,1-2篇IF>10的研究論文。申請專利1-2項(xiàng)。第五年1） 探討表觀遺傳調(diào)控的新機(jī)制，建立測定腫瘤轉(zhuǎn)移能力的DNA甲基化分型；進(jìn)行DNA甲基化標(biāo)志物診斷試劑盒開發(fā)；2） 利用基因過量表達(dá)和敲低/敲除技術(shù)，在體外細(xì)胞水平和體內(nèi)小鼠腫瘤模

33、型中檢測篩選到的候選分子對腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移以及EMT的影響，檢測候選分子對細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的能力。利用小鼠基因敲除模型，檢測組蛋白修飾因子及其調(diào)節(jié)的靶分子在體內(nèi)組織水平上的改變模式，利用免疫組織化學(xué)等技術(shù)檢測某些候選分子及相應(yīng)的組蛋白修飾在腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中的臨床意義；3） 系統(tǒng)深入地研究ncRNA和蛋白間的相互作用、它們所構(gòu)成的結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)、調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、以及這些相互作用的生理功能，剖析ncRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在腫瘤發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中的作用與意義；4） 繼續(xù)進(jìn)行功能分析實(shí)驗(yàn)，并在乳腺癌腫瘤病人標(biāo)本中驗(yàn)證研究所得的EMT關(guān)鍵分子與腫瘤治療反應(yīng)及預(yù)后的關(guān)系，篩選有診斷意義的分子標(biāo)志；5） 通過體內(nèi)

34、外實(shí)驗(yàn)，闡明在腫瘤微環(huán)境中，促進(jìn)單核細(xì)胞浸潤和分化發(fā)育成為不同類型巨噬細(xì)胞的調(diào)控因素，及不同微環(huán)境下不同的巨噬細(xì)胞亞群影響乳腺細(xì)胞以及乳腺腫瘤細(xì)胞增殖和行為特征機(jī)制；6） 利用ChIP-seq技術(shù)在全基因水平檢測轉(zhuǎn)錄因子對全基因組范圍內(nèi)組蛋白修飾的影響。并在加入新的ChIP-seq數(shù)據(jù)后重建并改進(jìn)貝葉斯網(wǎng)絡(luò)模型。1） 開發(fā)出1-2個預(yù)測腫瘤轉(zhuǎn)移能力的DNA甲基化標(biāo)志物診斷試劑盒；2） 確定組蛋白修飾候選因子在腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中的作用；3） 提出ncRNA作用機(jī)制的新假說，探討在細(xì)胞中是否存在一個通過RNA-蛋白相互作用而構(gòu)成的結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)和信息調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。為腫瘤診斷與治療提供新的理論基礎(chǔ)和nc

35、RNA分子靶標(biāo)；4） 篩選出1-2個對乳腺癌治療及預(yù)后具有診斷意義的分子標(biāo)志；5） 闡述在腫瘤微環(huán)境中，間質(zhì)細(xì)胞及分子對腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移影響及作用的分子機(jī)制，從間質(zhì)細(xì)胞角度尋找阻斷腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的靶分子；6） 進(jìn)一步驗(yàn)證并估算貝葉斯網(wǎng)絡(luò)的預(yù)測準(zhǔn)確性。并基于新的ChIP-seq數(shù)據(jù)得到改進(jìn)的貝葉斯網(wǎng)絡(luò)模型。7） 發(fā)表5-6篇IF>5的研究論文,1-2篇IF>10的研究論文,申請專利1-2項(xiàng)。一、研究內(nèi)容主要研究內(nèi)容1、 表觀遺傳重編程不僅在體細(xì)胞去分化和獲得多能“干性”方面發(fā)揮關(guān)鍵性作用，也是細(xì)胞癌變過程中獲得無限增殖和侵襲/轉(zhuǎn)移能力的物質(zhì)基礎(chǔ)。本項(xiàng)目擬在開展轉(zhuǎn)移相關(guān)DNA甲基化

36、組學(xué)研究的基礎(chǔ)上，篩選并鑒定出影響乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的關(guān)鍵性DNA甲基化變化位點(diǎn)及其網(wǎng)絡(luò)，了解其在乳腺癌細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)移能力重編程過程中作用，建立預(yù)測乳腺癌等惡性腫瘤轉(zhuǎn)移能力的表觀遺傳分子分型體系。以腫瘤高甲基化基因1（Hic1）為目標(biāo)，以III類組蛋白去乙?；窼IRT1為對象，探討SIRT1作為組蛋白去乙?；笇M蛋白修飾及其對DNA甲基化酶和DNA結(jié)合蛋白相關(guān)因子的作用，篩選影響DNA甲基化酶和DNA結(jié)合蛋白的關(guān)鍵性因子；明確相關(guān)關(guān)鍵性因子與DNA甲基化酶和DNA結(jié)合蛋白作用的分子機(jī)制，進(jìn)一步闡明Hic1基因發(fā)生DNA甲基化的分子機(jī)制，進(jìn)而揭示組蛋白修飾和DNA甲基化的相互作用關(guān)系。探討逆轉(zhuǎn)

37、DNA甲基化在腫瘤治療中的臨床應(yīng)用價值，在明確“腫瘤組織DNA異常甲基化-基因表達(dá)變異-腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移功能”關(guān)系的基礎(chǔ)上，確定乳腺癌和肺癌轉(zhuǎn)移能力的關(guān)鍵性DNA甲基化變異位點(diǎn)及其網(wǎng)絡(luò)，建立腫瘤轉(zhuǎn)移能力的DNA甲基化分型體系，并結(jié)合大樣本腫瘤患者隨訪以及模式動物進(jìn)行驗(yàn)證研究。2、 探討組蛋白修飾如何影響基因的轉(zhuǎn)錄及這種調(diào)控形式如何影響惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移。包括新的組蛋白修飾復(fù)合物的發(fā)現(xiàn)和作用機(jī)制的探討；研究不同組蛋白修飾之間的相互影響，特定的組蛋白修飾與特定的基因轉(zhuǎn)錄激活或抑制的關(guān)系，組蛋白修飾和轉(zhuǎn)錄因子/轉(zhuǎn)錄輔助因子的組裝，組蛋白修飾復(fù)合物的調(diào)控，組蛋白修飾在腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中的作用

38、和機(jī)制；篩選組蛋白修飾復(fù)合物成分，包括MLL1等相關(guān)的甲基化酶復(fù)合物成分、組蛋白磷酸化酶、TGF和雌激素信號途徑相關(guān)的組蛋白修飾因子等；驗(yàn)證組蛋白修飾復(fù)合物中各成員間的相互作用；檢測分離的組蛋白修飾因子對組蛋白修飾的影響及不同修飾間的相互影響；檢測組蛋白修飾因子對靶基因的選擇性和表達(dá)的影響，以及組蛋白修飾對Smad、ER等轉(zhuǎn)錄因子募集到靶基因啟動子上的作用；在細(xì)胞水平和小鼠腫瘤模型中檢測篩選到的候選分子在乳腺癌、肺癌等腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中的作用和機(jī)制；收集大量臨床標(biāo)本，結(jié)合病理及預(yù)后等資料，檢測幾個候選分子及相應(yīng)的組蛋白修飾在乳腺癌、肺癌等腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中的臨床意義。3、 利用課題

39、組前期工作中建立的篩選與目標(biāo)蛋白相互作用的ncRNA的技術(shù)平臺（RNA-SELEX-seq），從腫瘤細(xì)胞系和腫瘤組織中篩選鑒定與腫瘤相關(guān)蛋白相互作用的ncRNA，研究ncRNA-蛋白質(zhì)間相互作用的分子基礎(chǔ)、動態(tài)時空關(guān)系以及功能調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；闡明ncRNA在表觀遺傳修飾和轉(zhuǎn)錄水平上對基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用，深入探討它們在腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中的意義；利用生物信息學(xué)和實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法鑒定以ncRNA為軸心，與之相互作用的蛋白質(zhì)、RNA和DNA，發(fā)現(xiàn)ncRNA新的作用機(jī)制，探討在細(xì)胞中是否存在一個通過RNA-蛋白相互作用而構(gòu)成的結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)和信息調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；在發(fā)現(xiàn)和鑒定的腫瘤特異性ncRNA及其相關(guān)蛋白的基礎(chǔ)上

40、，用腫瘤啟動細(xì)胞模型、腫瘤轉(zhuǎn)移模型（包括腫瘤細(xì)胞EMT模型）以及臨床標(biāo)本，深入探索具有臨床意義的ncRNA及其相關(guān)蛋白在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。4、 尋找新的EMT調(diào)控因子以及新的EMT相關(guān)調(diào)控通路，研究建立和維持EMT的信號通路之間的交互作用：一般來說，ER陽性的乳腺癌細(xì)胞（如MCF-7細(xì)胞）轉(zhuǎn)移性弱，而ER陰性的乳腺癌細(xì)胞（如MDA-MB-231細(xì)胞）轉(zhuǎn)移性強(qiáng)。癌細(xì)胞ER表達(dá)陽性也是其對三苯氧胺等雌激素拮抗療法有反應(yīng)性的前提條件。但三苯氧胺對部分ER陽性的乳腺癌細(xì)胞治療效果較差。選取正常乳腺癌細(xì)胞、乳腺癌低轉(zhuǎn)移性、高轉(zhuǎn)移性、耐藥性的代表細(xì)胞系進(jìn)行表達(dá)譜分析，檢測它們是否具有EMT相關(guān)基因的表

41、達(dá)差異。其中差異表達(dá)的除已知EMT基因外，未知功能的基因表達(dá)產(chǎn)物根據(jù)其功能域及蛋白質(zhì)組學(xué)分析（如質(zhì)譜檢測其相互作用蛋白等方法）可研究其是否為新的EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子?；虮磉_(dá)譜差異分析可同樣應(yīng)用于以lentivirus在低轉(zhuǎn)移性細(xì)胞用shRNA抑制E-cadherin促進(jìn)其EMT，或高轉(zhuǎn)移性細(xì)胞引入E-cadherin表達(dá)后與原有細(xì)胞的對比研究中。已發(fā)現(xiàn)多種信號通路都與EMT相關(guān)。擬選取目前研究較為充分的TGFb通路，以及Wnt和NFkB通路為代表，分別給予乳腺癌細(xì)胞相關(guān)信號分子刺激誘導(dǎo)EMT，隨后進(jìn)行基因表達(dá)譜、通路特異性蛋白質(zhì)譜以及高通量的細(xì)胞內(nèi)磷酸化修飾改變等分析，找到這些通路在EMT過程

42、中的共同靶點(diǎn)并闡明其在EMT中如何扮演關(guān)鍵角色。建立可誘導(dǎo)表達(dá)熒光標(biāo)記的E-cadherin或其它EMT誘導(dǎo)因子的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，以在細(xì)胞及分子水平上實(shí)時觀察細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的改變對EMT及細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響。同時，研究這些分子及相關(guān)的通路與乳腺癌病人的轉(zhuǎn)移、療效、預(yù)后及藥物敏感性的關(guān)系，探討其臨床應(yīng)用價值。5、 EMT過程中DNA甲基化水平和組蛋白修飾在全基因組范圍內(nèi)的改變及特異的組蛋白修飾酶如何參與調(diào)控EMT：EMT是已分化上皮細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)重編程的生物學(xué)行為，勢必有DNA甲基化及多種影響基因轉(zhuǎn)錄的組蛋白修飾在全基因組范圍內(nèi)重新分布。利用MeDIP-seq檢測細(xì)胞在發(fā)生EMT時在全基因組范圍內(nèi)的DNA甲基化變化規(guī)律。同時，針對特異性組蛋白化學(xué)修飾如轉(zhuǎn)錄激活性的組蛋白乙酰化、H3K4甲基化，轉(zhuǎn)錄抑制性的H3K9，H3K27，H4K20甲基化等，利用其特異性抗體進(jìn)行ChIP-seq分析，檢測細(xì)胞發(fā)生EMT時的組蛋白化學(xué)修飾變化規(guī)律。從以上兩方面的研究出發(fā)，進(jìn)而對潛在EMT關(guān)鍵基因進(jìn)行詳細(xì)的生物學(xué)功能研究。特異的組蛋白修飾酶可能在EMT調(diào)控中扮演關(guān)鍵角色。組蛋白H3K27三甲基化酶EZH2在乳腺癌中顯著高表達(dá)，并與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及較差預(yù)后密切相關(guān)，提示其在EMT中亦可能扮演關(guān)鍵角色。相關(guān)課題組之前發(fā)現(xiàn)組蛋白H3K4去甲基化酶LSD1在TGFb信號通路及乳腺癌轉(zhuǎn)移中起重要作