畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）-土壤中產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌的篩選及鑒定

1、土壤中產(chǎn)淀粉酶芽抱桿菌的篩選及鑒定廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院姓名：張宣琪班級(jí)：生技121班 學(xué)號(hào)：1214300094同組組員：徐婷婷劉海倫張黎明崔仁洪葉毅航一、摘要本實(shí)驗(yàn)從土壤中分離出能產(chǎn)淀粉酶的芽他桿菌并對(duì)其進(jìn)行鑒定、保存，實(shí)驗(yàn) 屮涉及菌株的分離純化、菌株的形態(tài)學(xué)鑒定和生理生化鑒定，根據(jù)伯杰式細(xì)菌學(xué) 手冊(cè)鑒定其種屈。實(shí)驗(yàn)中通過80°c水浴20min預(yù)處理，殺死無芽抱菌體，篩選出芽抱桿菌； 再用稀釋涂布平板法對(duì)芽泡桿菌進(jìn)行初步篩選；又通過分區(qū)劃線法對(duì)初篩菌株進(jìn) 一步分離純化；最后用選擇性淀粉培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，得到純培養(yǎng)的產(chǎn)淀粉的芽抱 桿菌。最后并通過耐鹽試驗(yàn)、明膠試驗(yàn)、糖發(fā)酵試驗(yàn)、vp試驗(yàn)

2、、口引味試驗(yàn)等多 項(xiàng)生理生化實(shí)驗(yàn)對(duì)篩選出來的菌種進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果為蜂房芽抱桿菌。二、關(guān)鍵詞：淀粉酶芽砲桿菌生化鑒定三、實(shí)驗(yàn)材料與方法1、實(shí)驗(yàn)材料1.1 土樣的采集選取廣大梅苑公寓樓下花園、廣大生化樓前小河附近兩處的土壤，五點(diǎn)法采 集，邊長15cm。鏟去表層土，取10cm深土壤，每一個(gè)土樣約25g左右（每個(gè)點(diǎn) 5g）o將土樣放入無菌的紙袋中，并記錄采集的時(shí)間、地點(diǎn)、植被類型,4 °c冰箱 中保存?zhèn)溆?。分別記做a 土樣、b 土樣。1. 2培養(yǎng)基淀粉篩選培養(yǎng)基淀粉 20 g,蛋口腺 10 g, nacl 2.5 g,瓊脂 10 g, 口來水 1000 ml, ph 口然。斜面種子培養(yǎng)基牛

3、肉膏 3 g,蛋口10 g, nacl 5 g,瓊脂 1520 g,自來水 1000 ml, ph 7.2 7.4；蛋白月東液體培養(yǎng)基（作酬味實(shí)驗(yàn)用）蛋白豚 10 g, nacl 5 g,自來水 1000 ml, ph 7. 27. 4, 121°c 滅菌 20 min； 葡萄糖蛋白月東培養(yǎng)基（vp和mr試驗(yàn)用）蛋白豚 5 g,葡萄糖 5 g, nacl 5 g,自來水 1000 ml, ph 7. 27. 4, 121°c 滅 菌 20 min；糖發(fā)酵培養(yǎng)基（作糖酵解試驗(yàn)用）蛋白腺2 g, nacl 5 g, k2hp04 0.2 g, 1%澳麝香草酚藍(lán)水溶液3 ml,待

4、試糖 10 g（般糖或醇按1 %量加入，而半乳糖、乳糖按1.5 %的量加入），自來水 1000 ml, ph 7. 27.4；酪氨酸平板（作酪氨酸水解試驗(yàn)用）l酪氨酸05g懸浮于10ml蒸餡水中,20分鐘滅菌,然后于looml無菌的營養(yǎng)瓊脂混合，即成酪氨酸水解平板；酪素平板（作酪素水解試驗(yàn)用）取5g脫脂奶粉加入50ml蒸鎘水中（或用50ml脫脂牛奶），另稱1. 5g瓊脂溶于 50ml蒸惚水中，將兩液分開滅菌。待冷至45 50°c時(shí)，將兩液混勻倒平板，即 成牛奶平板；西蒙斯氏檸檬酸鹽培養(yǎng)液（作檸檬酸鹽利用試驗(yàn)用）檸檬酸鈉 2 g, nacl 5 g, mgs04 - 7ii20 0.2

5、 g, k2iip04 - 3ii20 1 g, （ni14）2i1po4 1 g, 1%澳麝香草酚藍(lán)水溶液10 ml,瓊脂1520 g,自來水1000 ml, ph 7. 0 , 121°c 滅菌 20 min；淀粉牛肉膏蛋白陳瓊脂培養(yǎng)基可溶性淀粉2 g,牛肉膏3 g,蛋口月東10 g, nacl 5 g,瓊脂1520 g,蒸惚水1000 ml, ph 7. 27. 4；（2%、5%、7%）高鹽培養(yǎng)基（做耐鹽試驗(yàn)用） 牛肉膏 3g,蛋白j® 10 g, nacl （ 2g、5g、7g）,瓊脂 15-20 g,蒸憾水 1000 ml, ph 7. 27. 4；明膠培養(yǎng)基（做

6、明膠液化試驗(yàn)用）牛肉膏3 g,蛋白豚10 g,明膠12g,蒸傭水1000 ml , ph 7.0；半固體培養(yǎng)基（作運(yùn)動(dòng)性實(shí)驗(yàn)用）瓊脂含量0. 5%,其他組分比例按牛肉膏蛋白豚培養(yǎng)基配制；1. 3試劑和儀器1.3. 1試劑耐鹽性試驗(yàn)：nqci粉末。糖酵解實(shí)驗(yàn)：葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘霜醇。革蘭氏染色：草酸錢結(jié)晶紫染色液，盧戈氏碘液，95%乙醇，0.5%沙黃染色液。芽他染色：5%孔雀綠染色液，0.5%沙黃染色液。v.p試驗(yàn)（mr試驗(yàn)）：40%na0h溶液，奈酚?？谝对囼?yàn):乙醯，口引味試劑。碘原液：碘llg,碘化鉀22g,加水定容至500mlo單-染色：草酸鞍結(jié)晶紫或石炭酸復(fù)紅。硝酸鹽試驗(yàn)：甲液

7、（對(duì)氨基苯磺酸0. 8g+5mol/l醋酸100ml；乙液-奈胺0. 5g + 5mol/醋酸 looml）；酪素水解：脫脂奶粉。酪氨酸水解：i廠酪氨酸。溶菌酶抗性實(shí)驗(yàn)：溶菌酶。卵黃反應(yīng)：新鮮雞蛋。硝酸鹽試驗(yàn)：硝酸鹽明膠液化試驗(yàn)：明膠檸檬酸鹽利用試驗(yàn)：四蒙斯氏檸檬酸鹽1.3.2儀器：無菌培養(yǎng)皿，接種環(huán)，土樣，三角瓶，燒杯，試管，酒精燈，無菌吸管，載玻片， 吸水紙，涂布器，顯微鏡，移液管，移液槍等。恒溫?fù)u床，恒溫培養(yǎng)箱，高壓蒸汽滅菌箱，超凈工作臺(tái)，恒溫水浴箱，磁力攪拌 器等。2、試驗(yàn)方法2. 1十.壤樣品懸液制備2. 1. 1 土壤懸液制備各稱取5g 土壤樣品于裝有45ml無菌水的100ml錐形

8、瓶中，加入玻璃珠與 土壤懸液一起振蕩，制成土壤懸液。置100°c沸水浴10 min,以殺死非芽抱桿菌。 靜置5mino2. 1. 2 土壤懸液稀釋吸取上清液0. 5 ml加到含有49. 5 ml無菌水的三角瓶屮，配成10 - 2 g/ ml的土壤懸液，并進(jìn)一步稀釋至10 - 3g/ ml > 10 - 4g/ ml和10 - 5g/ ml, 共四個(gè)濃度梯度。2. 2分離純化2.2. 1芽泡桿菌屬的純培養(yǎng)分別吸取不同稀釋度的土壤懸液0. 2 ml于牛肉膏蛋口腺瓊脂平板上，用 無菌玻璃涂棒涂布均勻。每個(gè)稀釋度3個(gè)重復(fù),37 °c倒置培養(yǎng)24h。每個(gè)土樣挑 取形態(tài)特征不同的

9、單菌落，在牛肉膏蛋口腺瓊脂平板上劃線純化。菌落的形狀、 顏色、質(zhì)地、透明度一致，菌體形態(tài)為直桿狀，長度均一、寬度一致，并能產(chǎn)生芽 泡吋，確認(rèn)為芽泡桿菌屬的純培養(yǎng)物。2. 2. 2產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選淀粉水解實(shí)驗(yàn)挑取菌種，劃線接種于可溶性淀粉培養(yǎng)基中，每種菌株做一個(gè)平板，將接種完成 的平板置于37°c恒溫箱屮倒置培養(yǎng)24ho2.2.3單染色鏡檢步驟：涂片、干燥及固定；染色：在涂有菌種的載玻片上滴加適量的草酸鍍結(jié)晶紫染色液或石炭酸復(fù)紅液, 染1 min,傾去染液，用水沖洗至無染色液顏色為止。鏡檢：用油鏡觀察染色結(jié)果；2.2.4芽砲染色鏡檢步驟：取37°c培養(yǎng)1824h的枯草芽抱桿

10、菌涂片，干燥，固定。于涂片上滴人35滴5%孔雀綠水溶液。用試管夾夾住載玻片在火焰上用微火加熱，自載玻片上出現(xiàn)蒸汽時(shí)，開始計(jì)算 時(shí)間約4-5min0加熱過程中切勿使染料蒸干，必要時(shí)可添加少許染料。傾去染液，待玻片冷卻后，水沖洗至孔雀綠不再褪色為止。用石炭酸復(fù)紅液復(fù)染1 min,水洗。制片干燥后用油鏡觀察。芽砲呈綠色，菌體紅色。觀察芽砲的形狀和位置.2. 2. 5菌株保藏將篩選出的菌株接種于肉湯瓊脂斜而，4°c下保存待用。2. 3初步鑒定2. 3.1形態(tài)學(xué)鑒定將所得的斜面菌種接種到新的平板上培養(yǎng)以觀察篩選出的產(chǎn)淀粉酶芽抱桿菌菌 落的大小、顏色、干濕情況、形態(tài)、高度、透明程度、邊緣、是否易

11、被挑起、 氣味等。然后進(jìn)行一系列的鏡檢革蘭氏染色、芽砲染色（具體步驟同上）觀 察是否符合芽泡桿菌的指標(biāo)。2. 3. 2生理生化鑒定溫度對(duì)微生物生長的影響將牛肉膏蛋白月東培養(yǎng)基融化倒平板（培養(yǎng)基厚度為15-20cm）。使用牛肉膏蛋白 腺培養(yǎng)基,將菌株十字接種到平板,分別在5°c、15°c、20°c、25°c、30°c、35°c、 40°c、45°c、50°c、55°c、60°c、65°c條件下培養(yǎng)24h,觀察細(xì)菌是否生k。糖類發(fā)酵試驗(yàn)（葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露醇）取斜面培養(yǎng)

12、菌種接種于37°c溫箱中培養(yǎng)24h,觀察培養(yǎng)基是否出紫變黃，杜氏小 管屮是否有氣泡，以證實(shí)菌株是否產(chǎn)酸產(chǎn)氣。vp試驗(yàn)取葡萄糖蛋白陳培養(yǎng)基，接種37°c培養(yǎng)兩天，取出以上試管，每管分別加入40% nqoii溶液10-20滴，并加等量a-奈酚，振蕩試管，以使空氣中的氧溶入，置37°c 恒溫箱中保溫15-30min后，若培養(yǎng)液呈紅色，記為陽性（+ ）反應(yīng)，若不呈紅色， 記為陰性（-）。mr試驗(yàn)取葡萄糖蛋白腺培養(yǎng)基，接種37°c培養(yǎng)兩天，取出以上試管，每管分別加入甲 基紅2滴，震蕩，若培養(yǎng)液呈紅色，記為陽性（+ ）反應(yīng)，若不呈紅色，記為陰 性（-）。卩引味試驗(yàn)取

13、蛋口腺水培養(yǎng)基，接種，37度培養(yǎng)2天，在培養(yǎng)基中加入乙瞇12nd,經(jīng)充分 振蕩使酬味萃取至乙醯中，靜置片刻后乙瞇層浮于培養(yǎng)液的上面，此吋沿管壁緩 慢加入510滴刪味試劑，如有眄|味存在，乙瞇層呈現(xiàn)玫瑰紅色，為卿喙試驗(yàn)陽 性（ + ）,否則為陰性（一）。檸檬酸鹽利用實(shí)驗(yàn)取裝有西蒙斯氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基斜面的試管，分別將少量菌苔接種于各支相應(yīng)的 管中，然后置于37°c恒溫箱中培養(yǎng)24h。觀察結(jié)果，若培養(yǎng)基變藍(lán)色，則表明該 菌能利用檸檬酸鹽作為碳源而生長，即為陽性（ + ）,若培養(yǎng)基無變色，則為陰性 （-）。耐鹽性試驗(yàn)將分離獲得的細(xì)菌分別接種在nacl濃度為2%, 5%, 7%, 10%,的牛

14、肉膏蛋白月東 液體培養(yǎng)基屮，置37°c下培養(yǎng),觀察生長情況，并做記錄。硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)被檢菌接種于硝酸鹽培養(yǎng)基屮，于35°c培養(yǎng)14d.將甲、乙液等量混合后（約 0. 1 ml）加入培養(yǎng)基內(nèi)，立即觀察結(jié)果。明膠液化試驗(yàn)穿刺接種，深度至明膠層2/3處，于37°c溫箱培養(yǎng)24h.。取岀靜置冰箱中待其 凝固后，再觀察其是否被細(xì)菌液化，如被液化，則為陽性，能產(chǎn)生蛋白酶。運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)使用半固體營養(yǎng)瓊脂試管，將接種針從直立柱培養(yǎng)基中央門上而下直刺到離管底 廣1.5cm處，沿原穿刺線拔岀接種針。于37°c溫箱培養(yǎng)24h,觀察是否產(chǎn)生樹根 狀生長，若有，則菌株有鞭毛，若直立

15、生長，則菌株無鞭毛。酪素水解試驗(yàn)（酪蛋白水解）牛奶平板的制備：取5g脫脂奶粉加入50譏蒸懈水中（或用50譏脫脂牛奶），另 稱1.5g瓊脂溶于50ml蒸他水中，將兩液分開滅菌。待冷至45 50°c吋，將兩 液混勻倒平板，即成牛奶平板。將平板倒置過枚，使表面水分干燥，然后將菌種 點(diǎn)接在平板上，每血可點(diǎn)接3-5株菌。37°c培養(yǎng)，記錄菌落周圍和下面酪素是否已被分解而呈透明。酪氨酸水解實(shí)驗(yàn)將營養(yǎng)瓊脂融化，冷卻至溫?zé)?，與l-酪氨酸混勻，分別將菌種點(diǎn)接在平板上， 37°c培養(yǎng)24h。記錄菌落周圍是否冇透明圈，若冇，則菌株能夠水解酪氨酸。卵黃反應(yīng)試驗(yàn)步驟：取18-24h的斜面或

16、培養(yǎng)液屮的菌體點(diǎn)種在上述平板上，點(diǎn)的直徑約為 2-3mm。每個(gè)平板可分散點(diǎn)5-7株菌，以不影響觀察為宜，適溫培養(yǎng)18-24h觀察。 如菌落四周和下而有不透明的區(qū)出現(xiàn)，表示卵磷脂分解生成脂肪，說明冇卵磷脂 酶。淀粉水解試驗(yàn)用18-24h的純培養(yǎng)物，涂布接種于淀粉瓊脂平板（一個(gè)平板可分區(qū)劃“+ “字接 種，），于37°c培養(yǎng)24-48ho然后將碘試劑完全浸于培養(yǎng)表而。立即檢視結(jié)果， 陽性反應(yīng)（淀粉被分解）為瓊脂培養(yǎng)基呈深藍(lán)色、菌落或菌苔周圍出現(xiàn)無色透明 環(huán)。陰性反應(yīng)則無透明環(huán)。0. 001 %溶菌酶試驗(yàn)將菌種制成菌懸液，用無菌玻璃涂棒涂布在牛肉膏蛋白腺瓊脂培養(yǎng)基上，然后用 在溶菌酶試劑中

17、浸濕的濾紙片貼在平板上，培養(yǎng)24h后觀察有無抑菌圈的出現(xiàn), 若有為陽性反應(yīng)，否則為陰性反應(yīng)。2. 4菌種鑒定根據(jù)從伯杰式細(xì)菌學(xué)手冊(cè)芽抱樸菌屈屮檢索到的芽抱樸菌的生理生化特點(diǎn)，選取 能從土壤中分離到的芽抱桿菌種為標(biāo)準(zhǔn)菌種，其生理生化指標(biāo)如下表：伯杰式手冊(cè)芽砲稈菌屬生理生化鑒定表1革蘭氏耐鹽 耐味檸檬酸明膠運(yùn)動(dòng)硝酸鹽酪素枯草芽總桿菌 地衣芽鞄桿菌 蠟狀芽總桿菌 巨大芽鞄桿菌 多粘芽范桿菌 環(huán)狀芽宛桿菌 凝結(jié)芽鞄桿菌 蜂房芽總桿菌 堅(jiān)硬芽鞄桿菌 短芽范稈菌 球形芽范桿菌 巴氏芽總枉菌dww+w+w+差大+w+dd伯杰式手冊(cè)芽范桿菌屬生理生化鑒定表2酪氨酸葡糖木糖阿糖甘露醇產(chǎn)氣最咼溫最低溫枯草芽泡桿菌

18、+ +45-555-20地衣芽范桿菌+ +50-5515蠟狀芽泡桿菌+ 35-4510-20巨大芽范桿菌d+www35-453-20多粘芽范桿菌+ +35-455-10壞狀芽宛桿菌+ +35-505-20凝結(jié)芽泡桿菌+www55-6015-25蜂房芽范桿菌d+ 35-4515-20堅(jiān)硬芽泡桿菌dwww+40-455-20短芽砲桿菌+d w40-6010-35球形芽泡桿菌 30-455-15巴氏芽鞄桿菌33-42陽,1: +;陰性:陽性和陰性不穩(wěn)定：d;弱陽性:w；通過對(duì)目的菌種進(jìn)行多項(xiàng)生理生化實(shí)驗(yàn)，對(duì)比伯杰式手冊(cè)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，從而鑒定 出口的菌的種別；四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析1、分離純化1.1菌株的初篩

19、 1丄1通過80°c水浴20min分別對(duì)ab 土樣進(jìn)行預(yù)處理，殺死無芽抱菌體。1.1.2把處理過的菌懸液離心取上清液，稀釋到不同梯度，每個(gè)梯度分別涂布到 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，27°c保溫箱培養(yǎng)24h,獲得長冇不同菌落的培養(yǎng)基。用接種環(huán) 挑取8個(gè)菌落形態(tài)不同的單-菌落于篩選培養(yǎng)基屮進(jìn)行分區(qū)劃線，劃線結(jié)束后，置 于在37 °c下恒溫培養(yǎng)1224h,每過1224h重復(fù)此操作共3次。分別通過3次 分區(qū)劃線，分離純化初篩所得到的8株菌，把這些菌進(jìn)行編為18號(hào)。1.1.3把這8株菌接種到淀粉培養(yǎng)基中，篩選出能產(chǎn)淀粉酶的菌株，結(jié)果只有1、 2、3、4號(hào)株菌有透明圈；5號(hào)菌冇一個(gè)平板

20、沒冇接種到，為了實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性，放 棄5號(hào)；6、7、8號(hào)菌均未產(chǎn)生透明圈，即不產(chǎn)淀粉酶，不符合口標(biāo)菌株要求, 放棄。1.2菌株的復(fù)篩1.2. 1單染色經(jīng)單染色鏡鑒，2號(hào)菌株不是純培養(yǎng)，有雜菌，不符要求；1、3、4菌株鑒定為 純培養(yǎng)，符合要求。（3號(hào)菌株單染色）1.2.2芽砲染色經(jīng)芽抱染色鏡鑒，觀察到1、4號(hào)菌株無芽抱，3號(hào)菌株有芽砲，芽砲中生，菌 株比較年輕，是芽砲桿菌。（3號(hào)菌株芽他染色）1.2.3革蘭氏染色對(duì)3號(hào)菌株進(jìn)行革蘭氏染色，被染成紅色，是革蘭氏陰性菌。最終得到能產(chǎn)淀粉酶的芽他桿菌，把菌株接種到斜面培養(yǎng)，保存菌株。2初步鑒定2. 1形態(tài)學(xué)鑒定3號(hào)菌的形態(tài)特征：乳片色，濕潤，不透明，菌落較

21、厚，整體突起，表面粗糙, 菌落邊緣不整齊凹凸不平，菌落較粘稠，像鼻涕一樣不容易被挑起。2. 2生理生化鑒定溫度對(duì)微生物生長的影響5°c、50°c、55°c、60°c、65°c不長菌，15°c、20°c、25°c、30°c、35°c、40°c、45°c長菌，且20-40長勢(shì)較好。3號(hào)菌比較適宜的生長溫度大概是20-45°c的范 亂（3號(hào)菌株不同溫度下的生長情況）糖類發(fā)酵試驗(yàn)（葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露醇）木糖、阿拉伯糖、甘露醇均為陰性，葡萄糖：24h,陰性；48h,

22、變成黃色，布氏小 管無氣泡，記作“ + ”。3號(hào)菌能利用葡萄糖，且反應(yīng)產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。（3號(hào)菌株葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)）（3號(hào)菌株木糖發(fā)酵試驗(yàn)）（3號(hào)菌株阿拉們糖發(fā)酵試驗(yàn)）vp試驗(yàn)37°c培養(yǎng)12hz后，每管分別加入40%na01i溶液15滴，并加等量a -奈酚，振 蕩試管，置37°c恒溫箱中保溫30min后，培養(yǎng)液呈紅色，記為陽性（+ ）反應(yīng)，說明3號(hào)細(xì)菌能分解葡萄糖產(chǎn)牛內(nèi)酮酸。（3號(hào)菌株vp試驗(yàn)）mr試驗(yàn)37°c培養(yǎng)12h,取出試管，每管分別加入甲基紅2滴，震蕩，培養(yǎng)液不呈紅色, 卩引味試驗(yàn)記為陰性（-）。37°c培養(yǎng)12h,加入乙® 1ml,經(jīng)充分振

23、蕩使fl引味萃取至乙醯中，靜置片刻后乙醍 層浮于培養(yǎng)液的上面，此吋沿管壁緩慢加入10滴口引味試劑，乙瞇層呈現(xiàn)玫瑰紅色，為卩弭朵試驗(yàn)陽性（+ ）,即有卩弭朵存在。（3號(hào)菌株呵味試驗(yàn)）淀粉水解試驗(yàn)37°c培養(yǎng)12,然后將碘試劑完全浸于培養(yǎng)表面。立即檢視結(jié)果，瓊脂培養(yǎng)基呈深藍(lán)色、菌落或菌苔周圍出現(xiàn)無色透明環(huán)，是陽性反應(yīng)（+ ）即淀粉被分解，3號(hào)菌能產(chǎn)淀粉酶。（3號(hào)菌株淀粉水解試驗(yàn)）耐鹽性試驗(yàn)置37°c下培養(yǎng)12h,四個(gè)濃度梯度的高鹽培養(yǎng)基都長菌了，其情況口j表示為：2卄+,5+, 7+, 10+ （+表示菌落數(shù)口、大小）說明3號(hào)菌耐鹽能力較高。（3號(hào)菌株耐鹽試驗(yàn)）運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)于37

24、°c溫箱培養(yǎng)12h,觀察到?jīng)]有產(chǎn)生樹根狀生長，是直立生長，說明該菌株無 鞭毛。酪素水解試驗(yàn)（酪蛋白水解）37°c培養(yǎng)12h,記錄菌落周圍和下面酪索已被分解而呈透明，說明該菌株能水解酪素。其透明圈的大小分別如下表：編號(hào)1234透明圈大?。╟m）1.9透明圈人?。╟m）2. 1（3號(hào)菌株酪索水解試驗(yàn)）酪氨酸水解實(shí)驗(yàn)37°c培養(yǎng)12h,兩個(gè)實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基，長滿了成片的菌；空白對(duì)照培養(yǎng)基也長菌。培 養(yǎng)基被污染。污染原因是酪素滅菌吋報(bào)紙破了一點(diǎn)點(diǎn)，受到輕微污染。卵黃反應(yīng)試驗(yàn)適溫培養(yǎng)24h觀察菌落四周和卜面沒有不透明的區(qū)出現(xiàn)，反應(yīng)為陰性（一），

25、表 示卵磷脂沒冇分解生成脂肪，沒冇卵磷脂酶。檸檬酸鹽利用實(shí)驗(yàn)置于37°c恒溫箱屮培養(yǎng)24h,培養(yǎng)基變藍(lán)色，為陽性（ + ）,表明該菌能利用檸檬 酸鹽作為碳源而生長。硝酸鹽述原實(shí)驗(yàn)37°c培養(yǎng)14d,將a （磺胺酸冰醋酸溶液）和b （a 蔡胺乙醇溶液）液等量 混合后（約0. 1 ml）加入培養(yǎng)基內(nèi)，無明顯變化，為陰性（一）。說明3號(hào)細(xì)菌 不具有還原硝酸鹽的能力。明膠液化試驗(yàn)穿刺接種，深度至明膠層2/3處，于37°c溫箱培養(yǎng)12h. o取出靜置冰箱中待其 凝固后，觀察到被細(xì)菌液化，為陽性（+ ）,說明3號(hào)菌能產(chǎn)生蛋白酶。0. 001 %溶菌酶試驗(yàn)培養(yǎng)12h后觀察無抑菌

26、圈的出現(xiàn)，為陰性反應(yīng)。3菌種鑒定通過形態(tài)學(xué)鑒定，革蘭氏染色、運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)、耐鹽試驗(yàn)、溫度試驗(yàn)、檸檬酸 鹽試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、酪氨酸水解試驗(yàn)、酪索水解試驗(yàn)、糖發(fā)酵試驗(yàn)、vp 試驗(yàn)、眄|味試驗(yàn)、明膠水解試驗(yàn)、0.001%溶菌酶試驗(yàn)等生理生化實(shí)驗(yàn)，對(duì)篩選 得到的菌種各項(xiàng)?；笜?biāo)進(jìn)行測(cè)定，對(duì)照伯杰式細(xì)菌學(xué)手冊(cè)的檢索樣式，對(duì)實(shí)驗(yàn) 原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，3號(hào)菌株生化鑒定結(jié)杲與芽砲桿菌屈，蜂房芽抱桿菌的各項(xiàng) 生理生化指標(biāo)相同。最終初步鑒定結(jié)果為：3號(hào)菌株最冇可能為蜂房芽砲桿菌。木實(shí)驗(yàn)在菌株鑒定方面不夠全面，除了形態(tài)學(xué)鑒定、生理生化鑒定，應(yīng)該再 做分子生物學(xué)（dna）方面的相關(guān)鑒定才可以確定菌株的種屬。五、實(shí)驗(yàn)討

27、論1、分離純化本次實(shí)驗(yàn)的分離純化，進(jìn)行了涂布、劃線培養(yǎng)、淀粉培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)、單染色、 革蘭氏染色、芽抱染色等步驟，耗時(shí)較長，但述是比較順利的。1. 1涂布，不同稀釋倍數(shù)的菌懸液含菌量有較大差異，10 - 2 g/ ml菌過多， 難得得到易取的菌落，10 - 5g/ ml幾乎沒有菌，10 - 3g/ ml . 10 - 4g/ ml 比較合適?？勺鳛閷?shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)用于以后的實(shí)驗(yàn)操作中。12劃線培養(yǎng)，一共進(jìn)行了 3次劃線，每次培養(yǎng)時(shí)間均為12h,得到的菌落從后期 的實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)結(jié)果來看，得到的但菌落情況比較理想。劃線過程小，我的操作由生 疏到熟練有了很大的進(jìn)步，無菌操作也越來越好。1.3淀粉培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)，

28、木組方案設(shè)計(jì)中，先進(jìn)行“產(chǎn)淀粉酶”的菌株篩選, 很大程度上減輕了實(shí)驗(yàn)壓力。實(shí)驗(yàn)結(jié)束之后，頓悟我們可以先篩選產(chǎn)淀粉酶的菌株再獲得純培養(yǎng)，按照我 們組的實(shí)驗(yàn)情況（有二分z的菌株能產(chǎn)淀粉酶）估計(jì)，我們可以極大程度上提 高實(shí)驗(yàn)效率。我們組分離純化的過程，與同學(xué)對(duì)比，實(shí)驗(yàn)操作中的失誤很少，污 染控制很好，配合好，效率高效果好。2、生化鑒定本次實(shí)驗(yàn)對(duì)菌株進(jìn)行了多項(xiàng)生理生化實(shí)驗(yàn)，其屮像糖酵解、vp、mr等鑒定 項(xiàng)口，以前的實(shí)驗(yàn)小接觸過，所以比較了解，操作順利，結(jié)果也很理想；但是像 卵黃試驗(yàn)、溶菌酶試驗(yàn)等第一次接觸，i大i為對(duì)培養(yǎng)基制備、反應(yīng)原理等方面的不 熟悉，所以真的花了很多功夫在這上面：酪氨酸實(shí)驗(yàn)被污染

29、，因?yàn)槭?0ml的錐 形瓶，報(bào)紙包的比較少、比較薄，滅菌z后報(bào)紙破了一點(diǎn)點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)后培養(yǎng)基全部 被污染，真的實(shí)驗(yàn)當(dāng)屮一點(diǎn)點(diǎn)污染都不能存在；溶菌酶實(shí)驗(yàn)操作是出現(xiàn)問題，直 接吧溶菌酶加到培養(yǎng)基屮，比例不符，并不能看到抑菌圈現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)過程屮源于我們的合理分工和互相配合，效率很高，是兩個(gè)班中最快完成所有實(shí)驗(yàn)的。3、實(shí)驗(yàn)心得本次微生物大實(shí)驗(yàn)真的和原來的任何一次實(shí)驗(yàn)都不一樣，從實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)到實(shí)驗(yàn) 操作，從實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備到試驗(yàn)后的清理工作，每個(gè)步驟完完全全都是由我們自己完成, 雖然很辛苦，但是也止是因?yàn)槊總€(gè)步驟都耍我們獨(dú)立完成，真的學(xué)習(xí)到很多東西, 各方面有了較大提升。在微生物理論方面：一方面，用實(shí)驗(yàn)的方法對(duì)自己所學(xué)的

30、理論知識(shí)做一個(gè)鞏 固，加深了卬彖，有了更深入的理解；另一方面，每次遇到不懂的東西，自己都 會(huì)獨(dú)立的運(yùn)用課本、文獻(xiàn)去探究，強(qiáng)化了自主學(xué)習(xí)能力，而且現(xiàn)在也不會(huì)排斥文 獻(xiàn)了，反而覺得杳文獻(xiàn)是個(gè)好方法。在實(shí)驗(yàn)操作方面，強(qiáng)化了自己科學(xué)高效的設(shè)計(jì)、開展實(shí)驗(yàn)的能力，提高了自 身的實(shí)驗(yàn)技能。當(dāng)拿到一個(gè)課題的時(shí)候，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)無疑是一個(gè)難題，要查閱很多 資料，盡可能優(yōu)化簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)；要考慮平行、對(duì)照等實(shí)驗(yàn)原則；甚至要注意什么時(shí) 候用平板什么斜而這樣的問題，而而俱到，細(xì)心謹(jǐn)慎。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的時(shí)候，無菌操 作是絕對(duì)的重點(diǎn)，由于實(shí)驗(yàn)條件的限制，對(duì)我們操作的耍求就更高了，一個(gè)不經(jīng) 意的動(dòng)作很冇可能帶來污染，甚至導(dǎo)致前期的很多工作前功盡棄。對(duì)于實(shí)驗(yàn)技能, 我覺得沒有大量的操作練習(xí)真的很難做好，剛開始實(shí)驗(yàn)的吋候，單是一個(gè)接種就 能狀況百出，無菌室中一會(huì)打爛平板、一會(huì)燙到手、一會(huì)乂是燒到棉塞，所以現(xiàn) 在不管是配制培養(yǎng)基、倒平板，述是劃線接種，茯至刷試管、洗平板，能夠做到 很熟練很順暢的進(jìn)行這些操作，真的我門己也會(huì)覺得很驕傲，付出了很多。原來 會(huì)覺得實(shí)驗(yàn)室里面的很多東西都很