單克隆抗體和基因工程抗體的制備PPT精選文檔

1、第四章第四章 單克隆抗體與基因單克隆抗體與基因 工程抗體的制備技術(shù)工程抗體的制備技術(shù) 李聞文李聞文 2013 ,10 中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)系中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)系 臨床微生物學(xué)免疫學(xué)教研室臨床微生物學(xué)免疫學(xué)教研室目的要求目的要求1. 掌握雜交瘤技術(shù)的基本原理掌握雜交瘤技術(shù)的基本原理2. 熟悉單克隆抗體的制備技術(shù)熟悉單克隆抗體的制備技術(shù)3. 熟悉基因工程抗體技術(shù)熟悉基因工程抗體技術(shù) 大多數(shù)抗原分子具有多個抗原決定大多數(shù)抗原分子具有多個抗原決定簇（表位，簇（表位，epitope）。一個抗原決定）。一個抗原決定簇刺激一個簇刺激一個B細(xì)胞克隆產(chǎn)生一種特異性細(xì)胞克隆產(chǎn)生一種特異性抗體，一種抗原刺激機(jī)

2、體產(chǎn)生多種抗抗體，一種抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生多種抗體稱為多克隆抗體（體稱為多克隆抗體（polyclonal antibody ,PcAb）如免疫血清。由一個）如免疫血清。由一個只識別一種抗原表位的只識別一種抗原表位的B細(xì)胞克隆產(chǎn)生細(xì)胞克隆產(chǎn)生的同源抗體稱為單克隆抗體的同源抗體稱為單克隆抗體(monoclonal antibody,McAb)。概概 述述 單克隆抗體理化性狀高度均一，其抗原單克隆抗體理化性狀高度均一，其抗原結(jié)合部位完全相同，生物活性專一，特異性結(jié)合部位完全相同，生物活性專一，特異性強(qiáng)，純度高，效價高，易于實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化及大強(qiáng)，純度高，效價高，易于實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化及大量制備，是研究抗體的一重大突破

3、。應(yīng)用比量制備，是研究抗體的一重大突破。應(yīng)用比較廣，如試劑診斷盒、治療腫瘤、器官移植較廣，如試劑診斷盒、治療腫瘤、器官移植及自身免疫病等。及自身免疫病等。 第一節(jié)第一節(jié) 雜交瘤技術(shù)的基本原理雜交瘤技術(shù)的基本原理 基本原理是融合的兩種細(xì)胞保持基本原理是融合的兩種細(xì)胞保持自身的特性，產(chǎn)生具有原來兩個細(xì)自身的特性，產(chǎn)生具有原來兩個細(xì)胞基因信息的單個核細(xì)胞稱為雜交胞基因信息的單個核細(xì)胞稱為雜交細(xì)胞。包括細(xì)胞。包括B細(xì)胞、細(xì)胞、T細(xì)胞，前者產(chǎn)細(xì)胞，前者產(chǎn)生生Ig，后者產(chǎn)生，后者產(chǎn)生CK。 一、B 淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù) 細(xì)胞是經(jīng)抗原免疫的小鼠脾細(xì)胞和細(xì)胞是經(jīng)抗原免疫的小鼠脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞。小鼠骨髓瘤細(xì)

4、胞。B B細(xì)胞能產(chǎn)生抗體，細(xì)胞能產(chǎn)生抗體，但不能在體外長期生長，而骨髓瘤細(xì)胞但不能在體外長期生長，而骨髓瘤細(xì)胞不產(chǎn)生抗體但在體外能長期生長，二者不產(chǎn)生抗體但在體外能長期生長，二者融合，各保持其本性，既產(chǎn)生抗體又長融合，各保持其本性，既產(chǎn)生抗體又長期生長。期生長。 其原理分為幾個步驟其原理分為幾個步驟 目的是制備抗原特異的目的是制備抗原特異的 McAbMcAb，所，所以融合的細(xì)胞必須經(jīng)抗原免疫的以融合的細(xì)胞必須經(jīng)抗原免疫的B B細(xì)胞，細(xì)胞，通常取脾，另一是在體外長期生長又通常取脾，另一是在體外長期生長又不產(chǎn)生抗體，所以選腫瘤細(xì)胞即多發(fā)不產(chǎn)生抗體，所以選腫瘤細(xì)胞即多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞，具備以下特點(diǎn)：性

5、骨髓瘤細(xì)胞，具備以下特點(diǎn)： （一）細(xì)胞的選擇與融合 1. 1. 穩(wěn)定、易培養(yǎng)穩(wěn)定、易培養(yǎng) 2. 2. 自身不分泌自身不分泌IgIg或或CKCK 3. 3. 融合率高融合率高 4. 4. 是是HGPRTHGPRT缺陷株缺陷株 目前常用的目前常用的BALB/cBALB/c小鼠小鼠B B細(xì)胞瘤株有細(xì)胞瘤株有P3-P3-X63-Ag8.653CX63-Ag8.653C（P3.653P3.653）、）、Sp2/0Sp2/0等。為等。為HATHAT敏感株，易培養(yǎng)敏感株，易培養(yǎng), , 融合率高，最常選用融合率高，最常選用聚乙二醇聚乙二醇(PEG)(PEG)使細(xì)胞膜輕度損傷，細(xì)胞容使細(xì)胞膜輕度損傷，細(xì)胞容易融

6、合。易融合。 （二）選擇培養(yǎng)基的應(yīng)用（二）選擇培養(yǎng)基的應(yīng)用 細(xì)胞融合是一個隨機(jī)的物理過程。融合后可細(xì)胞融合是一個隨機(jī)的物理過程。融合后可能出現(xiàn)以下情況能出現(xiàn)以下情況: : 1 1）脾細(xì)胞與瘤細(xì)胞）脾細(xì)胞與瘤細(xì)胞 2 2）瘤細(xì)胞與瘤細(xì)胞）瘤細(xì)胞與瘤細(xì)胞 3 3）脾細(xì)胞與脾細(xì)胞）脾細(xì)胞與脾細(xì)胞 4 4）未融合的脾細(xì)胞）未融合的脾細(xì)胞 5 5）未融合的瘤細(xì)胞）未融合的瘤細(xì)胞 6 6）多聚體形式。）多聚體形式。 3 3）、）、4 4）、）、6 6）在體外易死去，不需篩選。）在體外易死去，不需篩選。細(xì)胞的細(xì)胞的 DNA 合成一般有兩條途徑合成一般有兩條途徑 一是糖和氨基酸及其他小分子化合物一是糖和氨基酸

7、及其他小分子化合物合成核苷酸，進(jìn)一步合成合成核苷酸，進(jìn)一步合成 DNA，葉酸是，葉酸是重要輔酶。重要輔酶。 一是輔助途徑，是在次黃嘌呤和胸腺一是輔助途徑，是在次黃嘌呤和胸腺嘧啶存在下，經(jīng)次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶嘧啶存在下，經(jīng)次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶（hypoxanthine guanine hypoxanthine guanine phospheribosyl transferase,HGPRTphospheribosyl transferase,HGPRT）和）和胸腺嘧啶核苷激酶（胸腺嘧啶核苷激酶（thymidine thymidine kinase,TKkinase,TK）的催化作用）的催化作

8、用合成合成 DNA。 氨基蝶呤是葉酸的拮抗劑，當(dāng)氨基蝶氨基蝶呤是葉酸的拮抗劑，當(dāng)氨基蝶呤存在時，能阻斷第一條途徑。細(xì)胞融合呤存在時，能阻斷第一條途徑。細(xì)胞融合的選擇培養(yǎng)基中有三種關(guān)鍵成分，次黃嘌的選擇培養(yǎng)基中有三種關(guān)鍵成分，次黃嘌呤呤(hypoxanthine,H)(hypoxanthine,H)、氨基蝶呤、氨基蝶呤(aminopoterin,A)(aminopoterin,A)、胸腺嘧啶核苷、胸腺嘧啶核苷(thymidine,T)(thymidine,T)，三者取前綴縮寫為，三者取前綴縮寫為 HAT HAT 培養(yǎng)基，其融合細(xì)胞所用的瘤細(xì)胞是經(jīng)毒培養(yǎng)基，其融合細(xì)胞所用的瘤細(xì)胞是經(jīng)毒性培養(yǎng)基選擇

9、出來的性培養(yǎng)基選擇出來的 HGPRT HGPRT 陰性細(xì)胞株。陰性細(xì)胞株。 所以，前面提到的所以，前面提到的 2）瘤細(xì)胞與瘤細(xì)）瘤細(xì)胞與瘤細(xì)胞及胞及 5) 未融合的瘤細(xì)胞不能生長，只有未融合的瘤細(xì)胞不能生長，只有 1）脾細(xì)胞與瘤細(xì)胞才能生長，因?yàn)槠⒓?xì)胞為脾細(xì)胞與瘤細(xì)胞才能生長，因?yàn)槠⒓?xì)胞為 HGPRT 陽性，通過補(bǔ)償途徑代替氨基蝶呤陽性，通過補(bǔ)償途徑代替氨基蝶呤阻斷的主要途徑。阻斷的主要途徑。 （三）有限稀釋與抗原特異性選擇（三）有限稀釋與抗原特異性選擇 在免疫動物時，一種抗原往往有多個表在免疫動物時，一種抗原往往有多個表位位 ，一個，一個B B細(xì)胞克隆接受一個表位，故在細(xì)胞克隆接受一個表位，

10、故在免疫動物時是眾多免疫動物時是眾多 B B 細(xì)胞克隆的抗體的分細(xì)胞克隆的抗體的分泌，而針對目的抗原的泌，而針對目的抗原的B B細(xì)胞只占很少部分細(xì)胞只占很少部分，在細(xì)胞融合后，有相當(dāng)一部分是無關(guān)的，在細(xì)胞融合后，有相當(dāng)一部分是無關(guān)的細(xì)胞融合體，即融合細(xì)胞分泌的不是目的細(xì)胞融合體，即融合細(xì)胞分泌的不是目的抗體，要進(jìn)行篩選，分二步稀釋?？贵w，要進(jìn)行篩選，分二步稀釋。 計(jì)數(shù)，每個孔只放一個細(xì)胞，實(shí)際是計(jì)數(shù)，每個孔只放一個細(xì)胞，實(shí)際是0至數(shù)個，整個過程為克隆化，將陽性細(xì)胞至數(shù)個，整個過程為克隆化，將陽性細(xì)胞株重復(fù)一次，盡量使抗體更純，將陽性細(xì)株重復(fù)一次，盡量使抗體更純，將陽性細(xì)胞進(jìn)行增殖，部分凍存，部

11、分進(jìn)行體外培胞進(jìn)行增殖，部分凍存，部分進(jìn)行體外培養(yǎng)或動物接種。養(yǎng)或動物接種。 另外還有其他雜交瘤技術(shù)，如人另外還有其他雜交瘤技術(shù)，如人- -人人 B B 淋巴細(xì)胞雜交瘤和鼠淋巴細(xì)胞雜交瘤和鼠- -人人 B B 淋巴細(xì)胞雜淋巴細(xì)胞雜交瘤，人骨髓瘤細(xì)胞系體外建株比較困難，交瘤，人骨髓瘤細(xì)胞系體外建株比較困難，生長不穩(wěn)定，有的分泌生長不穩(wěn)定，有的分泌 IgEIgE，有的分泌，有的分泌 Ig Ig 的的、鏈。鏈。B B細(xì)胞取外周血淋巴細(xì)胞、細(xì)胞取外周血淋巴細(xì)胞、脾細(xì)胞、淋巴結(jié)細(xì)胞、病灶浸潤性淋巴細(xì)脾細(xì)胞、淋巴結(jié)細(xì)胞、病灶浸潤性淋巴細(xì)胞。從理論上講很好，但實(shí)際比較困難，胞。從理論上講很好，但實(shí)際比較困難

12、，在于缺乏好的親體骨髓瘤細(xì)胞株，較難獲在于缺乏好的親體骨髓瘤細(xì)胞株，較難獲得抗原特異性得抗原特異性B B淋巴細(xì)胞；人雜交瘤細(xì)胞淋巴細(xì)胞；人雜交瘤細(xì)胞不能在小鼠或其他動物體內(nèi)生長。不能在小鼠或其他動物體內(nèi)生長。 小鼠骨髓瘤與人的小鼠骨髓瘤與人的B細(xì)胞雜交瘤，該技細(xì)胞雜交瘤，該技術(shù)優(yōu)點(diǎn)是易獲得小鼠骨髓瘤細(xì)胞，融合率術(shù)優(yōu)點(diǎn)是易獲得小鼠骨髓瘤細(xì)胞，融合率較高，但最大的缺點(diǎn)是不同種雜交后不穩(wěn)較高，但最大的缺點(diǎn)是不同種雜交后不穩(wěn)定，雜交瘤傳代后，很快喪失分泌抗體的定，雜交瘤傳代后，很快喪失分泌抗體的染色體。染色體。二、二、T 細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞雜交瘤 自自 B B 細(xì)胞雜交瘤技術(shù)后，細(xì)胞雜交瘤技術(shù)后，T T

13、淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞雜交瘤成為熱門，為獲得淋巴因子，更深雜交瘤成為熱門，為獲得淋巴因子，更深入地研究入地研究T T細(xì)胞的各種功能，雖然有一些小細(xì)胞的各種功能，雖然有一些小鼠鼠T T細(xì)胞雜交瘤成功的報道，但結(jié)果不滿意，細(xì)胞雜交瘤成功的報道，但結(jié)果不滿意，該細(xì)胞很不穩(wěn)定，分泌淋巴因子無特異性，該細(xì)胞很不穩(wěn)定，分泌淋巴因子無特異性，一種一種T T細(xì)胞雜交瘤可同時分泌幾種淋巴因子，細(xì)胞雜交瘤可同時分泌幾種淋巴因子，到目前仍無突破性進(jìn)展。到目前仍無突破性進(jìn)展。 T T 淋巴細(xì)胞雜交瘤分為小鼠及人，淋巴細(xì)胞雜交瘤分為小鼠及人，由于由于 T T 細(xì)胞功能的多樣化，制備出的細(xì)胞功能的多樣化，制備出的 T T 細(xì)胞

14、雜交瘤也各有其特性，如分泌淋細(xì)胞雜交瘤也各有其特性，如分泌淋巴因子，特異性殺傷功能，分泌抑制因巴因子，特異性殺傷功能，分泌抑制因子，自身反應(yīng)性等。其基本過程是將激子，自身反應(yīng)性等。其基本過程是將激活的活的T T細(xì)胞與酶缺陷型細(xì)胞與酶缺陷型T T淋巴細(xì)胞瘤細(xì)胞淋巴細(xì)胞瘤細(xì)胞融合，可表達(dá)特異性融合，可表達(dá)特異性 TCR TCR 或其他功能或其他功能的雜交瘤的雜交瘤T T細(xì)胞，與細(xì)胞，與 B B 細(xì)胞相以，但細(xì)細(xì)胞相以，但細(xì)胞激活和陽性克隆篩選較為雜交，不穩(wěn)胞激活和陽性克隆篩選較為雜交，不穩(wěn)定，簡介主要步驟定，簡介主要步驟 。1. 1. 淋巴瘤細(xì)胞系的選擇淋巴瘤細(xì)胞系的選擇1 1）體外無限制快速生長

15、）體外無限制快速生長2 2）融合率高）融合率高3 3）不分泌淋巴因子和殺傷功能）不分泌淋巴因子和殺傷功能4 4）缺乏某一特異性表面抗原或受體）缺乏某一特異性表面抗原或受體5 5）HGPRT HGPRT 酶缺陷型酶缺陷型 2.2.特異性特異性T T細(xì)胞的制備與純化主要有細(xì)胞的制備與純化主要有可溶性抗原誘導(dǎo)激活的可溶性抗原誘導(dǎo)激活的 T T 細(xì)胞、同種反細(xì)胞、同種反應(yīng)性應(yīng)性T T 細(xì)胞、人的特異性細(xì)胞、人的特異性 T T 細(xì)胞。細(xì)胞。 3.T 3.T 細(xì)胞雜交瘤的篩選細(xì)胞雜交瘤的篩選 通常在含有通常在含有HATHAT選擇培養(yǎng)基上，選擇培養(yǎng)基上，用特異性抗體篩選產(chǎn)生淋巴因子的用特異性抗體篩選產(chǎn)生淋巴

16、因子的雜交瘤細(xì)胞，用抗雜交瘤細(xì)胞，用抗 CD3-TCR CD3-TCR 抗體篩抗體篩選陽性細(xì)胞。選陽性細(xì)胞。 三、陽性雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)三、陽性雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng) 雜交瘤細(xì)胞形成的初期很不穩(wěn)定，雜交瘤細(xì)胞形成的初期很不穩(wěn)定，鼠的二倍體細(xì)胞有鼠的二倍體細(xì)胞有4040對染色體，雜交后對染色體，雜交后8080對，易丟失，丟失后仍生長，要檢測對，易丟失，丟失后仍生長，要檢測上清液中是否有目的抗體及淋巴因子。上清液中是否有目的抗體及淋巴因子。 將陽性細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞培養(yǎng)，反復(fù)將陽性細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞培養(yǎng)，反復(fù)23次，確保為一單細(xì)胞陽性雜交瘤細(xì)胞應(yīng)及次，確保為一單細(xì)胞陽性雜交瘤細(xì)胞應(yīng)及時凍存，以防止細(xì)胞

17、染色體丟失，發(fā)生變時凍存，以防止細(xì)胞染色體丟失，發(fā)生變異或污染，凍存于液氮（異或污染，凍存于液氮（-196）,凍存時凍存時加小牛血清至加小牛血清至20%, 加幾滴加幾滴10%二甲亞砜。二甲亞砜。 雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)可用液體、半固體、雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)可用液體、半固體、接種動物腹腔。接種動物腹腔。第二節(jié)第二節(jié) 單克隆抗體的制備技術(shù)單克隆抗體的制備技術(shù) McAb McAb 單一、特異、純化，利用雜交單一、特異、純化，利用雜交瘤技術(shù)制備瘤技術(shù)制備McAbMcAb的基本原理是三個原則：的基本原理是三個原則： 1 1）一種單克隆產(chǎn)生一種抗體）一種單克隆產(chǎn)生一種抗體 2 2）雜交瘤細(xì)胞保持雙親細(xì)胞特性）雜交瘤細(xì)胞

18、保持雙親細(xì)胞特性 3 3）篩選培養(yǎng)基）篩選培養(yǎng)基 一、單克隆抗體的產(chǎn)生一、單克隆抗體的產(chǎn)生 1. 1. 動物體內(nèi)生長動物體內(nèi)生長 雜交瘤細(xì)胞注射同系小鼠腹腔，先雜交瘤細(xì)胞注射同系小鼠腹腔，先注射石蠟或不完全佐劑，使腹腔滲出液注射石蠟或不完全佐劑，使腹腔滲出液增多，增多，1 12 2周后無菌方法抽取腹水，離周后無菌方法抽取腹水，離心取上清。心取上清。 2. 2. 體外培養(yǎng)體外培養(yǎng) 較常做，用普通培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，根據(jù)培較常做，用普通培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)時間、細(xì)胞生長情況收取上清液。另有養(yǎng)時間、細(xì)胞生長情況收取上清液。另有高密度培養(yǎng)，在單位體積內(nèi)增加細(xì)胞的培高密度培養(yǎng)，在單位體積內(nèi)增加細(xì)胞的培養(yǎng)數(shù)量。養(yǎng)

19、數(shù)量。 二、單克隆抗體的純化二、單克隆抗體的純化 腹水或細(xì)胞上清液，均含有脂蛋白、脂腹水或細(xì)胞上清液，均含有脂蛋白、脂質(zhì)及細(xì)胞碎片等雜質(zhì)，用濾紙去掉脂質(zhì)和大質(zhì)及細(xì)胞碎片等雜質(zhì)，用濾紙去掉脂質(zhì)和大顆粒，離心去除細(xì)胞碎片和蛋白聚合物。顆粒，離心去除細(xì)胞碎片和蛋白聚合物。 目前純化方法有十幾種，一般采用鹽目前純化方法有十幾種，一般采用鹽析、凝膠過濾、離子交換層析和辛酸提取析、凝膠過濾、離子交換層析和辛酸提取等，現(xiàn)在最有效的方法是親和純化法，常等，現(xiàn)在最有效的方法是親和純化法，常用用 SPA 或抗小鼠免疫球蛋白抗體與載體交或抗小鼠免疫球蛋白抗體與載體交聯(lián)。稱為聯(lián)。稱為 Sepharose 柱，抗體結(jié)合

20、上去，然柱，抗體結(jié)合上去，然后洗脫。后洗脫。 三、單克隆抗體的性質(zhì)鑒定三、單克隆抗體的性質(zhì)鑒定 鑒定的方法很多，用已知抗原測鑒定的方法很多，用已知抗原測定抗體，幾乎所有的抗原抗體反應(yīng)定抗體，幾乎所有的抗原抗體反應(yīng)試驗(yàn)都可以作，如陽性，再定量，試驗(yàn)都可以作，如陽性，再定量，確定工作濃度。確定工作濃度。 第三節(jié)第三節(jié) 基因工程抗體技術(shù)基因工程抗體技術(shù) 雜交瘤單克隆抗體在診斷、治療、雜交瘤單克隆抗體在診斷、治療、預(yù)防和蛋白質(zhì)提純應(yīng)用中非常廣泛，預(yù)防和蛋白質(zhì)提純應(yīng)用中非常廣泛，但對人是異源性，人抗小鼠抗體，但對人是異源性，人抗小鼠抗體，應(yīng)用基因工程技術(shù)減少小鼠源成分，應(yīng)用基因工程技術(shù)減少小鼠源成分，保

21、留原有的抗體特異性。保留原有的抗體特異性。一、人源化抗體一、人源化抗體 人源化抗體主要指鼠源性單克隆抗人源化抗體主要指鼠源性單克隆抗體的基因克隆及體的基因克隆及 DNA DNA 重組技術(shù)改造，重組技術(shù)改造，重新表達(dá)的抗體。其大部分氨基酸序列重新表達(dá)的抗體。其大部分氨基酸序列為人源序列所取代，既基本保留親代鼠為人源序列所取代，既基本保留親代鼠單克隆抗體的親和力和特異性，又降低單克隆抗體的親和力和特異性，又降低了鼠異源性。了鼠異源性。 （一）人（一）人-鼠嵌合抗體鼠嵌合抗體 通過基因工程技術(shù)將人通過基因工程技術(shù)將人 IgG C IgG C 區(qū)與區(qū)與鼠鼠IgG V IgG V 區(qū)連接，導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)表達(dá)

22、制備的抗區(qū)連接，導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)表達(dá)制備的抗體稱為嵌合抗體，因體稱為嵌合抗體，因 IgG IgG 的抗原性在的抗原性在 C C 區(qū)，區(qū)，來自人，故抗原性降低，且半衰期明顯延長，來自人，故抗原性降低，且半衰期明顯延長，在介導(dǎo)在介導(dǎo) CDC CDC 及及 ADCC ADCC 亦明顯增強(qiáng)。亦明顯增強(qiáng)。 1.1.鼠單克隆抗體可變區(qū)基因克隆鼠單克隆抗體可變區(qū)基因克隆 用探針從該雜交瘤細(xì)胞的基因組文用探針從該雜交瘤細(xì)胞的基因組文庫中調(diào)取。用庫中調(diào)取。用 PCR PCR 方法從該細(xì)胞的方法從該細(xì)胞的 RNA RNA 中擴(kuò)增中擴(kuò)增 V VH H 及及 V VL L 基因。基因。 2. 2. 表達(dá)載體的構(gòu)建表達(dá)載體的

23、構(gòu)建 人人- -鼠嵌合抗體的表達(dá)載體基因依可變區(qū)鼠嵌合抗體的表達(dá)載體基因依可變區(qū)基因克隆的表達(dá)方式不同而分為兩類，從基因基因克隆的表達(dá)方式不同而分為兩類，從基因文庫所克隆的可變區(qū)基因帶有上游的轉(zhuǎn)錄調(diào)控文庫所克隆的可變區(qū)基因帶有上游的轉(zhuǎn)錄調(diào)控組件及內(nèi)含子剪接信號，因此載體只需要包括組件及內(nèi)含子剪接信號，因此載體只需要包括細(xì)胞內(nèi)增殖所必須的抗生素抗性基因和質(zhì)粒復(fù)細(xì)胞內(nèi)增殖所必須的抗生素抗性基因和質(zhì)粒復(fù)制的起始序列以及在真核細(xì)胞進(jìn)行選擇的顯性制的起始序列以及在真核細(xì)胞進(jìn)行選擇的顯性標(biāo)記基因。標(biāo)記基因。 將載體將載體 DNA DNA 導(dǎo)入真核細(xì)胞稱為轉(zhuǎn)染。導(dǎo)入真核細(xì)胞稱為轉(zhuǎn)染。導(dǎo)入的導(dǎo)入的 DNA D

24、NA 整合至細(xì)胞基因組整合至細(xì)胞基因組 DNA DNA 中中得到轉(zhuǎn)染子，要得到穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染子需利得到轉(zhuǎn)染子，要得到穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染子需利用真核細(xì)胞的顯性選擇標(biāo)記基因，這些用真核細(xì)胞的顯性選擇標(biāo)記基因，這些標(biāo)記基因使細(xì)胞獲得對某些細(xì)胞毒物質(zhì)標(biāo)記基因使細(xì)胞獲得對某些細(xì)胞毒物質(zhì)的抗體，在培養(yǎng)液中加入相應(yīng)的細(xì)胞毒的抗體，在培養(yǎng)液中加入相應(yīng)的細(xì)胞毒物質(zhì)可殺死轉(zhuǎn)染不成功的細(xì)胞，達(dá)到選物質(zhì)可殺死轉(zhuǎn)染不成功的細(xì)胞，達(dá)到選擇的目的。擇的目的。 3.3.表達(dá)表達(dá) 用哺乳動物細(xì)胞或大腸桿菌表達(dá)量較少，用哺乳動物細(xì)胞或大腸桿菌表達(dá)量較少，而應(yīng)用二氫葉酸還原酶（而應(yīng)用二氫葉酸還原酶（dhfrdhfr）擴(kuò)增系統(tǒng)使抗）擴(kuò)增系統(tǒng)使抗

25、體表達(dá)增強(qiáng)。體表達(dá)增強(qiáng)。dhfr dhfr 是正常核酸代謝必須的酶，是正常核酸代謝必須的酶，缺乏該酶的中華倉鼠卵細(xì)胞（缺乏該酶的中華倉鼠卵細(xì)胞（ CHOCHO）需在有）需在有次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷條件下利用次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷條件下利用 DNA DNA 合成，合成，因此因此, dhfr , dhfr 作作 CHO CHO 的顯性選擇標(biāo)記基因，在的顯性選擇標(biāo)記基因，在無次黃嘌呤、胸腺嘧啶核苷的情況下，只有導(dǎo)無次黃嘌呤、胸腺嘧啶核苷的情況下，只有導(dǎo)入入 dhfr dhfr 基因，細(xì)胞才能存活。該糸統(tǒng)可用來基因，細(xì)胞才能存活。該糸統(tǒng)可用來擴(kuò)增導(dǎo)入的目的基因。擴(kuò)增導(dǎo)入的目的基因。 ( ( 二二 )

26、) 改 形 抗 體 （改 形 抗 體 （ r e s h a p e d r e s h a p e d antibody,RABantibody,RAB） 應(yīng)用基因工程技術(shù)在嵌合抗體基礎(chǔ)應(yīng)用基因工程技術(shù)在嵌合抗體基礎(chǔ)上用人抗體可變區(qū)序列取代鼠源單抗上用人抗體可變區(qū)序列取代鼠源單抗CDRCDR以外的骨架序列，重新構(gòu)成既有鼠源單以外的骨架序列，重新構(gòu)成既有鼠源單抗的特異性又保持抗體親和力的人源化抗的特異性又保持抗體親和力的人源化抗體，該抗體對人無免疫原性。抗體，該抗體對人無免疫原性。 （三）抗體的表面修飾（三）抗體的表面修飾 人和鼠人和鼠 IgVIgV區(qū)來自不同的種屬，輕鏈不同型區(qū)來自不同的種屬

27、，輕鏈不同型別 ， 互 補(bǔ) 性 決 定 區(qū)別 ， 互 補(bǔ) 性 決 定 區(qū) ( c o m p l e m e n t a r i t y ( c o m p l e m e n t a r i t y determining region,CDR) determining region,CDR) 的長度可不一致，的長度可不一致，但暴露于表面的但暴露于表面的AAAA殘基的位置數(shù)量都很保守，殘基的位置數(shù)量都很保守，通過改變表面殘基使其人源化，降低鼠可變區(qū)的通過改變表面殘基使其人源化，降低鼠可變區(qū)的異源性，將異源性，將FvFv的表面人源化，消除其免疫原性的表面人源化，消除其免疫原性而不影響而不影響

28、FvFv 的整體空間構(gòu)象。的整體空間構(gòu)象。 （四）雙特異性抗體（四）雙特異性抗體 雙特異性抗體（雙特異性抗體（bispecific bispecific antibody,BsAbantibody,BsAb）又稱雙功能抗體。兩個抗）又稱雙功能抗體。兩個抗原結(jié)合部位具有不同的特異性，可以同時原結(jié)合部位具有不同的特異性，可以同時與兩種不同特異性抗原發(fā)生結(jié)合。與兩種不同特異性抗原發(fā)生結(jié)合。 1.1.化學(xué)交聯(lián)化學(xué)交聯(lián)BsAbBsAb 分別分離純化兩種抗原的單抗，先使分別分離純化兩種抗原的單抗，先使IgIg解離后，獲得單價抗體，再使兩種不同解離后，獲得單價抗體，再使兩種不同抗原特異性的單價抗體或其片段交

29、聯(lián)起來抗原特異性的單價抗體或其片段交聯(lián)起來。該方法易致抗體失活，其產(chǎn)物也難以保。該方法易致抗體失活，其產(chǎn)物也難以保證均質(zhì)性。證均質(zhì)性。 2.2.細(xì)胞工程細(xì)胞工程BsAbBsAb 將二種雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行融合產(chǎn)生雜交將二種雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行融合產(chǎn)生雜交瘤，核酸隨機(jī)組合多種多樣。瘤，核酸隨機(jī)組合多種多樣。 3.3.基因工程基因工程BsAbBsAb 用抗體分子片段如用抗體分子片段如ScFvScFv或或FabFab等，經(jīng)基等，經(jīng)基因操作修飾后，或體外組裝成為因操作修飾后，或體外組裝成為BsAbBsAb，或，或直接導(dǎo)入受體細(xì)胞表達(dá)分泌直接導(dǎo)入受體細(xì)胞表達(dá)分泌BsAbBsAb。 在免疫檢測、腫瘤放射免疫顯象、藥在

30、免疫檢測、腫瘤放射免疫顯象、藥物剎傷、介導(dǎo)細(xì)胞剎傷效應(yīng)起重要作用。物剎傷、介導(dǎo)細(xì)胞剎傷效應(yīng)起重要作用。 二、小分子抗體二、小分子抗體 具有結(jié)合抗原功能的分子片段稱為小具有結(jié)合抗原功能的分子片段稱為小分子抗體。其優(yōu)點(diǎn)：分子抗體。其優(yōu)點(diǎn)：1 1）可在原核細(xì)胞表）可在原核細(xì)胞表達(dá)，生產(chǎn)成本低達(dá)，生產(chǎn)成本低; 2; 2）易于穿透血管或組）易于穿透血管或組織到靶細(xì)胞部位，有利于疾病的治療；織到靶細(xì)胞部位，有利于疾病的治療；3 3）不含不含F(xiàn)c Fc 段，副作用小；段，副作用??；4 4）半衰期短，有）半衰期短，有利于毒素中和及清除。利于毒素中和及清除。 小分子抗體包括：抗原結(jié)合片段小分子抗體包括：抗原結(jié)合

31、片段（fragment of antigen binding,Fabfragment of antigen binding,Fab），），可變區(qū)片段（可變區(qū)片段（fragment of variable fragment of variable region,Fvregion,Fv）, ,單鏈抗體（單鏈抗體（single chain single chain Fv,ScFvFv,ScFv），單區(qū)抗體。另有），單區(qū)抗體。另有V VH H和和V VL。 1. Fab 由一條完整的由一條完整的 L L 鏈和約為鏈和約為1/21/2的的 H H 鏈組成，是完整抗體的鏈組成，是完整抗體的 1/31/3，

32、只有一個，只有一個Ag Ag 結(jié)合位點(diǎn)，它是將結(jié)合位點(diǎn)，它是將 McAb McAb 重鏈重鏈V V區(qū)和區(qū)和 C CH H1 1 區(qū)區(qū)cDNA cDNA 與完整輕鏈與完整輕鏈 cDNA cDNA 連接，在連接，在細(xì)胞啟動子的控制下分泌表達(dá)。細(xì)胞啟動子的控制下分泌表達(dá)。 2. Fv2. Fv和單鏈抗體（和單鏈抗體（ScFvScFv） Fv Fv 由由 V VH H 和和 V VL L 構(gòu)成，非共價鍵結(jié)合，為完構(gòu)成，非共價鍵結(jié)合，為完整抗體的整抗體的1/61/6，單一抗原結(jié)合位點(diǎn)，單一抗原結(jié)合位點(diǎn)，V VH H和和V VL L連接有連接有三種方法：三種方法：1 1）用戊二醛處理，使之交聯(lián)；）用戊二醛

33、處理，使之交聯(lián)；2 2）引）引入半胱氨酸殘基，使入半胱氨酸殘基，使V VH H和和V VL L之間形成二硫鍵；之間形成二硫鍵；3 3）把把V VH H和和V VL L用一段適當(dāng)?shù)墓押塑账岱肿舆B接起來，用一段適當(dāng)?shù)墓押塑账岱肿舆B接起來，表達(dá)成一個單鏈，稱為表達(dá)成一個單鏈，稱為ScFvScFv。 3. 3. 單區(qū)抗體及最小識別單位單區(qū)抗體及最小識別單位 根據(jù)抗體分子的結(jié)構(gòu)，一般將根據(jù)抗體分子的結(jié)構(gòu)，一般將 FvFv 稱為抗稱為抗體的最小單位，但有些更小亞單位仍結(jié)合抗原，體的最小單位，但有些更小亞單位仍結(jié)合抗原，如單獨(dú)重鏈如單獨(dú)重鏈 V VH H 仍可保留相當(dāng)程度抗原結(jié)合能力，仍可保留相當(dāng)程度抗原結(jié)

34、合能力，其作用比其作用比 V VL L 大，稱為單區(qū)抗體（大，稱為單區(qū)抗體（single single domain antibodydomain antibody），其親和力低于完整的），其親和力低于完整的 FvFv，因單區(qū)抗體的疏水區(qū)的暴露，增加了非特異性因單區(qū)抗體的疏水區(qū)的暴露，增加了非特異性吸附，水溶性減低，其應(yīng)用受到限制，但分子吸附，水溶性減低，其應(yīng)用受到限制，但分子量小，單位體積濃度高，副作用小，是很有前量小，單位體積濃度高，副作用小，是很有前景的抗體部分。景的抗體部分。 將抗體分子片段與其他蛋白融合，將抗體分子片段與其他蛋白融合，可得到有多樣性生物功能的融合蛋白，可得到有多樣性生

35、物功能的融合蛋白，有幾種構(gòu)建方式：有幾種構(gòu)建方式： 1 1）將）將 Fab Fab 或或 ScFvScFv與其他生物活與其他生物活性蛋白融合，建成生物導(dǎo)彈。性蛋白融合，建成生物導(dǎo)彈。 三、抗體融合蛋白三、抗體融合蛋白 2）在融合時可根據(jù)某些恒定區(qū)，可使）在融合時可根據(jù)某些恒定區(qū)，可使某些生物活性與抗體的生物學(xué)效應(yīng)功能聯(lián)某些生物活性與抗體的生物學(xué)效應(yīng)功能聯(lián)結(jié)在一起。結(jié)在一起。 3）將）將 ScFv 與某些細(xì)胞膜蛋白融合，形與某些細(xì)胞膜蛋白融合，形成嵌合受體，使細(xì)胞結(jié)合抗原成嵌合受體，使細(xì)胞結(jié)合抗原 。 （一）含（一）含F(xiàn)vFv片段的抗體融合蛋白片段的抗體融合蛋白 將將 FvFv 與某些毒素、酶及

36、細(xì)胞因與某些毒素、酶及細(xì)胞因子等的基因連接，能編碼子等的基因連接，能編碼 FvFv 與毒素、與毒素、酶及細(xì)胞因子復(fù)合物，即生物導(dǎo)彈，酶及細(xì)胞因子復(fù)合物，即生物導(dǎo)彈，主要在于抗腫瘤。主要在于抗腫瘤。 （二）嵌合受體（二）嵌合受體 將將ScFv ScFv 與某些細(xì)胞膜蛋白分子融合，形與某些細(xì)胞膜蛋白分子融合，形成的融合蛋白可表達(dá)于細(xì)胞表面。其抗體部成的融合蛋白可表達(dá)于細(xì)胞表面。其抗體部分與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合。如將抗體的可變分與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合。如將抗體的可變區(qū)基因與區(qū)基因與TCRTCR的的鏈和鏈和鏈恒定區(qū)融合，將融鏈恒定區(qū)融合，將融合基因?qū)牒匣驅(qū)隩 T細(xì)胞，既表達(dá)特異性抗體，又表細(xì)胞，既表

37、達(dá)特異性抗體，又表達(dá)達(dá)TCRTCR，該，該TCRTCR不受不受MHCMHC分子限制。分子限制。 （三）含（三）含 Fc Fc 的抗體融合蛋白的抗體融合蛋白 如將如將CD4CD4分子細(xì)胞膜外部分與分子細(xì)胞膜外部分與Fc Fc 融合后用真融合后用真核細(xì)胞表達(dá)，由二硫鍵連接成雙體，分泌到細(xì)胞外，核細(xì)胞表達(dá)，由二硫鍵連接成雙體，分泌到細(xì)胞外，產(chǎn)生二種功能：產(chǎn)生二種功能：1 1）延長在血循環(huán)中的半衰期；）延長在血循環(huán)中的半衰期；2 2）通過功能蛋白與配體分子的作用，將通過功能蛋白與配體分子的作用，將FcFc的生物學(xué)效的生物學(xué)效應(yīng)引導(dǎo)至特定目的，如應(yīng)引導(dǎo)至特定目的，如CD4CD4與與FcFc融合蛋白，融合

38、蛋白，CD4CD4是是T T輔助細(xì)胞表面糖蛋白，是輔助細(xì)胞表面糖蛋白，是HIV HIV 的受體，該融合蛋白的受體，該融合蛋白能競爭結(jié)合能競爭結(jié)合 HIVHIV，可阻斷，可阻斷 HIV HIV 對對T TH H 的感染，可介的感染，可介導(dǎo)導(dǎo) ADCCADCC及及CDCCDC，可通過胎盤。，可通過胎盤。 小分子抗體都是單價，不能偶聯(lián)。將特異性小分子抗體都是單價，不能偶聯(lián)。將特異性不同的兩個小分子抗體連接在一起可獲得雙特不同的兩個小分子抗體連接在一起可獲得雙特異性抗體。（異性抗體。（bispecific antibody,BsAbbispecific antibody,BsAb），），雙價雙價ScF

39、vScFv與抗原結(jié)合比單價敏感性高，親和力與抗原結(jié)合比單價敏感性高，親和力大，結(jié)構(gòu)和功能上都更接近親本抗體。大，結(jié)構(gòu)和功能上都更接近親本抗體。BsAbBsAb分分子片段可從子片段可從FabFab、FvFv 或或 ScFvScFv 組建，可在體內(nèi)或組建，可在體內(nèi)或體外連接。體外連接。 四、雙特異性抗體四、雙特異性抗體 在小分子抗體的羧基端設(shè)計(jì)半胱氨酸殘基，如帶在小分子抗體的羧基端設(shè)計(jì)半胱氨酸殘基，如帶鉸鏈區(qū)的鉸鏈區(qū)的 Fab 段或帶半胱氨酸殘基尾巴的段或帶半胱氨酸殘基尾巴的 ScFv，可，可在體外通過化學(xué)交聯(lián)成為雙價抗體分子，亮氨酸鉸在體外通過化學(xué)交聯(lián)成為雙價抗體分子，亮氨酸鉸鏈也可用來構(gòu)建，兩

40、個不同抗體連接成為功能抗體。鏈也可用來構(gòu)建，兩個不同抗體連接成為功能抗體。如抗體如抗體 CD3 和抗和抗 IL-2R的的Fab 在體外直接介導(dǎo)在體外直接介導(dǎo)T細(xì)細(xì)胞對表達(dá)胞對表達(dá) IL-2的細(xì)胞有殺傷作用。的細(xì)胞有殺傷作用。 （一）雙價抗體分子的構(gòu)建（一）雙價抗體分子的構(gòu)建1. 體外構(gòu)建體外構(gòu)建 對小分子抗體基因的改造修飾，使細(xì)胞對小分子抗體基因的改造修飾，使細(xì)胞直接表達(dá)雙抗體分子，比體外組建更有效，直接表達(dá)雙抗體分子，比體外組建更有效，現(xiàn)有以下幾種方法現(xiàn)有以下幾種方法: : 2. 雙抗體分子的細(xì)胞內(nèi)組建雙抗體分子的細(xì)胞內(nèi)組建 （1）設(shè)計(jì)促進(jìn)雙聚體形成的結(jié)構(gòu)域，半胱）設(shè)計(jì)促進(jìn)雙聚體形成的結(jié)構(gòu)域

41、，半胱氨酸是促進(jìn)雙聚體形成的結(jié)構(gòu)域，使小分子氨酸是促進(jìn)雙聚體形成的結(jié)構(gòu)域，使小分子抗體在大腸桿菌的分泌型表達(dá)過程中形成雙抗體在大腸桿菌的分泌型表達(dá)過程中形成雙體，亮氨酸拉鏈和甲基（體，亮氨酸拉鏈和甲基（CH3）亦有螺旋）亦有螺旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)角角螺旋結(jié)構(gòu)，使之成為雙體。螺旋結(jié)構(gòu)，使之成為雙體。 （2）在基因構(gòu)建上直接將兩個抗體分子片）在基因構(gòu)建上直接將兩個抗體分子片段融合。段融合。 （3）雙體分子）雙體分子 兩個兩個 ScFv 的的 VH 和和 VL 相相互配對，可產(chǎn)生雙價的雙抗體分子?；ヅ鋵?，可產(chǎn)生雙價的雙抗體分子。 能同時結(jié)合兩種不同抗原，因而可介導(dǎo)能同時結(jié)合兩種不同抗原，因而可介導(dǎo)標(biāo)記物與靶抗原的

42、結(jié)合，或某些高級分子標(biāo)記物與靶抗原的結(jié)合，或某些高級分子定位于靶細(xì)胞。在臨床上有以下應(yīng)用：定位于靶細(xì)胞。在臨床上有以下應(yīng)用： （ 二）雙特異性抗體的應(yīng)用二）雙特異性抗體的應(yīng)用 1. 在免疫檢測中的應(yīng)用在免疫檢測中的應(yīng)用 一個臂結(jié)合靶一個臂結(jié)合靶抗原，另一個臂結(jié)合酶，不需用酶標(biāo)記抗體抗原，另一個臂結(jié)合酶，不需用酶標(biāo)記抗體，避免在標(biāo)記過程中降低酶及抗體的活性。，避免在標(biāo)記過程中降低酶及抗體的活性。 2. 在腫瘤放射免疫顯像中的應(yīng)用在腫瘤放射免疫顯像中的應(yīng)用 一個一個臂結(jié)合腫瘤細(xì)胞，另一個臂結(jié)合半抗原螯合臂結(jié)合腫瘤細(xì)胞，另一個臂結(jié)合半抗原螯合劑，半抗原螯合劑能選擇與放射性核素結(jié)合劑，半抗原螯合劑能選擇與放射性核素結(jié)合。放射免疫顯像，清晰度和靈敏度高。放射免疫顯像，清晰度和靈敏度高。 3. 3. 雙特異性抗體介導(dǎo)的藥物殺傷效應(yīng)雙特異性抗體介導(dǎo)的藥物殺傷效應(yīng) 治療腫瘤生