鹽度變化對(duì)單環(huán)刺螠非特異性免疫的影響

1、    鹽度變化對(duì)單環(huán)刺螠非特異性免疫的影響    朱曉瑩 孟霄 甘宏濤摘要：在溫度為15 、ph值為8條件下，測(cè)定由初始鹽度2.5%變化至不同鹽度（1.5%、2.0%、3.0%、3.5%）對(duì)單環(huán)刺螠非特異性免疫指標(biāo)（血細(xì)胞密度、sod和acp活力、mda含量）的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，鹽度變化后，血細(xì)胞密度在48 h內(nèi)和鹽度呈顯著正相關(guān);各試驗(yàn)組sod活力呈先升后降的趨勢(shì)，而mda含量表現(xiàn)為先降后升，且mda含量與sod活力呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.969，p<0.05）。鹽度2.0%3.0%為單環(huán)刺螠較適宜的環(huán)境條件，鹽度1.5%和3.5%條件下其免

2、疫力顯著下降，以低鹽環(huán)境影響更為明顯。關(guān)鍵詞：鹽度變化;單環(huán)刺螠;非特異性免疫;血細(xì)胞： s917  文獻(xiàn)標(biāo)志碼： a  ：1002-1302（2019）12-0197-03單環(huán)刺螠（urechis uniconcyus）主要分布于俄羅斯、日本、朝鮮以及我國(guó)黃渤海沿岸，是我國(guó)沿海存在的唯一無(wú)管螠目物種1。單環(huán)刺螠肉質(zhì)鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，其必需氨基酸組成符合人體的吸收比例要求，并富含二十碳五烯酸（epa）、二十二碳六烯酸（dpa）及fe、zn等微量元素，提取物中還有一定的抗腫瘤和提高免疫力作用，因此具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值及良好的開(kāi)發(fā)利用前景2。目前，對(duì)單環(huán)刺螠的研究主要集中于纖溶酶的

3、分離純化和溶栓作用提取物的分析、硫化物的應(yīng)激代謝以及人工繁育等方面3-5，而有關(guān)環(huán)境因子對(duì)單環(huán)刺螠免疫功能影響的報(bào)道相對(duì)較少。本研究觀察了不同鹽度條件下單環(huán)刺螠免疫相關(guān)指標(biāo)的變化，旨在探討單環(huán)刺螠對(duì)鹽度的生理調(diào)節(jié)機(jī)制，為人工養(yǎng)殖水環(huán)境調(diào)控提供數(shù)據(jù)參考。1 材料與方法1.1 材料單環(huán)刺螠體長(zhǎng)（15.1±1.5） cm、體質(zhì)量（31.2±4.2） g，于2017年4月購(gòu)自江蘇省連云港市水產(chǎn)品市場(chǎng)，采用循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)暫養(yǎng)7 d。暫養(yǎng)條件為：鹽度2.5%，ph值=8，水溫 15 ，自然光照，連續(xù)充氣，日投喂2次藻液。選擇大小相近、體表無(wú)損傷且活力強(qiáng)者用于試驗(yàn)。1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)本試驗(yàn)初

4、始鹽度為2.5%，設(shè)對(duì)照組為2.5%，試驗(yàn)組分別為1.5%、2.0%、3.0%、3.5%。并采用曝氣自來(lái)水和海水晶配制所需鹽度的人工海水，ph值為8。每組設(shè)3個(gè)平行，每個(gè)平行隨機(jī)放20條單環(huán)刺螠，于40 cm×30 cm×30 cm水族缸中飼養(yǎng)，水溫、餌料、充氣等養(yǎng)殖條件與暫養(yǎng)時(shí)相同。每天定時(shí)換水1次，每次換水50%。每個(gè)平行分別于6、12、24、48、72、96 h取3條單環(huán)刺螠，用蒸餾水沖洗，濾紙吸干體表水分，進(jìn)行解剖并取其血液，保留部分全血用于測(cè)定血細(xì)胞密度，另一部分于4 、12 000 r/min離心5 min，取上清液血清，于-80 保存，進(jìn)行測(cè)定其他免疫相關(guān)指標(biāo)

5、。1.3 檢測(cè)方法用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算血細(xì)胞密度，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，sod）活力采用連苯三酚自氧化法測(cè)定6，酸性磷酸酶（acid phosphatase，acp）活力、丙二醛（malondialdehyde，mda）含量和樣品蛋白含量參考南京建成生物工程研究所試劑盒說(shuō)明進(jìn)行測(cè)定。1.4 數(shù)據(jù)分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用spss 18.0軟件進(jìn)行單因子方差分析，lsd多重比較和duncans檢驗(yàn)，顯著水平設(shè)為0.05。2 結(jié)果與分析2.1 鹽度變化對(duì)單環(huán)刺螠血細(xì)胞密度的影響由圖1可知，處理6 h時(shí)，各組血細(xì)胞密度和鹽度呈顯著正相關(guān)（r2

6、=0.955，p0.05）。2.2 鹽度變化對(duì)單環(huán)刺螠sod活力的影響由圖2可知，鹽度變化對(duì)單環(huán)刺螠sod活力的影響顯著。除鹽度2.5%組sod活力略有波動(dòng)外，其他組均呈先升后降趨勢(shì)。處理6 h，鹽度3.5%組sod活力顯著高于其他組，處理 48 h 后升至最高值，隨后下降。鹽度1.5%和2.0% 2組sod活力上升幅度較小，于處理24 h升至最高。鹽度3.0%組sod活力在處理6 h時(shí)無(wú)明顯變化，隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)亦逐漸升高，至處理48 h升至最高，且上升幅度最大。處理96 h后，鹽度1.5%和3.5% 2組sod活力顯著低于其他試驗(yàn)組（p<0.05），較鹽度2.5%組分別下降54.53

7、%和45.65%。2.3 鹽度變化對(duì)單環(huán)刺螠mda含量的影響由圖3可知，鹽度變化后各試驗(yàn)組mda含量均呈先降后升的趨勢(shì)，以鹽度3.5%組mda含量下降最為明顯。鹽度1.5%和3.5% 2組、鹽度2.0%和3.0%2組分別于處理24、48 h時(shí)降至最低，隨后逐漸上升。至處理96 h，以鹽度1.5%組mda含量最高，鹽度3.5%組次之，其他3個(gè)試驗(yàn)組間相近（p>0.05），且mda含量與sod活力呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.969，p<0.05）。2.4 鹽度變化對(duì)單環(huán)刺螠acp活力的影響由圖4可知，鹽度變化后，單環(huán)刺螠acp活力呈現(xiàn)2種變化趨勢(shì)，由初始鹽度2.5%下降至1.5%和2.0%

8、，acp活力呈現(xiàn)先降后升再降的趨勢(shì);而由鹽度2.5%升高至3.0%和3.5%，acp活力則呈現(xiàn)先升后降趨勢(shì)。鹽度1.5%和2.0%2組在處理6 h后，acp活力顯著低于對(duì)照組，隨后回升，至處理24 h后升至最高值后下降。鹽度3.0%組和3.5%組acp活力分別處理72、48 h后升至最高，以鹽度3.0%組上升幅度最大。處理96 h后，以鹽度3.0%組acp活力最高，鹽度1.5%和3.5%2組顯著低于對(duì)照組（p<0.05）。3 討論3.1 鹽度變化對(duì)單環(huán)刺螠血細(xì)胞密度的影響無(wú)脊椎動(dòng)物血細(xì)胞是其免疫功能的主要實(shí)施者，血細(xì)胞在發(fā)揮吞噬功能時(shí)還會(huì)釋放一些免疫因子，與血淋巴中的其他免疫因子互相協(xié)同

9、以抵御外來(lái)病原對(duì)機(jī)體的侵害7。據(jù)報(bào)道，鹽度變化對(duì)血細(xì)胞有顯著影響，降低和升高都會(huì)導(dǎo)致血細(xì)胞減少，而低鹽度條件下血細(xì)胞減少更為顯著8-9。但reid等研究發(fā)現(xiàn)，鹽度在2.0%4.0%范圍內(nèi)，菲律賓蛤仔（ruditapes philippinarum）血細(xì)胞密度在鹽度為2.0%時(shí)減少，在鹽度為4.0%時(shí)顯著增多10。本結(jié)果表明，鹽度變化對(duì)單環(huán)刺螠血細(xì)胞密度有顯著影響，短期內(nèi)高鹽度3.5%組單環(huán)刺螠血細(xì)胞密度顯著增多，這與reid等的高鹽度脅迫下血細(xì)胞密度顯著增多的研究結(jié)果10一致。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，鹽度2.0%、2.5%和3.0%組的血細(xì)胞密度無(wú)顯著差異，但鹽度1.5%和3.5%2組血細(xì)胞密度顯

10、著低于其他試驗(yàn)組，與zhao等對(duì)凡納濱對(duì)蝦（litopenaeus vannamei）的研究結(jié)果11相近。在處理648 h，單環(huán)刺螠的血細(xì)胞密度和鹽度呈顯著正相關(guān)，這可能由于鹽度變化后，機(jī)體處于低滲或高滲環(huán)境中，為調(diào)整體內(nèi)外滲透壓的平衡而導(dǎo)致血細(xì)胞密度變化。長(zhǎng)時(shí)間脅迫下，鹽度15和35兩組血細(xì)胞密度顯著降低，表明單環(huán)刺螠處于不適宜鹽度環(huán)境下其免疫力受到較大的影響。3.2 鹽度變化對(duì)單環(huán)刺螠sod活力和mda含量的影響生物體在新陳代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生活性氧自由基，對(duì)機(jī)體可造成氧化損傷，而sod可以清除過(guò)量的自由基，對(duì)保護(hù)機(jī)體免受自由基損害起著重要作用12。wang等將鹽度由2.5%變化至0.5%、1

11、.5%和3.5%后96 h，凡納濱對(duì)蝦（litopenaeus vannamei）血液sod活力分別下降52%、27%和24%13。鄭慧等研究發(fā)現(xiàn)，鹽度變化會(huì)引起刺參（apostichopus japonicus）體腔液sod活力降低14。本研究結(jié)果表明，鹽度的升高或降低都會(huì)使單環(huán)刺螠sod活力呈先升后降的趨勢(shì)，表明機(jī)體在遭遇鹽度突變時(shí)，會(huì)引發(fā)一系列生理應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生過(guò)量的氧自由基，誘發(fā)sod活性增強(qiáng)，以降低鹽度突變對(duì)機(jī)體的氧化損傷，增強(qiáng)免疫能力和對(duì)鹽度突變的耐受能力，與高杉等對(duì)大竹蟶（solen grandis）的研究結(jié)果15一致。鹽度變化96 h后，鹽度變化幅度較大的15和35兩組sod活

12、力顯著下降，表明機(jī)體的滲透調(diào)節(jié)負(fù)擔(dān)過(guò)重會(huì)導(dǎo)致其抗氧化系統(tǒng)受損，尤以低鹽的影響更為顯著。mda是生物膜中多不飽和脂肪酸在活性氧自由基攻擊下而引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物，其含量能夠直接反應(yīng)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的強(qiáng)度和速率，可廣泛用于氧化應(yīng)激中自由基產(chǎn)生和生物膜氧化損傷程度的評(píng)價(jià)指標(biāo)16。季延濱等將革胡子鲇（claries lazera）的水體鹽度升高96 h后，其血清mda含量顯著升高17。鹽度變化后單環(huán)刺螠mda含量均呈先降后升的趨勢(shì)，以鹽度1.5%和3.5%2組變化幅度較大，表明低鹽度短時(shí)間的鹽脅迫能引起機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)，適當(dāng)提高其免疫力，而長(zhǎng)時(shí)間高鹽度變化會(huì)造成較大的氧化損傷。本研究中mda含量與sod活力

13、呈顯著負(fù)相關(guān)，故可將sod活力和mda含量的長(zhǎng)期變化用于評(píng)價(jià)鹽度變化下單環(huán)刺螠的免疫狀態(tài)。3.3 鹽度變化對(duì)單環(huán)刺螠acp活力的影響acp是在酸性條件下，催化磷酸單酯水解的酶為溶酶體的標(biāo)志酶，在溶酶體發(fā)揮正常生理功能及機(jī)體免疫中起重要作用18。印度明對(duì)蝦（fenneropenaeus indicus）在鹽度變化后其acp活力均呈先升后降的趨勢(shì)，于72 h升至最高19。在鹽度2.5%、3.5%、4.0%下，刺參體腔液acp活力于10 d達(dá)到最高值后下降14。本研究中，由鹽度2.5%升高至3.0%、3.5%，單環(huán)刺螠acp活力先升后降，與上述研究結(jié)果相近。鹽度3.0%組acp活力升高幅度最大，且處

14、理96 h后仍然顯著高于鹽度2.5%組，表明適當(dāng)?shù)柠}度變化可刺激機(jī)體的免疫力有所提高。而由初始鹽度2.5%下降至1.5%和2.0%，單環(huán)刺螠acp活力表現(xiàn)為先下降，表明機(jī)體處在低鹽環(huán)境下，進(jìn)行滲透壓調(diào)節(jié)需要消耗更多能量從而影響其免疫力。鹽度變化96 h后，鹽度2.0%組acp活力與鹽度2.5%組相近，表明適當(dāng)?shù)柠}度下降后，機(jī)體通過(guò)一段時(shí)間調(diào)整可達(dá)到新的滲透平衡;而鹽度1.5%和3.5%2組acp活力顯著低于對(duì)照組，表明過(guò)低和過(guò)高的鹽度都會(huì)對(duì)機(jī)體免疫力產(chǎn)生不利影響。綜上所述，鹽度變化對(duì)單環(huán)刺螠非特異性免疫有較大影響，鹽度2.0%3.0%為單環(huán)刺螠較適宜的環(huán)境條件，鹽度1.5%和3.5%條件下其免

15、疫力顯著下降，以低鹽環(huán)境下影響更為明顯。在適當(dāng)范圍內(nèi)，機(jī)體可通過(guò)自身的調(diào)節(jié)來(lái)適應(yīng)環(huán)境中的鹽度變化，但鹽度的變化幅度較大會(huì)使機(jī)體的生理機(jī)能遭受脅迫，免疫力下降，可能引起疾病暴發(fā)。因此，在單環(huán)刺螠的養(yǎng)殖過(guò)程中，養(yǎng)殖水環(huán)境的鹽度變化不容忽視，尤其是連續(xù)降雨造成養(yǎng)殖水體的鹽度急劇下降時(shí)要注意及時(shí)換水。參考文獻(xiàn)：1李 諾，宋淑蓮，唐永政. 單環(huán)刺螠j. 生物學(xué)通報(bào)，1998（8）：13-15.2劉海梅，王苗苗，趙 芹. 單環(huán)刺螠體壁肌酶解產(chǎn)物的營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)及其溶解性分析j. 食品與機(jī)械，2016（5）：20-23.3蔣仲青，劉萬(wàn)順，韓寶芹，等. 單環(huán)刺螠纖溶酶的分離純化及溶栓活性的初步研究j. 中國(guó)海洋大學(xué)

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