植物DNA和RNA提取方法

1、一、實驗?zāi)康恼莆罩参锟侱NA的抽提方法和基本原理。學(xué)習(xí)根據(jù)不同的植物和實驗要求設(shè)計和改良植 物總DN對由提方法。二、實驗原理通常采用機械研磨的方法破碎植物的組織和細胞，由于植物細胞勻漿含有多種酶類( 尤其是氧化酶類)對DNA的抽提產(chǎn)生不利的影響，在抽提緩沖液中需加入抗氧化劑或強還原劑 ( 如巰基乙醇 ) 以降低這些酶類的活性。 在液氮中研磨， 材料易于破碎， 并減少研磨過程中各 種酶類的作用。十二烷基肌酸鈉 (sarkosyl) 、十六烷基三甲基溴化銨 (hexadyltrimethyl ammomum bromide，簡稱為 CTAB)十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfa

2、te ，簡稱SDS)等離子型表 面活性劑，能溶解細胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，從而使DNA得以游離出來。再加入苯酚和氯仿等有機溶劑，能使蛋白質(zhì)變性，并使抽提液分相，因核酸(DNA RNA)水溶性很強，經(jīng)離心后即可從抽提液中除去細胞碎片和大部分蛋白質(zhì)。上清液中加入無水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物總 DNA溶液。三、實驗材料水稻幼葉四、主要試劑配方2% CTAB抽提緩沖溶液：CTAB 4g NaCl 16.364 g 1M Tris-HCl 20ml( 0.5MEDTA 8ml，先用70ml ddH 2O溶解，再定容至200ml滅菌，冷卻后% 2-巰基乙醇( 400ul

3、)氯仿 -異戊醇( 24：1)：先加 96ml 氯仿，再加 4ml 異戊醇，搖勻即可。五、實驗步驟1. DNA 的提取(1) 2%CTAB抽提緩沖液在65C水浴中預(yù)熱。(2) 取少量葉片(約 1g)置于研缽中，用液氮磨至粉狀；(3) 加入700ul的2%CTAB由提緩沖液，輕輕攪動；( 4) 將磨碎液分倒入 ml 的滅菌離心管中，磨碎液的高度約占管的三分之二；(5) 置于65C的水浴槽或恒溫箱中，每隔10 min輕輕搖動，40 min后取出；(6) 冷卻 2 min 后，加入氯仿 -異戊醇( 24：1)至滿管，劇烈振蕩 23 min ，使兩者 混合均勻；(7) 放入離心機中10 000 rpm

4、 離心10 min，與此同時，將 600卩1的異丙醇加入另 一新的滅菌離心管中；( 8) 10 000 rpm 離心 1 min 后，移液器輕輕地吸取上清夜，轉(zhuǎn)入含有異丙醇的離心 管內(nèi)，將離心管慢慢上下?lián)u動30 sec，使異丙醇與水層充分混合至能見到DNA絮狀物；(9) 10000 rpm離心1 min后，立即倒掉液體，注意勿將白色DNA沉淀倒出，將離心 管倒立于鋪開的紙巾上；(10) 60 sec后，直立離心管，加入 720卩1的75%乙醇及80卩l(xiāng) 5 M 的醋酸鈉，輕 輕轉(zhuǎn)動，用手指彈管尖，使沉淀與管底的DNA塊狀物浮游于液體中；(11) 放置30 min，使DNA塊狀物的不純物溶解；(

5、12) 10000 rpm離心1 min后，倒掉液體，再加入800卩l(xiāng) 75%勺乙醇，將DNA再洗 30 min ；(13) 10000 rpm 離心 30 sec 后，立即倒掉液體，將離心管倒立于鋪開的紙巾上；數(shù) 分鐘后，直立離心管，干燥 DNA(自然風(fēng)干或用風(fēng)筒吹干)；(14) 加入50卩I X TE(含RNase)緩沖液，使 DNA溶解，置于37C恒溫箱約15 h , 使RNA消解；(15) 置于-20 C保存、備用。2. DNA 質(zhì)量檢測 瓊脂糖電泳檢測，原理和方法見實驗二。六、注意事項( 1 )葉片磨得越細越好。( 2)移液器的使用。(3)由于植物細胞中含有大量的 DNA酶，因此，除

6、在抽提液中加入 EDTA抑制酶的活性外， 第一步的操作應(yīng)迅速，以免組織解凍，導(dǎo)致細胞裂解，釋放出DNA酶，使DNA降解。思考題：1. 本實驗中所用到的各試劑的作用是什么 ? CTAB, 氯仿, 異丙醇 , 75%乙醇, EDTA2. 提取基因組 DNA的方法有哪些？各有何優(yōu)缺點？實驗二 多聚酶鏈式反應(yīng) ( poIymerase chain reaction, PCR) 基因 擴增及瓊脂糖凝膠電泳檢測一、實驗?zāi)康耐ㄟ^本實驗學(xué)習(xí) PCR反應(yīng)的基本原理，掌握PCR的基本操作技術(shù)以及瓊脂糖凝膠電泳技 術(shù)。二、實驗原理PCR用于擴增位于兩端已知序列之間的DNA區(qū)段，即通過引物延伸而進行的重復(fù)雙向DNA合

7、成?；驹砑斑^程如下：PCR循環(huán)過程中有三種不同的事件發(fā)生：(1)模板變性；(2)引物退火；(3)熱穩(wěn)定DNA聚合酶進行 DNA合成。1. 變性：加熱使模板 DNA在高溫下(94-95 C)變性，雙鏈間的氫鍵斷裂而形成兩條 單鏈，即變性階段。2. 退火：在體系溫度降至 37-65 C,模板DNA與引物按堿基配對原則互補結(jié)合，使引 物與模板鏈3'端結(jié)合，形成部分雙鏈 DNA即退火階段。3. 延伸：體系反應(yīng)溫度升至中溫 72C，耐熱DNA聚合酶以單鏈 DNA為模板，在引物 的引導(dǎo)下，利用反應(yīng)混合物中的 4種脫氧核苷三磷酸(dNTF),按5'到3'方向復(fù)制出互補 DNA即引

8、物的延伸階段。上述 3 步為一個循環(huán)，即高溫變性 、 低溫退火 、 中溫延伸 3 個階段。從理論上講，每 經(jīng)過一個循環(huán)，樣本中的DNA量應(yīng)該增加一倍，新形成的鏈又可成為新一輪循環(huán)的模板，經(jīng)過2530個循環(huán)后DNA可擴增106109倍。典型的PCR反應(yīng)體系由如下組分組成：DNA模板、反應(yīng)緩沖液、dNTP MgCb、兩條合成的DNA引物、耐熱 DNA Taq聚合酶。瓊脂糖凝膠電泳的原理：瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，沸水中溶解，45C開始形成多孔性剛性濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。DNA分子在堿性環(huán)境中帶負電荷，在外加電場作用下向正極泳動。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，有電荷效應(yīng)與分

9、子篩效應(yīng)。不同DNA其分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時的泳動率就不同，從而分出不同的區(qū)帶。瓊脂糖凝膠電泳法分離 DNA主要是利用分子篩效應(yīng)，遷移速度與分子量的對數(shù)值成反比關(guān)系。溴化乙錠（EB）為扁平狀分子，在紫外照射下發(fā)射熒光。 復(fù)合物，其發(fā)射的熒光強度較游離狀態(tài)EB發(fā)射的熒光強度大的含量成正比。用肉眼觀察，可檢測到5 ng以上的DNA三、實驗材料及相關(guān)試劑基因組DNA基因特異性引物，PCR擴增相關(guān)試劑，等四、實驗步驟1 模板DNA的抽提：實驗一所得的水稻基因組2. PCR操作（在冰上操作）：（1） PCR反應(yīng)混合液的配制：反應(yīng)體系 加樣：EB可與DNA分子形成EB-DNA10倍以上，且熒光強度與

10、 DNA25DNAy L,在無菌的mL離心管中按下列操作程序反應(yīng)物加樣順序體積/ yL終濃度ddHHO10 x Buffer25 mmol/L MgCI 2mmol/L10 mmol/L dNTP200 y mol/L10 yM上游引物y mol/L10 yM下游引物y mol/LDNA Taq聚合酶7（2）將反應(yīng)混合液混勻，然后每個 板DNA最后加1滴石蠟油，防止水分蒸發(fā)（3）將PCR管放到PCR熱循環(huán)儀中，94C 4 min （ 預(yù)變性）_94 C 30 sec, 60x nPCR管中分裝24 yL,然后稍離心。按下列程序開始循環(huán)：C 30 sec, 72 C 2 min1 U反應(yīng)混合液，

11、再加1 yL模72 C 7 min35個循環(huán)（4）注意事項由于PCR靈敏度非常高，所以應(yīng)當采取措施以防反應(yīng)混合物受痕量DNA的污染。a. 所有與PCR有關(guān)的試劑，只作 PCR實驗用，而不挪作它用。b. 操作中所用的PCR管、離心管、吸管頭等都只能一次性使用。c. 每加一種反應(yīng)物，應(yīng)換新的槍頭。3. PCR產(chǎn)物的檢測：瓊脂糖濃度（%; EB濃度（5 y l / 100 ml TBE ）（1）制膠（以150 mL為例）a. 稱取1.8 g瓊脂糖，加入150 ml的TBE緩沖液（pH ）,搖勻，用電子天平稱三 角瓶的總重量。b. 電爐上加熱，至瓊脂糖完全溶解；然后在天平上加蒸餾水至原重量；c. 用凝

12、膠將制膠板兩端封好，插入適當?shù)氖嶙樱瑢⑷芙獾沫傊牵s50C）,倒入其中，直至厚度為46 m（如有氣泡要把氣泡趕出），在室溫下冷卻凝固（約30 45 min）;d. 將制膠板置于電泳槽中，小心垂直向上拔出梳子，以保證點樣孔完好。（ 2）點樣a. 將卩l(xiāng)溴酚藍加入到 PCR產(chǎn)物中，然后稍微離心；b. 每孔點樣卩I，藍色樣品混合物將沉入點樣孔下部。（3）電泳打開電源開關(guān)，調(diào)節(jié)電壓至 35 V/cm（ 約 100 V） ，可見到溴酚藍條帶由負極向正極 移動，約 1 小時后即可觀察。（4）染色將電泳好的凝膠放入含 EB 的水溶液中 , 染色 15-20 分鐘。（5）觀察 將電泳好的膠置于紫外透射檢測儀

13、上，戴上防護觀察罩，打開紫外燈，可見到橙紅色核酸條帶，根據(jù)條帶粗細，可粗略估計該樣品 DNA 的濃度。如同時有已知分子量的標準 DNA 進行電泳，則可通過線性 DNA條帶的相對位置初步估計樣品的分子量。（ 6 ）注意事項a. 煮膠時，膠液的量不應(yīng)超過三角瓶容量的 1/3 ，否則易溢出。b.煮好的膠應(yīng)冷卻至 50C左右時再倒，以免制膠板變形，并減少漏膠的機會。c. 倒膠注意厚度（4-6 mm）,充分凝固后再拔出梳子，以保持齒孔形狀完好。也可待 膠稍凝固后，放入 4C冰箱10多分鐘，以加速膠的凝固。d. 加樣前趕走點樣孔中的氣泡, 點樣時吸管頭垂直, 切勿碰壞凝膠孔壁, 以免使帶型 不整齊。e.

14、一般情況下不必每點一個樣品都換槍頭,吸電泳緩沖液洗幾次即可再點下一個樣品。凝膠中含有 EB切勿直接用手接觸膠，廢棄膠應(yīng)集中處理，勿亂丟。思考題 ：1. PCR反應(yīng)液中主要成分是哪些？在PCR反應(yīng)過程中各起什么作用？2. 為什么在PCR反應(yīng)過程中，使用三個不同的溫度變化？3. 用PCR擴增目的基因，要想得到特異性產(chǎn)物需注意哪些事項？實驗三植物總RNA勺提取一、實驗?zāi)康耐ㄟ^本實驗學(xué)習(xí)從植物組織中提取RNA勺方法二、實驗原理RNA是一類極易降解的分子，要得到完整的RNA必須最大限度地抑制提取過程中內(nèi)源性及外源性核糖核酸酶對 RNA的降解。高濃度強變性劑異硫氰酸胍，可溶解蛋白質(zhì)，破壞細胞結(jié)構(gòu)，使核蛋白

15、與核酸分離，失活 RNA酶，所以RNA從細胞中釋放出來時不被降解。細胞裂 解后，除了 RNA還有DNA蛋白質(zhì)和細胞碎片，通過酚、氯仿等有機溶劑處理得到純化、 均一的總 RNA。三、儀器、藥品與試劑配方（一） 儀器1 . 低溫離心機2. 分光光度計3. 瓊脂糖膠電泳系統(tǒng)，用前先用1% Na OH溶液浸泡過夜，之后再用DEPC水浸泡沖洗。4 高壓滅菌鍋5 研缽、剪刀、一次性手套等( 二) 藥品1. 焦碳酸二乙酯 (DEPC)2. 嗎啉代丙烷磺酸 (MOPS)3. 異硫氰酸胍4. 醋酸鈉 (NaAc)5. 氯仿6. 苯酚7. 甲醛8. 乙醇9. 乙二胺四乙酸 (EDTA)10. 瓊脂糖11. 異丙醇

16、( 三) 試劑配方1 . % DEPC水0.1 ml DEPC 加入 100 ml 三蒸水中，振搖過夜，再濕熱滅菌。2. 2 mol/L NaAc 、mol/L EDTA、4 mol/L 異硫氰酸胍、4 mol/L LiCI 等均用 DEPC水 配制。3. 5 X MOPS電泳緩沖液(pHMOPS mol/LNaAc 40 mmol/LEDTA 5 mmol/L四、實驗步驟(一) 總RNA的提取(方案一)1. 實驗前 10 天左右播種水稻種子，在 3-4 葉期，剪取 1.2 g 幼葉。放入研缽，在液氮 中研磨成粉末狀，移入 10 mL 離心管。加入4 mol/L 異硫氰酸胍 4 mL 苯酚3

17、mL2 mol/L NaAc (pH mL 氯仿mL混勻，冰浴放置 30 min 。2. 4°C, 8000 r/min ，離心 13 min。3. 棄沉淀，取上清至另一干凈無菌離心管中。4. 加入 2 倍體積無水乙醇， -70 C， h 。5. 4 C， 8000 r/min ，離心 13 min 。6. 棄上清，在沉淀中加入 1 mL 4 mol/L LiCl ，使其溶解。7. 移入 mL 離心管中，冰浴 2 h 。8. 4 C， 13000 r/min ，離心 15 min 。9. 棄上清，在沉淀中加入 400 uL DEPC 水，再加入 400 uL 氯仿，混勻。10. 4

18、C， 13000 r/min ，離心 6 min 。11. 取上清，并加入1/10體積3 mol/L NaAc(pH ),2倍體積無水乙醇，-20 C放置30 min。12. 4 C, 13000 r/min，離心 20 min。13. 將沉淀RNA用70%乙醇洗滌2次。14. 將沉淀RNA室溫下稍干燥。15. 加30 uL DEPC水溶解，-70 C保存。(二) 總RNA的提取(方案二)利用TRIzol提取液抽提RNA具體步驟如下：1. 取幼葉約 250 mg 在液氮中研磨至細粉，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的 ml 離心管；2. 加入 1 ml TRIZOL 提取液震蕩搖勻；3. 室溫放置 5 min 后，加

19、入 ml 的氯仿，劇烈搖動離心管 5 min ；4. 在 8 C條件下，12000 rpm 離心 15 min ;5. 溶液分為兩層，下層為酚氯仿淺紅色液層，將上層液體移入干凈離心管，加入ml異丙醇在1530 C條件下，沉淀10 min ;6. 然后在，28 C條件下，12000 rpm離心10 min , RNA沉淀管壁和底部；7. 去掉液體部分，加入 1 ml 75% 酒精洗 2 次；8. 風(fēng)干后，加入25卩l(xiāng) DEPC處理過的水溶解 RNA儲藏于-80 C冰箱備用。(三)甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳分析總1 .配制 %變性瓊脂糖凝膠 (40 mL)RNA稱取0.48 g,加入DEPC水 mL,

20、5X電泳緩沖液4 mL,加熱使溶解，稍冷卻加入甲醛mL,混勻,室溫凝固 h.2. RNA 電泳檢測樣品制備RNA2 口1甲醛口1甲酰胺|1110x MOPS2(11RNA Loading Buffer 滅菌的DEPC水2 (114 11混合液輕輕混勻并離心，放于65 C下溫育5 min后，置于冰上。3. 電泳檢測將變性瓊脂糖凝膠放入水平電泳槽中，加 1 x MOPS!泳緩沖液，覆蓋凝膠約 1 mm將 RNA羊品加到凝膠點樣孔中，在 5 V/cm條件下電泳30 min，然后在EB中染色15-20 min , 在紫外燈下觀察提取的 RNA的質(zhì)量。五、注意事項1在研磨過程中,利用液氮時刻使組織保持冰

21、凍狀態(tài)。2. RNA酶是一類生物活性非常穩(wěn)定的酶類，除了細胞內(nèi)源RNA酶外，外界環(huán)境中均存在RNA酶，所以操作時應(yīng)戴手套，并注意時刻換新手套。思考題：1. 實驗中所用到的各試劑的作用是什么 ?焦碳酸二乙酯 (DEPC), 嗎啉代丙烷磺酸 (MOPS), 異硫氰酸胍 , 醋酸鈉 (NaAc), 氯仿,苯酚, 甲醛 , 乙醇, 乙二胺四乙酸 (EDTA), 異丙醇動植物組織mRNAI取實驗方法一、材料水稻葉片或小鼠肝組織。二、設(shè)備 研缽，冷凍臺式高速離心機，低溫冰箱，冷凍真空干燥器，紫外檢測儀，電泳儀，電泳 槽。三、試劑1、 無RNA酶滅菌水：用將高溫烘烤的玻璃瓶(180 C 2小時)裝蒸餾水，然

22、后加入 的 DEPC(體積/體積)，處理過夜后高壓滅菌。2、 75%乙醇：用DEPC處理水配制75%乙醇，(用高溫滅菌器皿配制)，然后裝入高溫烘 烤的玻璃瓶中，存放于低溫冰箱。3、1X層析柱加樣緩沖液；20mmol/L Tris Cl, L NaCl , 1mmol/L EDTA, % SDS4、洗脫緩沖液：10mmol/L Tris Cl , 1mmol/L EDTA , % SDS四、操作步驟(一) 動植物總 RNA提取-Trizol 法Trizol 法適用于人類、動物、植物、微生物的組織或培養(yǎng)細菌，樣品量從幾十毫克至 幾克。用Trizol法提取的總 RNA絕無蛋白和DNA污染。RNA可直

23、接用于 Northern斑點分析， 斑點雜交，Poly(A)+分離，體外翻譯，RNase封阻分析和分子克隆。1 、將組織在液 N 中磨成粉末后，再以 50-100mg 組織加入 1ml Trizol 液研磨，注意樣 品總體積不能超過所用 Trizol 體積的 10%。2、研磨液室溫放置 5 分鐘， 然后以每 1mlTrizol 液加入的比例加入氯仿， 蓋緊離心管， 用手劇烈搖蕩離心管 15秒。3、 取上層水相于一新的離心管，按每 mlTrizol 液加異丙醇的比例加入異丙醇， 室溫放 置 10 分鐘， 12000g 離心 10 分鐘。4、 棄去上清液，按每 ml Trizol液加入至少1ml的

24、比例加入75%乙醇，渦旋混勻，4 °C 下 7500g 離心 5 分鐘。5、小心棄去上清液， 然后室溫或真空干燥 5-10 分鐘， 注意不要干燥過分，否則會降低 RNA的溶解度。然后將 RNA溶于水中，必要時可 55C -60 C水溶10分鐘。RNA可進行mRNA 分離，或貯存于 70%乙醇并保存于 -70C。 注意 1 、整個操作要帶口罩及一次性手套，并盡可能在低溫下操作。2、加氯仿前的勻漿液可在 -70 C保存一個月以上，RNA沉淀在70聽醇中可在4C保存一周，-20 C保存一年。(二) mRN醍取由于mRNA末端含有多poly(A)+，當總RNA流徑oligo(dT)纖維素時，

25、在高鹽緩沖液作 用下，mRNA被特異的吸附在 oligo(dT)纖維素柱上，在低鹽濃度或蒸餾水中，mRNA可被洗下，經(jīng)過兩次oligo(dT) 纖維素柱，可得到較純的mRNA1、 用 L NaOH懸浮-1.0g oligo(dT)纖維素。2、 將懸浮液裝入滅菌的一次性層析柱中或裝入填有經(jīng)DEPC處理并經(jīng)高壓滅菌的玻璃棉 的巴斯德吸管中，柱床體積為，用 3倍柱床體積的滅菌水沖洗柱床。3、 用1x柱層析加樣緩沖液沖洗柱床，直到流出液的pH值小于。4、 將(一)中提取的RNA液于65C溫育5分鐘后迅速冷卻至室溫，加入等體積2x柱層析緩沖液，上樣，立即用滅菌試管收集洗出液，當所有RNA溶液進入柱床后，

26、加入 1倍柱 床體積的 1x 層析柱加樣溶液。5、測定每一管的 OD26Q當洗出液中0D為0時，加入2-3倍柱床體積的滅菌洗脫緩沖 液，以 1/3 至 1/2 柱床體積分管收集洗脫液。6、測定OD26Q合并含有RNA的洗脫組分。7、 加入1/10體積的3M NaAc, 倍體積的冰冷乙醇，混勻，-20 C 30分鐘。8、 4 C下12000g離心15分鐘，小心棄去上清液，用 70%乙醇洗 滌沉淀，4 C下12000g 離心 5 分鐘。9、 小心棄去上清液,沉淀空氣干燥10分鐘,或真空干燥 10分鐘。10、 用少量水溶解RNA液，即可用于cDNA合成(或保存在70%乙醇中并貯存于-70 C)。注意

27、1、mRNA在 70%乙醇中-70 C可保存一年以上。2、oligo(dT)纖維素柱用后可用I NaOH洗凈，然后用層析柱加樣緩沖液平衡，并加入 % 疊氮鈉(NaN3冰箱保存，重復(fù)使用。每次用前需用NaOH水層析柱加樣緩沖液依次淋洗柱床。RNA提取流程RNA( total RNA )和信使 RNA(mRN的抽提RNA的提取RNA和無RNA酶的環(huán)境原核生物能產(chǎn)生功能上截然不同的三種 RNA，信使RNA(mRNA核糖體RNA (rRNA),轉(zhuǎn)運RNA(tRNA)而真核生物則能產(chǎn)生四種，還有一種為真核生物所持有 的小是由基因轉(zhuǎn)錄而來的，它運送編碼蛋白所需的信息.由于mRN代表了基因 表達的水平，因此

28、mRNA勺分離，定量和檢測極為重要.應(yīng)用RNA對細胞和分子生物學(xué)的各個方面進行研究非常普遍 .RNA存在于從簡單 的逆轉(zhuǎn)錄病毒到哺乳動物細胞的所有的生命形式之中 . 由于當前沒有一種方法能 夠直接擴增RNA因此,RNA的分離通常是決定實驗結(jié)果質(zhì)量的第一步，也是關(guān)鍵 的一步.提取RNA過程中防止RNA酶的污染所采取的步驟RNA分離的實用方法既有簡單直接的方法(如分離rRNA和tRNA),也有困難和涉及 復(fù)雜步驟的方法(如分離mRNA)在無細胞體系中克隆基因的體外轉(zhuǎn)錄非常有用， 它可以產(chǎn)生足量的同源RNA分子用作探針或模板以識別和測定表達基因的量，或用于RNA勺生化研究，處理RNA羊品時必需仔細小

29、心，其程度取決于樣品的用途和 來源.由于RNA酶存在于所有的生物中并且能夠抵抗諸如煮沸這樣的物理破壞，固此建立一個無RNA酶的環(huán)境對于制備優(yōu)質(zhì) RNA艮重要.對于制備mRN來說這些 預(yù)防措施尤其重要 .工作區(qū)域應(yīng)與進行普通微生物實驗的區(qū)域分離好 , 特別是那些用于細菌接種 , 培 養(yǎng)基和試劑配制的區(qū)域，那些培養(yǎng)基和試劑用于從細菌和動物細胞中進行 DNA的 制備和操作.通常認為這些區(qū)域富含RNA酶.如有可能,使用標有"無RNAS"的商品試管,吸頭,溶液和水.通常新的無菌處理 過的塑料試管和吸管無RNAS,3) 雙蒸水(ddH2O)和溶液應(yīng)該用RNA酶的抑制劑DEPC焦碳酸二乙

30、酯)進行處理： 每100mL溶液或水中加入DEPC原液，放在搖床上充分混勻并在37C下作用數(shù)小 時.然后將溶液高壓滅菌15min使DEPC失活.4）用分子級的試劑和DEPC處理過的水配制的溶液通常沒有 RNA酶.5）分離RNA以前,將一些實驗室玻璃制品置于烤箱在 300 C烘烤4h以滅活核酶. 如有可能 , 將其他設(shè)備也滅菌處理 .從組織中提取RNA則要注意：動物器官的解剖器械存放組織塊的玻璃器皿 凍存組織塊所用的器皿 組織器官的沖洗液 人汗含有RNA酶,故在所有步驟中均應(yīng)戴手套并經(jīng)常更換.記住我們的周圍環(huán)境含有大量的微生物和氣霧 , 它們來自吸液操作或來自我們自 己的呼吸.這些可能造成RNA

31、酶的污染一些組織像脾臟可能比其它組織含有更多的RNA酶.細菌比哺乳動物細胞中有更多的RNA酶.因此從這些細胞中制備 RNA應(yīng)采取更嚴格的預(yù)防措施.分離后的RNA通過瓊脂糖凝膠電泳再經(jīng)溴化乙錠染色后便可檢查其是否完整.rRNA（18s和28s）條帶模糊可能表明由RNA酶引起的RNA的降解. 一步法分離 RNA應(yīng)用 從組織或細胞中分離細胞的總 RNA 從液體樣品中分離 RNATRI REAGENT （Tripure）是一種用于RNA分離的商品溶液.該法源于chomc- zynski的RNA分離一步法.它更便于使用并且結(jié)果更加可靠.對于來源有限的樣 品,我們推薦使用這種試劑這種試劑能從同一樣品中同時

32、分離 RNA, DNA蛋白 質(zhì).用I mL Tripure/50-100mg （ 組織）勻漿組織樣品.對于細胞,每10cm2面積（貼壁 的單層細胞）或每106個細胞（細胞沉淀）使用1mL.將樣品轉(zhuǎn)至管中.（-70 C可保 存 1 月 ）室溫下放置樣品 5min. 每 1mL Tripure 中加入氯仿并搖動 15s, 置于室溫下 215min.4 °C下 12000g 離心 15min.將水相（上部）轉(zhuǎn)至一個新EP管.每1mL Tripure加入異丙醇沉淀RNA將樣品置 于室溫下 510min.4 C,12000g 離心 10min. 凝膠樣沉淀物為 RNA.吸出上清并用1mL 75

33、匯醇在渦旋振蕩器上洗滌 RNA沉淀一次，4 C , 7500g離 心 5min.晾干RNA沉淀.然后用無RNA酶的水,甲酰胺或 的SDS溶液溶解沉淀.RNA的檢測：將樣品稀釋液于三處波長處讀取 OD值.記錄ODfi,通過計算確定RNA濃度或純度.公式如下對于 ssDNA:ssDNA=33X （OD260一 OD310） X稀釋倍數(shù)對于 dsDNA:dsDNA=50X （OD260-OD 310） X稀釋倍數(shù)對于 ssRNA:ssRNA=40X （OD260一 OD310X稀釋倍數(shù)以上濃度單位為 ug/mL.注意事項1) OD310值是背景,若鹽濃度較高，OD310"值也高.2) OD260/OD280對DNA而言其值大約為，高于有RNA虧染低于則有蛋白質(zhì)污染3) OD260/OD280對RNA而言其值大約為.小結(jié)所有可能與RNA接觸的器材均得用DEPC處理.操作過程中應(yīng)帶口罩 , 手套 .DEPCt致癌之可能，盡量避免接觸皮膚 提取的RNA應(yīng)盡早逆轉(zhuǎn)錄成cDNA.逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RTPCR)RT PCR間接用來擴增從RNA分子今得到的一段特異序列.RNA首先被逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA用位于一段特異序列或者一個基因兩側(cè)的引物生成以cDNA為摸板的PCR產(chǎn)物成為一個標準的PCR反應(yīng).得