YONG基因工程的基本操作程序

1、1會計學(xué)YONG基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序基因表達載體的構(gòu)建基因文庫 基因組文庫部分基因文庫（cDNA文庫）基因組文庫與部分基因文庫的關(guān)系1234522557294時間（min）溫度（）PCR反應(yīng)PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)13步2530輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍模板DNA9550引物1引物2DNA引物引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶72第1輪結(jié)束第2輪開始955072TaqTaqTaqTaq72第2輪結(jié)束 概念：PCR全稱為_，是一項 在生物_

2、復(fù)制_的核酸合成技術(shù)。 前提條件：_； 原料：_、_ 、 _、 _。原理：_方式：以_方式擴增，即_（n為擴增循 環(huán)的次數(shù)）結(jié)果：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外特定DNA片段DNA復(fù)制已知基因的核苷酸序列四種脫氧核苷酸引物熱穩(wěn)定DNA聚合酶指數(shù)2n使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴增模板DNAn 過程：變性、退火、延伸三步曲變性：加熱至9095雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA退火：冷卻至5560部分引物與模板的單鏈DNA的特定互補部位相配對和結(jié)合延伸：加熱至7075以目的基因為模板，合成互補的新DNA鏈變性退火延伸 根據(jù)已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列，推測出相應(yīng)的mRNA序列，然后按照堿基互補配對原則，推測出它的

3、結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列，再通過化學(xué)方法，以單核苷酸為原料合成目的基因。蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列推測推測目的基因化學(xué)合成（三）化學(xué)方法人工合成目的基因 用一定的_切割 質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切 口，露出_。 用_切斷目 的基因，使其產(chǎn)生_ _。 將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的_處， 再加入適量_，形成了一個重組 DNA分子（重組質(zhì)粒）限制酶黏性末端同一種限制酶相同的黏性末端切口DNA連接酶1.過程:二、構(gòu)建表達載體 核心質(zhì)粒DNA分子限制酶處理一個切口兩個黏性末端兩個切口獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一種過程:2.基因表達載體的目的（1）使目的基

4、因在受體細胞中穩(wěn)定存在并可以遺傳給下一代；（2）使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。3.基因表達載體的組成：它們有什么作用？a、目的基因b、啟動子c、終止子d、標(biāo)記基因（二）方法將目的基因?qū)胫参锛毎麑⒛康幕驅(qū)雱游锛毎麑⒛康幕驅(qū)胛⑸锛毎r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法顯微注射法Ca2+處理感受態(tài)細胞目的基因進入_內(nèi)，并且在 受體細胞內(nèi)維持_和_的過程（一）轉(zhuǎn)化： 三、將目的基因?qū)胧荏w細胞受體細胞穩(wěn)定表達（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法特點： 易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力原理： Ti質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細胞，并整合到受體細胞染色體的DNA上。轉(zhuǎn)化過程:Ti質(zhì)粒目

5、的基因構(gòu)建表達載體導(dǎo)入植物細胞插入植物細胞染色DNA表達新性狀轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌 基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產(chǎn)生的動力，將包裹在金屬顆粒表面的表達載體DNA打入受體細胞中，使目的基因與其整合并表達的方法。（2）基因槍法（3）花粉通道法 植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道進入受體細胞。（2）操作程序:提純含目的基因表達載體取受精卵顯微注射移植到子宮受精卵發(fā)育新性狀動物常用法：Ca2+處理常用菌：大腸桿菌微生物作受體細胞原因：繁殖快、多為單細胞、遺傳物質(zhì)相

6、對少過程：Ca2+處理大腸桿菌感受態(tài)細胞表達載體與感受態(tài)細胞混合感受態(tài)細胞吸收DNA3.將目的基因?qū)胛⑸锛毎?、檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因 首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA；（1）方法:DNA分子雜交（2）過程: 將含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作標(biāo)記,以此做探針； 使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交,若顯示出雜交帶,表明染色體已插入染色體DNA中。（一）檢測： 采用一定的技術(shù)手段，將兩種生物的DNA分子的單鏈放在一起，如果這兩個單鏈具有互補的堿基序列，那么，互補的堿基序列就會結(jié)合在一起，形成雜合雙鏈區(qū)；在沒有互補堿基序列的部位，仍然是兩條游離的單鏈。 （二）鑒定

7、（個體生物學(xué)水平）抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等方法:分 子 雜 交方法: 抗原-抗體雜交過程:用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交,若出現(xiàn)雜交帶,表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNA。怎樣檢驗抗蟲基因在棉細胞內(nèi)是否表達呢？沒有抗蟲基因的棉植株有抗蟲基因的棉植株棉鈴蟲蟲沒有死蟲被殺死沒有表達目的基因表達類類型型步驟步驟 檢測內(nèi)容檢測內(nèi)容方法方法結(jié)果顯示結(jié)果顯示 分分子子檢檢測測第一第一步步目的基因是否進目的基因是否進入受體細胞入受體細胞DNADNA分子雜交分子雜交（DNADNA和和DNADNA之間）之間）是否成功顯示是否成功顯示出雜交帶出雜交帶第二第二步步目的基因是否轉(zhuǎn)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出錄出mRNAm

8、RNA分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)（DNADNA和和mRNAmRNA之間）之間）是否成功顯示是否成功顯示出雜交帶出雜交帶第三第三步步目的基因是否翻目的基因是否翻譯出蛋白質(zhì)譯出蛋白質(zhì)抗原抗原抗體雜交抗體雜交是否成功顯示是否成功顯示出雜交帶出雜交帶個個體體水水平平鑒鑒定定 包括抗蟲、抗病的包括抗蟲、抗病的接種實驗接種實驗，以確定是否有抗性以及，以確定是否有抗性以及抗性的程度；抗性的程度； 基因工程產(chǎn)品與天然產(chǎn)品的活性比較，以確定功能是基因工程產(chǎn)品與天然產(chǎn)品的活性比較，以確定功能是否相同等。否相同等。檢測是否插入目的基因，利用DNA分子雜交技術(shù)，目的基因DNA一條鏈（作探針）與受體細胞中提取的DNA雜交

9、，看是否有雜交帶。檢測是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA，利用分子雜交技術(shù)，目的基因DNA一條鏈（作探針）與受體細胞中提取的mRNA雜交，看是否有雜交帶。檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)。抗體與蛋白質(zhì)進行抗原抗體雜交，看是否有雜交帶。還可以進行個體水平的鑒定，根據(jù)其性狀。提示：DNA分子雜交技術(shù)首先提取受體細胞中的DNA，然后高溫解成單鏈，再與同位素標(biāo)記的DNA探針雜交； 抗原抗體雜交所用到的抗體是用表達出的蛋白質(zhì)注射動物進行免疫，產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，并提取出而來的。 利用大腸桿菌可以生產(chǎn)出人的胰島素，聯(lián)系前面有關(guān)細胞器功能的知識，結(jié)合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生產(chǎn)人的糖蛋白，可以用大腸桿菌嗎？ 有些蛋白質(zhì)肽鏈