高級(jí)生物化學(xué).PPT

1、12l核酸專題（李正文）核酸專題（李正文）l蛋白質(zhì)專題（何冰）蛋白質(zhì)專題（何冰）l代謝調(diào)控專題（韋海華）代謝調(diào)控專題（韋海華）3l核酸的結(jié)構(gòu)核酸的結(jié)構(gòu)l核酸的性質(zhì)與研究方法核酸的性質(zhì)與研究方法l核酸研究的新進(jìn)展核酸研究的新進(jìn)展4l王琳芳，蛋白質(zhì)與核酸，北京醫(yī)科大學(xué)、中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)王琳芳，蛋白質(zhì)與核酸，北京醫(yī)科大學(xué)、中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，聯(lián)合出版社， 1998 1998l韋弗，分子生物學(xué)，科學(xué)出版社韋弗，分子生物學(xué)，科學(xué)出版社, ,麥格勞麥格勞- -希爾國際公司希爾國際公司 ，20002000l郜金榮郜金榮 ，分子生物學(xué)，武漢大學(xué)出版社，分子生物學(xué)，武漢大學(xué)出版社，19991999l閻隆

2、飛閻隆飛 ，分子生物學(xué)，分子生物學(xué)， 北京農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社北京農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社 ，19971997lDienbach,C.W. PCR Dienbach,C.W. PCR 技術(shù)實(shí)驗(yàn)指南，科學(xué)出版社，技術(shù)實(shí)驗(yàn)指南，科學(xué)出版社， 1998 1998l蘇慧慈，蘇慧慈， 原位原位 PCRPCR，科學(xué)出版社，科學(xué)出版社，1995199556(primary structure of n)7l脫氧核糖核酸（脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）：存在于細(xì)胞核和線粒體內(nèi)，是貯存）：存在于細(xì)胞核和線粒體內(nèi)，是貯存和攜帶遺傳信息的物質(zhì)。和攜帶遺傳信息的物質(zhì)。l核糖核酸（核糖核酸（ribo

3、nucleic acid，RNA）：存在）：存在于胞漿中，參與遺傳信息的表達(dá)。于胞漿中，參與遺傳信息的表達(dá)。8mRNA ，信使核糖核酸，信使核糖核酸t(yī)RNA，轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸，轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸rRNA，核糖體核糖核酸，核糖體核糖核酸其中其中 RNA 又分為三類：又分為三類：9脫氧核糖核酸（脫氧核糖核酸（DNA）人人60 10-9 mg牛牛65 10-9 mg 鼠鼠 66 10-9 mg 雞雞26 10-9 mg 鴨鴨 21 10-9 mg 蟾蜍蟾蜍 73 10-9 mg 鯉魚鯉魚 33 10-9 mg幾種不同生物的細(xì)胞內(nèi)幾種不同生物的細(xì)胞內(nèi) DNA的含量的含量10五碳五碳 糖糖磷酸磷酸堿基堿基核苷核苷

4、核苷酸核苷酸核糖核糖核糖核苷酸核糖核苷酸脫氧脫氧 核糖核糖脫氧核苷酸脫氧核苷酸核酸的基本單位核苷酸11腺嘌呤脫氧核苷酸脫氧核苷酸DNA的基本單位腺嘌腺嘌呤呤堿基堿基脫氧脫氧 核糖核糖磷酸磷酸A G C T鳥嘌呤脫氧核苷酸胞嘧啶脫氧核苷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸鳥嘌鳥嘌呤呤胞嘧胞嘧啶啶胸腺胸腺嘧啶嘧啶12核糖核苷酸RNA的基本單位腺嘌腺嘌呤呤胞嘧胞嘧啶啶堿基堿基核糖核糖磷酸磷酸鳥嘌鳥嘌呤呤A G C U尿嘧尿嘧啶啶鳥嘌呤核糖核苷酸腺嘌呤核糖核苷酸胞嘧啶核糖核苷酸尿嘧啶核糖核苷酸13l核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)：是指核酸中核苷酸的排列：是指核酸中核苷酸的排列順序。是其高級(jí)結(jié)構(gòu)和功能的基礎(chǔ)。順序。是其高

5、級(jí)結(jié)構(gòu)和功能的基礎(chǔ)。核苷酸之間通過核苷酸之間通過3 3 ,5 ,5 - -磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵連接連接14（一）（一） 限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶(Restriction endonuclease ) 1 定義：在原核生物中存在的能識(shí)別外源定義：在原核生物中存在的能識(shí)別外源DNA雙鏈中雙鏈中46個(gè)堿基對(duì)組成的特異序列，并個(gè)堿基對(duì)組成的特異序列，并在此序列某位點(diǎn)水解外源在此序列某位點(diǎn)水解外源DNA，這類酶稱，這類酶稱限制限制性內(nèi)切酶。性內(nèi)切酶。 作用的位點(diǎn)稱作用的位點(diǎn)稱靶位點(diǎn)。靶位點(diǎn)。核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)15限制性內(nèi)切酶l限制性內(nèi)切酶主要存在于原核生物中，大多數(shù)來限制性內(nèi)切酶主要存在于原核生物中，大多數(shù)

6、來自于細(xì)菌體內(nèi)，與相伴存在的甲基化酶共同構(gòu)成自于細(xì)菌體內(nèi)，與相伴存在的甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制細(xì)菌的限制-修飾體系，限制外源修飾體系，限制外源DNA、保護(hù)內(nèi)源、保護(hù)內(nèi)源DNA。l1970年年Smith等分離到第一種限制性核酸內(nèi)切酶，等分離到第一種限制性核酸內(nèi)切酶，為為DNA分子體外剪切奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。分子體外剪切奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。16 限制性核酸內(nèi)切酶的命名：限制性核酸內(nèi)切酶的命名：一般是以微生物屬名的第一般是以微生物屬名的第一個(gè)字母一個(gè)字母（大寫）（大寫）和種名的前兩個(gè)字母組成，第四個(gè)字母和種名的前兩個(gè)字母組成，第四個(gè)字母表示菌株表示菌株(品系品系)。字母后面的羅馬字則是簡單地表明該種生。字

7、母后面的羅馬字則是簡單地表明該種生物中不同限制酶分離的先后順序。例如，分離自產(chǎn)色鏈霉物中不同限制酶分離的先后順序。例如，分離自產(chǎn)色鏈霉菌菌(Streptomyces achromogenes )的兩種限制酶被分別命名為的兩種限制酶被分別命名為SacI和SacII。比如限制酶比如限制酶Hinc和和Hind則是分別來自流則是分別來自流感嗜血菌感嗜血菌(Haemophilus influenzae)的的c和和d血清型菌株。血清型菌株。2 限制性核酸內(nèi)切酶的命名和種類限制性核酸內(nèi)切酶的命名和種類 迄今為止，已有上千種限制酶被分離純化，從目前已迄今為止，已有上千種限制酶被分離純化，從目前已商品化的商品化

8、的100多種限制酶的識(shí)別序列可以看出，限制酶所識(shí)多種限制酶的識(shí)別序列可以看出，限制酶所識(shí)別的別的DNA序列大多數(shù)都富含序列大多數(shù)都富含胞嘧啶胞嘧啶(C)和鳥嘌呤和鳥嘌呤(G)。限制性內(nèi)切酶17限制性內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶的種類：限制性核酸內(nèi)切酶的種類：l最早從大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的最早從大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的EcoK、EcoB就屬于就屬于I類酶。類酶。其分子量較大；反應(yīng)過程中除需其分子量較大；反應(yīng)過程中除需Mg2+外，還需要外，還需要S-腺苷腺苷-L甲硫氨酸、甲硫氨酸、ATP；在；在DNA分子上沒有特異性分子上沒有特異性的酶解片斷的酶解片斷.lI型限制性內(nèi)切酶能識(shí)別型限制性內(nèi)切酶能識(shí)別DNA分子內(nèi)非甲基化

9、的分子內(nèi)非甲基化的特定序列，但切割是隨機(jī)的，且切割位點(diǎn)遠(yuǎn)離識(shí)別特定序列，但切割是隨機(jī)的，且切割位點(diǎn)遠(yuǎn)離識(shí)別位點(diǎn)，不能生成特定片段，因此，位點(diǎn)，不能生成特定片段，因此，I類酶作為類酶作為DNA的分析工具價(jià)值不大的分析工具價(jià)值不大。18限制性內(nèi)切酶lII類酶有類酶有EcoR I、BamH I、Hind II、Hind III等。等。其分子量小于其分子量小于105道爾頓；反應(yīng)只需道爾頓；反應(yīng)只需Mg2+；最重要；最重要的是在所識(shí)別的特定堿基順序上有特異性的切點(diǎn)，的是在所識(shí)別的特定堿基順序上有特異性的切點(diǎn)，因而因而DNA分子經(jīng)過分子經(jīng)過II類酶作用后，可產(chǎn)生特異性的類酶作用后，可產(chǎn)生特異性的酶解片斷，

10、這些片斷可用凝膠電泳法進(jìn)行分離、鑒酶解片斷，這些片斷可用凝膠電泳法進(jìn)行分離、鑒別。酶切后可形成粘性末端或平整末端別。酶切后可形成粘性末端或平整末端。lII型限制性內(nèi)切酶能識(shí)別型限制性內(nèi)切酶能識(shí)別DNA分子中的特定序分子中的特定序列，大部分具有回文結(jié)構(gòu)。列，大部分具有回文結(jié)構(gòu)。 IIII型限制性內(nèi)切酶型限制性內(nèi)切酶識(shí)別的識(shí)別的DNADNA序列一般長度是序列一般長度是4 4、5 5和和6 6個(gè)堿基對(duì)。個(gè)堿基對(duì)。193 限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列與酶切特點(diǎn)限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列與酶切特點(diǎn) (1)限制酶識(shí)別的限制酶識(shí)別的DNA特異序列具有回紋結(jié)構(gòu)特異序列具有回紋結(jié)構(gòu)的序列。的序列。 (2)限制酶識(shí)別序列限

11、制酶識(shí)別序列4-6個(gè)堿基對(duì)。個(gè)堿基對(duì)。 現(xiàn)在已從各種微生物中發(fā)現(xiàn)上千種限制酶，現(xiàn)在已從各種微生物中發(fā)現(xiàn)上千種限制酶，它們識(shí)別序列的長度最短的是它們識(shí)別序列的長度最短的是4個(gè)核苷酸，最長個(gè)核苷酸，最長的為的為8個(gè)核苷酸?；蚩寺∵^程中使用頻率最高個(gè)核苷酸?；蚩寺∵^程中使用頻率最高的是識(shí)別的是識(shí)別6個(gè)堿基對(duì)的限制酶。個(gè)堿基對(duì)的限制酶。 限制性內(nèi)切酶20EcoR I的識(shí)別位點(diǎn)的識(shí)別位點(diǎn)G A A T T C53C T T A A G35A A T T CG5-粘性末端粘性末端Hind III的識(shí)別位點(diǎn)的識(shí)別位點(diǎn)T T C G A AA A G C T T 5335A G C T TA5-粘性末端粘

12、性末端限制性內(nèi)切酶21Hae III的識(shí)別位點(diǎn)的識(shí)別位點(diǎn)Pst I的識(shí)別位點(diǎn)的識(shí)別位點(diǎn)G G C C53C C G G35C T G C A G53G A C G T C35 G G C C C C G G平整末端平整末端C T G C AG3-粘性末端粘性末端限制性內(nèi)切酶22在已發(fā)現(xiàn)的限制性內(nèi)切酶中，近百種酶的識(shí)別順序在已發(fā)現(xiàn)的限制性內(nèi)切酶中，近百種酶的識(shí)別順序已被確定。有很多來源不同的酶有相同的堿基識(shí)別順序，已被確定。有很多來源不同的酶有相同的堿基識(shí)別順序，這種酶稱為這種酶稱為“異源同功酶異源同功酶”(isochizomer)。應(yīng)該注意的是。應(yīng)該注意的是，這些酶雖然有相同的識(shí)別順序，但它們

13、的，這些酶雖然有相同的識(shí)別順序，但它們的切點(diǎn)并不完全切點(diǎn)并不完全一樣。一樣。例如例如Xma I和和Sma I都識(shí)別六核苷酸都識(shí)別六核苷酸CCCGGG，但，但Xma I的切點(diǎn)在的切點(diǎn)在cCCGGG，而，而Ema I的切點(diǎn)則在的切點(diǎn)則在CCCGgGG，前者切割，前者切割DNA分子，形成帶有分子，形成帶有CCGG粘性粘性末端的末端的DNA片段，而后者并不形成粘性末端。片段，而后者并不形成粘性末端。 當(dāng)然，也有識(shí)別順序和切點(diǎn)都相同的酶，如當(dāng)然，也有識(shí)別順序和切點(diǎn)都相同的酶，如Hap II、Hpa II、Mno I，都在識(shí)別順序，都在識(shí)別順序CCGG內(nèi)有一相同的切點(diǎn)內(nèi)有一相同的切點(diǎn)，Hal III和和B

14、suR I同樣在識(shí)別順序同樣在識(shí)別順序GGCC內(nèi)有一相同的切內(nèi)有一相同的切點(diǎn)。點(diǎn)。限制性內(nèi)切酶23 用限制性內(nèi)切酶把用限制性內(nèi)切酶把DNA切割成一定大小切割成一定大小的片斷，這些酶解片斷的排列順序就叫的片斷，這些酶解片斷的排列順序就叫DNA的限制酶圖譜。的限制酶圖譜。 圖譜制作簡單，將純化的圖譜制作簡單，將純化的DNA用不同的用不同的限制性內(nèi)切酶切割，進(jìn)行凝膠電泳分析，確限制性內(nèi)切酶切割，進(jìn)行凝膠電泳分析，確立了立了DNA限制酶圖譜后，就可以測(cè)定每個(gè)限制酶圖譜后，就可以測(cè)定每個(gè)DNA片斷的堿基順序，最后排列出完整的片斷的堿基順序，最后排列出完整的DNA分子堿基順序。分子堿基順序。(二）二）DN

15、A的限制酶圖譜的限制酶圖譜核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)24DNA序列測(cè)定技術(shù)從序列測(cè)定技術(shù)從60年年代最早提出設(shè)想至今，已代最早提出設(shè)想至今，已經(jīng)日臻完善，測(cè)定序列的經(jīng)日臻完善，測(cè)定序列的技術(shù)也越來越簡化，在各技術(shù)也越來越簡化，在各項(xiàng)研究工作中的地位也日項(xiàng)研究工作中的地位也日趨重要。趨重要。 核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)25DNA序列測(cè)定l對(duì)于較小片斷（500bp)的DNA,可直接利用質(zhì)粒系統(tǒng)（如PUC18，PUC19等）測(cè)序。26DNA序列測(cè)定對(duì)于大片段對(duì)于大片段DNA，可采用：，可采用：l限制性片斷亞克隆法限制性片斷亞克隆法 對(duì)對(duì)DNA進(jìn)行酶切分析，確定酶譜后，以合適的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切分析，確定酶譜后，以合適的限

16、制性內(nèi)切酶降解以制備各種長度的限制酶片斷，并亞克隆到測(cè)序載體上建降解以制備各種長度的限制酶片斷，并亞克隆到測(cè)序載體上建立亞克隆庫，然后測(cè)亞克隆立亞克隆庫，然后測(cè)亞克隆DNA序列，通過排列分析，確定序列，通過排列分析，確定DNA片斷的全序列片斷的全序列l(wèi)隨機(jī)法（鳥槍測(cè)序法）隨機(jī)法（鳥槍測(cè)序法） 利用一定的方法將目的利用一定的方法將目的DNA隨機(jī)打斷成大小不同的片斷隨機(jī)打斷成大小不同的片斷并獲得亞克隆，收集這些亞克隆的并獲得亞克隆，收集這些亞克隆的DNA資料，通過計(jì)算機(jī)處理資料，通過計(jì)算機(jī)處理而獲得目的而獲得目的DNA的全部序列。的全部序列。27DNA序列測(cè)定l傳統(tǒng)的序列測(cè)定技術(shù)有兩種，傳統(tǒng)的序列

17、測(cè)定技術(shù)有兩種，Sanger 等等(1977)提出的酶法及提出的酶法及Maxam和和Gibert(1977)提提出的化學(xué)降解法。出的化學(xué)降解法。 28lSanger雙脫氧鏈終止法使用特異引物雙脫氧鏈終止法使用特異引物 在在DNA聚合酶作用下進(jìn)行延伸反應(yīng)，在聚合酶作用下進(jìn)行延伸反應(yīng)，在DNA合成反應(yīng)合成反應(yīng)混合物的混合物的4種普通種普通dNTP中，加入少量的一種雙中，加入少量的一種雙脫氧核苷三磷酸脫氧核苷三磷酸(ddNTP)作為鏈終止劑，由于作為鏈終止劑，由于ddNTP在脫氧核糖的在脫氧核糖的3位置缺少一個(gè)羥基，不位置缺少一個(gè)羥基，不能與后續(xù)的能與后續(xù)的dNTP形成磷酸二酯鍵，從而使形成磷酸二酯

18、鍵，從而使DNA鏈中斷。鏈中斷。 DNA序列測(cè)定2930l反應(yīng)產(chǎn)物是一系列的核苷酸鏈，它們將分別反應(yīng)產(chǎn)物是一系列的核苷酸鏈，它們將分別終止模板鏈的每一個(gè)終止模板鏈的每一個(gè)A，每一個(gè)，每一個(gè)C，每一個(gè)，每一個(gè)G或每一個(gè)或每一個(gè)T的位置上。的位置上。 31DNA序列測(cè)定3233l化學(xué)降解法原理是用某些專用的化學(xué)試劑修飾各種化學(xué)降解法原理是用某些專用的化學(xué)試劑修飾各種堿基，使相應(yīng)的糖苷鍵變得不穩(wěn)定，在哌啶的作用下，堿基，使相應(yīng)的糖苷鍵變得不穩(wěn)定，在哌啶的作用下，糖苷鍵斷裂，從而得到以特定堿基結(jié)尾的一系列糖苷鍵斷裂，從而得到以特定堿基結(jié)尾的一系列DNA片段，經(jīng)電泳分離，推斷出堿基的序列。片段，經(jīng)電泳分

19、離，推斷出堿基的序列。DNA序列測(cè)定34經(jīng)過大量的篩選，發(fā)現(xiàn)以下幾種試劑與哌啶一起經(jīng)過大量的篩選，發(fā)現(xiàn)以下幾種試劑與哌啶一起作用，可以在特定的堿基部位斷鍵：作用，可以在特定的堿基部位斷鍵：1 硫酸二甲酯哌啶硫酸二甲酯哌啶 在在G處斷鍵處斷鍵2 HCl+哌啶哌啶 在在A和和G處斷鍵處斷鍵3 水合肼哌啶水合肼哌啶 在在C和和T處斷鍵處斷鍵4 水合肼水合肼2MNaCl+哌啶哌啶 在在C處斷鍵處斷鍵35化學(xué)裂解法測(cè)定化學(xué)裂解法測(cè)定DNA序列示意圖序列示意圖 36DNA序列測(cè)定l近年來隨著近年來隨著PCR技術(shù)和技術(shù)和M13噬菌體及噬菌噬菌體及噬菌體載體的發(fā)展，也由于現(xiàn)成的合成引物唾手體載體的發(fā)展，也由于

20、現(xiàn)成的合成引物唾手可得及測(cè)序反應(yīng)日臻完善，雙脫氧鏈終止法可得及測(cè)序反應(yīng)日臻完善，雙脫氧鏈終止法得到廣泛應(yīng)用，市場(chǎng)上多數(shù)廠家生產(chǎn)的測(cè)序得到廣泛應(yīng)用，市場(chǎng)上多數(shù)廠家生產(chǎn)的測(cè)序試劑盒，測(cè)序儀器均按此原理設(shè)計(jì)，試劑盒，測(cè)序儀器均按此原理設(shè)計(jì)， 37DNA序列測(cè)定l標(biāo)記物的種類也日益增多，除了放射性標(biāo)標(biāo)記物的種類也日益增多，除了放射性標(biāo)記外，還有多種熒光標(biāo)記，除了標(biāo)記在特記外，還有多種熒光標(biāo)記，除了標(biāo)記在特異的引物上，還可標(biāo)記在異的引物上，還可標(biāo)記在ddNTP上，還可上，還可同時(shí)將四種不同的熒光分別標(biāo)記在同時(shí)將四種不同的熒光分別標(biāo)記在A，C，G，T上，在一個(gè)反應(yīng)中完成測(cè)序，各種核上，在一個(gè)反應(yīng)中完成測(cè)序

21、，各種核酸混合物在通過熒光檢測(cè)系統(tǒng)時(shí)，可根據(jù)酸混合物在通過熒光檢測(cè)系統(tǒng)時(shí)，可根據(jù)四種不同的熒光一次性將測(cè)序閱讀完畢。四種不同的熒光一次性將測(cè)序閱讀完畢。 38l一、材料：一、材料：l1、測(cè)序、測(cè)序DNA聚合酶聚合酶 33U/ll2、酶稀釋緩沖液、酶稀釋緩沖液l3、反應(yīng)緩沖液、反應(yīng)緩沖液39l4、 ddATP混合物：混合物：dATP,dCTP,dGTP,dTTP各各150M，ddATP 3MlddCTP混合物：混合物：dATP,dCTP,dGTP,dTTP各各150M，ddCTP 3MlddGTP混合物：混合物：dATP,dCTP,dGTP,dTTP各各150M，ddGTP 3MlddTTP混合

22、物：混合物：dATP,dCTP,dGTP,dTTP各各150M，ddTTP 3M質(zhì)粒測(cè)序方法40l5、甲酰胺上樣緩沖液、甲酰胺上樣緩沖液l6、標(biāo)記引物、標(biāo)記引物 2pmol/ll7、1.5ml薄壁離心管薄壁離心管l8、PCR自動(dòng)熱循環(huán)儀自動(dòng)熱循環(huán)儀質(zhì)粒測(cè)序方法411、取、取4個(gè)個(gè)0.2l薄壁管，分別標(biāo)記薄壁管，分別標(biāo)記A，C，G，T，置于冰上。，置于冰上。質(zhì)粒測(cè)序方法2、分別加入、分別加入3lddATP混合物，混合物，ddCTP混合混合物，物，ddGTP混合物，混合物，ddTTP混合物至標(biāo)好混合物至標(biāo)好的的A，C，G ，T管內(nèi)，蓋好蓋子，以防蒸管內(nèi)，蓋好蓋子，以防蒸發(fā)。發(fā)。423、用酶稀釋液稀

23、釋測(cè)序、用酶稀釋液稀釋測(cè)序DNA聚合酶：聚合酶：4個(gè)反個(gè)反應(yīng)需用應(yīng)需用7l稀釋緩沖液加稀釋緩沖液加3l測(cè)序測(cè)序DNA聚合酶，聚合酶，從而得到從而得到10l濃度為濃度為10U/l的測(cè)序的測(cè)序DNA聚合酶。聚合酶。質(zhì)粒測(cè)序方法434、配制反應(yīng)混合液：、配制反應(yīng)混合液：反應(yīng)緩沖液反應(yīng)緩沖液 3l2pmol/l標(biāo)記引物標(biāo)記引物 1l待測(cè)質(zhì)粒待測(cè)質(zhì)粒DNA0.2g/l 1l水水 14l稀釋好的酶稀釋好的酶 2l總體積總體積 20l質(zhì)粒測(cè)序方法445、混勻后在標(biāo)好的、混勻后在標(biāo)好的A，C，G，T管內(nèi)分別加入管內(nèi)分別加入5l反應(yīng)混合液，混勻加反應(yīng)混合液，混勻加1020l石蠟油。石蠟油。6、進(jìn)行、進(jìn)行PCR循

24、環(huán)：循環(huán)：注意：退火溫度主要依賴于引物的特異序列，以注意：退火溫度主要依賴于引物的特異序列，以及模板純度，下面僅介紹一般程序：及模板純度，下面僅介紹一般程序：95 預(yù)變性預(yù)變性1分鐘分鐘50 30”70 60”95 30”共共30個(gè)循環(huán)。個(gè)循環(huán)。質(zhì)粒測(cè)序方法457、加、加8l甲酰胺上樣緩沖液，混勻甲酰胺上樣緩沖液，混勻8、取、取2l電泳電泳9、如果是熒光標(biāo)記，可由測(cè)序儀自動(dòng)分析、如果是熒光標(biāo)記，可由測(cè)序儀自動(dòng)分析測(cè)序結(jié)果；如果標(biāo)記物為放射性，則凝膠測(cè)序結(jié)果；如果標(biāo)記物為放射性，則凝膠電泳結(jié)束后用膠片放射自顯影，然后以膠電泳結(jié)束后用膠片放射自顯影，然后以膠片上讀結(jié)果。片上讀結(jié)果。質(zhì)粒測(cè)序方法46

25、質(zhì)粒測(cè)序方法4748SequenceAnalyzer質(zhì)粒測(cè)序方法49一、一、DNADNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)的二級(jí)結(jié)構(gòu)（1 1）二級(jí)結(jié)構(gòu)的含義）二級(jí)結(jié)構(gòu)的含義: : DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)是指的二級(jí)結(jié)構(gòu)是指DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)。的雙螺旋結(jié)構(gòu)。 絕大多數(shù)絕大多數(shù)DNA是由兩條多脫氧核苷酸鏈構(gòu)是由兩條多脫氧核苷酸鏈構(gòu)成的雙鏈分子或雙鏈環(huán)狀分子，只有少數(shù)病毒成的雙鏈分子或雙鏈環(huán)狀分子，只有少數(shù)病毒為為DNA單鏈環(huán)狀分子（如單鏈環(huán)狀分子（如M13,X174)50（2 2）DNADNA堿基組成的特點(diǎn)堿基組成的特點(diǎn)ChargaffChargaff定律定律 堿基當(dāng)量定律堿基當(dāng)量定律 A+G=T+CA+G=T+C 不對(duì)稱比率不

26、對(duì)稱比率 A+T/G+CA+T/G+C（3 3）二級(jí)結(jié)構(gòu)的典型結(jié)構(gòu)）二級(jí)結(jié)構(gòu)的典型結(jié)構(gòu) B-DNA(Watson & CrickB-DNA(Watson & Crick模型模型,1953,1953年）年）DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)51DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)52DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)53DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)54DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)的雙螺旋結(jié)構(gòu)DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)55 右手螺旋，有大溝和小溝右手螺旋，有大溝和小溝 2. 直徑直徑20，10個(gè)堿基組成一個(gè)螺旋，個(gè)堿基組成一個(gè)螺旋，沿中心軸上升沿中心軸上升3.4 3. 磷酸和戊糖組成的鏈位于外側(cè)，堿磷酸和戊糖組成的鏈位于外側(cè)，堿基位于內(nèi)側(cè)基位于內(nèi)側(cè) 4. A和和T配對(duì)

27、，配對(duì)，G和和C配對(duì)配對(duì) 5.維持雙螺旋結(jié)構(gòu)的主要力：氫鍵和堿維持雙螺旋結(jié)構(gòu)的主要力：氫鍵和堿基堆積力基堆積力DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)56類型類型 旋轉(zhuǎn)旋轉(zhuǎn)方向方向 螺旋螺旋直徑直徑nm 螺距螺距nm 每轉(zhuǎn)堿每轉(zhuǎn)堿基對(duì)數(shù)基對(duì)數(shù)目目 堿基對(duì)垂堿基對(duì)垂直距離直距離nm 堿基對(duì)堿基對(duì)與水平與水平面傾角面傾角 A-DNA右右 2.3 2.8110.25520B-DNA右右 2.03.4100.3400C-DNA右右 3.19.30.3106Z-DNA左左1.84.5120.370-9DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)57DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)58DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)59回文結(jié)構(gòu)鏡像重復(fù)三股螺旋（H-DNA）DNA的其它結(jié)構(gòu)60DNA的其

28、它結(jié)構(gòu)61AATTCAAGGGAGAAGTATAGAAGAGGGAAGGATCTTAAGTTCCCTCT TCATATCT TCTCCCTTCCTAG 存在于同一股上的某些DNA區(qū)段的反向重復(fù)序列。此序列各單股中沒有互補(bǔ)序列，不能形成十字型或發(fā)夾結(jié)構(gòu)。DNA的其它結(jié)構(gòu)62DNADNA三股螺旋（三股螺旋（H-DNA,ts-DNAH-DNA,ts-DNA）DNA的其它結(jié)構(gòu)63646566雙螺旋進(jìn)一步扭曲形成的超螺旋。是雙螺旋進(jìn)一步扭曲形成的超螺旋。是一種比雙螺旋更高層次的空間構(gòu)象。一種比雙螺旋更高層次的空間構(gòu)象。包括：包括：線狀線狀DNADNA形成的紐結(jié)、超螺旋形成的紐結(jié)、超螺旋和多重螺旋、環(huán)狀和

29、多重螺旋、環(huán)狀DNADNA形成的結(jié)、超形成的結(jié)、超螺旋和連環(huán)等螺旋和連環(huán)等67DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)68DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)69 RNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)是由數(shù)量極其龐大的四種的一級(jí)結(jié)構(gòu)是由數(shù)量極其龐大的四種核糖核酸（核糖核酸（AMP、GMP、CMP、UMP）按）按一定順序，通過一定順序，通過3 ，5 磷酸二酯鍵連成的線磷酸二酯鍵連成的線形分子。形分子。 RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)是短的，不完全螺旋的多的二級(jí)結(jié)構(gòu)是短的，不完全螺旋的多核苷酸鏈。核苷酸鏈。 RNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)是在莖環(huán)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進(jìn)一的三級(jí)結(jié)構(gòu)是在莖環(huán)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進(jìn)一步扭曲折疊而成的復(fù)雜結(jié)構(gòu)。步扭曲折疊而成的復(fù)雜結(jié)構(gòu)。70tRNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)的一級(jí)結(jié)構(gòu) 由由7493

30、個(gè)（多為個(gè)（多為76個(gè)）核苷酸組成單鏈個(gè)）核苷酸組成單鏈 ； 具有不變的（恒定的）核苷酸具有不變的（恒定的）核苷酸:U8 、G18 、 G19 ； 含較多的修飾核苷酸；含較多的修飾核苷酸； 5端多為端多為PG , 3端多為端多為CCAOH 。2.tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)的二級(jí)結(jié)構(gòu)三葉草結(jié)構(gòu)三葉草結(jié)構(gòu) 具有四臂四環(huán)，具有四臂四環(huán)， 3端為端為CCAOH 序列序列 ， 5端為端為PG 3. tRNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)的三級(jí)結(jié)構(gòu)倒倒L形結(jié)構(gòu)形結(jié)構(gòu)RNA的結(jié)構(gòu)71RNA的結(jié)構(gòu)72RNA的結(jié)構(gòu)73RNA的結(jié)構(gòu)74 rRNA是核糖體的組成成分,其種類和大小用S表示。 30S 16S原核生物 70S 23S 50S 5S

31、 40S 18S真核生物 80S 28S 60S 5.8S 5SRNA的結(jié)構(gòu)75RNA的結(jié)構(gòu)7677一一. .一般理化性質(zhì)一般理化性質(zhì)1.晶形晶形DNA為白色纖維狀固體；為白色纖維狀固體；RNA為白色粉末狀固體為白色粉末狀固體2.溶解性溶解性均溶于水；不溶于一般有機(jī)溶劑，在均溶于水；不溶于一般有機(jī)溶劑，在70%乙醇中乙醇中形成沉淀；形成沉淀； 在在0.14MNaCl 和和 12MNaCl中中 DNA-蛋白蛋白 溶解度低溶解度低 溶解度高溶解度高 RNA-蛋白蛋白 溶解度高溶解度高 溶解度低溶解度低3.粘度粘度 DNA粘度很大粘度很大 RNA粘度小得多粘度小得多4.旋光性旋光性 均很強(qiáng)均很強(qiáng)5密

32、度及沉降性密度及沉降性密度：密度：RNA雙鏈雙鏈DNA；環(huán)狀；環(huán)狀DNA 開環(huán)、線狀開環(huán)、線狀DNA78純純DNA OD260/OD280=1.8純純RNA OD260/OD280=2.0 嘌呤堿和嘧啶堿具有嘌呤堿和嘧啶堿具有共軛雙鍵，使共軛雙鍵，使DNA和和RNA在在240290nm處有處有強(qiáng)烈紫外吸收，最大吸收強(qiáng)烈紫外吸收，最大吸收260nm核酸的性質(zhì)79密度：密度： RNA雙鏈雙鏈DNA； 環(huán)狀環(huán)狀DNA 開環(huán)、線狀開環(huán)、線狀DNA 單鏈單鏈DNA 雙鏈雙鏈DNA 沉降速度：沉降速度： RNA 環(huán)狀環(huán)狀DNA 開環(huán)、線狀開環(huán)、線狀DNA核酸的性質(zhì)80四.核酸的變性、復(fù)性變性：指雙螺旋區(qū)氫

33、鍵斷裂變成單鏈，不涉及一級(jí)結(jié)構(gòu)破壞的過程。復(fù)性：變性DNA在適當(dāng)條件下，又可使兩條分開的鏈重新締合成雙螺旋的過程。核酸的性質(zhì)81核酸的性質(zhì)82一、核酸電泳一、核酸電泳最常用：凝膠電泳最常用：凝膠電泳優(yōu)點(diǎn)：簡單，快速，靈敏，成本低。優(yōu)點(diǎn)：簡單，快速，靈敏，成本低。常用有：瓊脂糖凝膠電泳；聚丙烯酰胺凝膠電泳常用有：瓊脂糖凝膠電泳；聚丙烯酰胺凝膠電泳83 常用于分析常用于分析DNA，用于分析，用于分析RNA時(shí)，由時(shí)，由于其常含有于其常含有RNA酶，必須先加蛋白質(zhì)變性劑酶，必須先加蛋白質(zhì)變性劑（如甲醛等）處理后才能用于分析（如甲醛等）處理后才能用于分析核酸的研究方法841 核酸分子大?。号c分子量大小對(duì)

34、數(shù)成反比。核酸分子大小：與分子量大小對(duì)數(shù)成反比。2 膠濃度：遷移率與膠濃度成反比，常用膠濃度：遷移率與膠濃度成反比，常用1凝膠。凝膠。3 DNA構(gòu)象：超螺旋最快，線形構(gòu)象：超螺旋最快，線形DNA其次，開環(huán)形最其次，開環(huán)形最慢。慢。4 電流：一般不大于電流：一般不大于5v/cm。5 堿基組成：有影響，但不大。堿基組成：有影響，但不大。6 溫度：溫度：430，常在室溫下進(jìn)行，常在室溫下進(jìn)行核酸的研究方法85 電泳完畢，將凝膠在溴乙錠溶液中染色電泳完畢，將凝膠在溴乙錠溶液中染色（0.5ug/ml)。 溴乙錠為一扁平分子，很容易插入溴乙錠為一扁平分子，很容易插入DNA堿基堿基對(duì)之間。對(duì)之間。 DNA與

35、溴乙錠結(jié)合后，經(jīng)紫外光照射，可發(fā)與溴乙錠結(jié)合后，經(jīng)紫外光照射，可發(fā)射出紅橙色的可見熒光。射出紅橙色的可見熒光。0.1ugDNA即可檢出。即可檢出。核酸的研究方法86加入交連劑加入交連劑其孔徑比瓊脂糖小，所以用于分子小于其孔徑比瓊脂糖小，所以用于分子小于1000bp的的DNA片斷。另外，一般不含片斷。另外，一般不含RNA酶，所以可以酶，所以可以用于用于RNA分析。分析。 聚丙烯酰胺凝膠電泳的樣品，經(jīng)溴乙錠染色聚丙烯酰胺凝膠電泳的樣品，經(jīng)溴乙錠染色后，在紫外光下，發(fā)出的熒光很弱，所以，濃度后，在紫外光下，發(fā)出的熒光很弱，所以，濃度很低的樣品不能用此法檢測(cè)。很低的樣品不能用此法檢測(cè)。 核酸的研究方法

36、87核酸的研究方法88核酸的研究方法89核酸的研究方法90核酸的研究方法91 紫外照射下切下所需紫外照射下切下所需DNA,切下的膠條放于透析切下的膠條放于透析袋中，裝上電泳緩沖液，在水平槽中進(jìn)行電泳，袋中，裝上電泳緩沖液，在水平槽中進(jìn)行電泳，34小時(shí)后，小時(shí)后，DNA將電泳出來并粘在透析袋內(nèi)壁上將電泳出來并粘在透析袋內(nèi)壁上，將電極倒轉(zhuǎn)，通電，將電極倒轉(zhuǎn)，通電3060秒，粘在內(nèi)壁上的秒，粘在內(nèi)壁上的DNA會(huì)釋放到緩沖溶液中，去膠條，用苯酚抽提會(huì)釋放到緩沖溶液中，去膠條，用苯酚抽提12次，水相用乙醇沉淀次，水相用乙醇沉淀DNA。這樣回收的。這樣回收的DNA純純度很高度很高。核酸的研究方法9293聚

37、合酶鏈反應(yīng)聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。擴(kuò)增技術(shù)。 它能在一個(gè)試管內(nèi)將所要研究的目的它能在一個(gè)試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一基因或某一DNA片段于數(shù)小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增至十萬乃至片段于數(shù)小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增至十萬乃至百萬倍百萬倍,使肉眼能直接觀察和判斷。過去幾天幾星使肉眼能直接觀察和判斷。過去幾天幾星期才能做到的事情，用期才能做到的事情，用PCR幾小時(shí)便可完成。幾小時(shí)便可完成。PCR技術(shù)是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的一項(xiàng)革命性創(chuàng)舉和技術(shù)是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的一項(xiàng)革命性創(chuàng)舉和里程碑。里程碑。PCR技術(shù)9495llP

38、CR的最早設(shè)想：的最早設(shè)想： 本世紀(jì)本世紀(jì)60年代末、年代末、70年代初人們致力于研究基因的體外分離年代初人們致力于研究基因的體外分離技術(shù)，技術(shù)，Korana于于1971年最早提出核酸體外年最早提出核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想：擴(kuò)增的設(shè)想：“經(jīng)過經(jīng)過DNA變性，與合適的變性，與合適的引物雜交，用引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆斷重復(fù)該過程便可克隆tRNA基因基因”。 PCR技術(shù)96lDNA的復(fù)制l核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想l聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35解旋酶解鏈

39、酶DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長PCR技術(shù)97lDNA的復(fù)制l核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想l聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長GGAUCG5AUCGCG5引物酶引物酶RNA引物RNA引物PCR技術(shù)98lDNA的復(fù)制l核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想l聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長GGAUCG5AUCGCG5TAGCGCTATCGCATCGACGCT3ATAG

40、CGTAGCTGCGACCTAGC3DNA聚合酶DNA聚合酶PCR技術(shù)99lDNA的復(fù)制l核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想l聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA的變性與復(fù)性變性復(fù)性加熱退火ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35PCR技術(shù)100PCR的實(shí)現(xiàn)：的實(shí)現(xiàn)： 19851985年，美國年，美國PE-CetusPE-Cetus公公司的司的MullisMullis等人發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)（等人發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)（PCRPCR）基本

41、原理是在試管中模擬細(xì)胞內(nèi)的基本原理是在試管中模擬細(xì)胞內(nèi)的DNADNA復(fù)制復(fù)制最初采用最初采用E-coli DNAE-coli DNA聚合酶進(jìn)行聚合酶進(jìn)行PCRPCR，由于，由于該酶不耐熱，使這一過程耗時(shí)，費(fèi)力，且該酶不耐熱，使這一過程耗時(shí)，費(fèi)力，且易出錯(cuò)易出錯(cuò)耐熱耐熱DNADNA聚合酶的應(yīng)用使得聚合酶的應(yīng)用使得PCRPCR能高效率的能高效率的進(jìn)行，隨后進(jìn)行，隨后PE-CetusPE-Cetus公司推出了第一臺(tái)公司推出了第一臺(tái)PCRPCR自動(dòng)化熱循環(huán)儀自動(dòng)化熱循環(huán)儀19931993年，年，MullisMullis等因此項(xiàng)技術(shù)獲諾貝爾化等因此項(xiàng)技術(shù)獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)學(xué)獎(jiǎng)PCR技術(shù)101lPCR的改進(jìn)與

42、完善：的改進(jìn)與完善：Mullis最初使用的最初使用的DNA聚合聚合酶是大腸桿菌酶是大腸桿菌 DNA 聚合酶聚合酶 I 的一個(gè)片段，其缺點(diǎn)是：的一個(gè)片段，其缺點(diǎn)是：此酶不耐高溫，此酶不耐高溫， 90會(huì)變性失活，每次循環(huán)都要會(huì)變性失活，每次循環(huán)都要重新加。重新加。PCR技術(shù)102l其其PCR產(chǎn)物特異性較差，合成的產(chǎn)物特異性較差，合成的DNA片段不均片段不均一。一。 引物鏈延伸反應(yīng)在引物鏈延伸反應(yīng)在37下進(jìn)行，容易發(fā)生模板下進(jìn)行，容易發(fā)生模板和引物之間的堿基錯(cuò)配，此種酶催化的和引物之間的堿基錯(cuò)配，此種酶催化的PCR技術(shù)技術(shù)雖較傳統(tǒng)的基因擴(kuò)增具備許多突出的優(yōu)點(diǎn)，但由于雖較傳統(tǒng)的基因擴(kuò)增具備許多突出的優(yōu)

43、點(diǎn)，但由于酶不耐熱，在酶不耐熱，在DNA模板進(jìn)行熱變性時(shí)，會(huì)導(dǎo)致此模板進(jìn)行熱變性時(shí)，會(huì)導(dǎo)致此酶鈍化，每加入一次酶只能完成一個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)周期，酶鈍化，每加入一次酶只能完成一個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)周期，給給PCR技術(shù)操作程序添了不少困難。這使得技術(shù)操作程序添了不少困難。這使得PCR技術(shù)在一段時(shí)間內(nèi)沒能引生物醫(yī)學(xué)界的足夠重視。技術(shù)在一段時(shí)間內(nèi)沒能引生物醫(yī)學(xué)界的足夠重視。PCR技術(shù)103l1988年初，年初，Keohanog改用改用T4 DNA聚合酶進(jìn)行聚合酶進(jìn)行PCR，其擴(kuò)增的其擴(kuò)增的DNA片段很均一，真實(shí)性也較高，只有所片段很均一，真實(shí)性也較高，只有所期望的一種期望的一種DNA片段。但每循環(huán)一次，仍需加入新片段

44、。但每循環(huán)一次，仍需加入新酶。酶。PCR技術(shù)104l1988年年Saiki 等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌(thermus aquaticus) 中提取到一種耐熱中提取到一種耐熱DNA聚合酶。為與聚合酶。為與大腸桿菌多聚酶大腸桿菌多聚酶I Klenow片段區(qū)別，將此酶命名為片段區(qū)別，將此酶命名為Taq DNA多聚酶多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的發(fā)現(xiàn)使。此酶的發(fā)現(xiàn)使PCR廣廣泛的被應(yīng)用。泛的被應(yīng)用。 PCR技術(shù)105Taq DNA聚合酶的特點(diǎn)：聚合酶的特點(diǎn)：l耐高溫，在耐高溫，在70下反應(yīng)下反應(yīng)2h后其殘留活性大于原來的后其殘留活性大于原

45、來的90%，在在93下反應(yīng)下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來的后其殘留活性是原來的60%，在，在95下反下反應(yīng)應(yīng)2h后其殘留活性是原來的后其殘留活性是原來的40%。l在熱變性時(shí)不會(huì)被鈍化，不必在每次擴(kuò)增反應(yīng)后再加新在熱變性時(shí)不會(huì)被鈍化，不必在每次擴(kuò)增反應(yīng)后再加新酶。酶。l大大提高了擴(kuò)增片段特異性和擴(kuò)增效率，增加了擴(kuò)增長大大提高了擴(kuò)增片段特異性和擴(kuò)增效率，增加了擴(kuò)增長度度(2.0Kb)。由于提高了擴(kuò)增的特異性和效率，因而其靈敏。由于提高了擴(kuò)增的特異性和效率，因而其靈敏性也大大提高。性也大大提高。PCR技術(shù)106lPCR反應(yīng)條件lPCR過程lPCR的特點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)的PCRPCR反應(yīng)體系反應(yīng)體系4種dNT

46、P混合物 各200umol/L引物 各10100pmol模板DNA 0. .12ugTaq DNA聚合酶 2. .5uMg2+ 1. .5mmol/LPCR技術(shù)107lPCR反應(yīng)條件lPCR過程lPCR的特點(diǎn)108lPCR反應(yīng)條件lPCR過程lPCR的特點(diǎn)109110lPCR反應(yīng)條件lPCR過程lPCR的特點(diǎn)1234522557294時(shí)間（min）溫度（）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)13步2530輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNADNA雙螺旋雙螺旋DNADNA單鏈單鏈與引物復(fù)性與引物復(fù)性DNADNA變性變性形成形成2 2條單鏈條單鏈子鏈延伸子鏈延伸DNADNA加倍加倍PCR技術(shù)11

47、1lPCR反應(yīng)條件lPCR過程lPCR的特點(diǎn)1234522557294時(shí)間（min）溫度（）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)13步2530輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性子鏈延伸DNA加倍DNA變性形成2條單鏈模板DNA95PCR技術(shù)112lPCR反應(yīng)條件lPCR過程lPCR的特點(diǎn)95 50引物1引物2DNADNA引物引物PCR技術(shù)113lPCR反應(yīng)條件lPCR過程lPCR的特點(diǎn)50引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶PCR技術(shù)114lPCR反應(yīng)條件lPCR過程lPCR的特點(diǎn)72第1輪結(jié)束95第2輪開始PCR技術(shù)115lPCR反應(yīng)條件lPCR過程lPC

48、R的特點(diǎn)955072TaqTaqTaqTaqPCR技術(shù)116lPCR反應(yīng)條件lPCR過程lPCR的特點(diǎn)72第2輪結(jié)束PCR技術(shù)117lPCR反應(yīng)條件lPCR過程lPCR的特點(diǎn)重復(fù)30輪后230=1,073,741,824模板DNA第1輪擴(kuò)增第2輪擴(kuò)增第3輪擴(kuò)增第4輪擴(kuò)增 第5輪擴(kuò)增第6輪擴(kuò)增PCR技術(shù)118理想拷貝數(shù)=2n n 循環(huán)次數(shù)實(shí)際拷貝數(shù)=(1+x)n X 平均效率,約為0.85 n 循環(huán)次數(shù) PCR技術(shù)119lPCR反應(yīng)條件lPCR過程lPCR的特點(diǎn)電泳分析PCR技術(shù)120lPCR反應(yīng)條件lPCR過程lPCR的特點(diǎn)電泳分析121lPCR反應(yīng)條件lPCR過程lPCR的特點(diǎn)靈敏度高靈敏度

49、高皮克皮克(pg=10(pg=10-12-12) )量級(jí)擴(kuò)增到微克量級(jí)擴(kuò)增到微克(ug=10(ug=10-6-6) )水平水平能從能從100100萬個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞萬個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞病毒檢測(cè)的靈敏度可達(dá)病毒檢測(cè)的靈敏度可達(dá)3 3個(gè)個(gè)RFURFU細(xì)菌檢測(cè)的最小檢出率為細(xì)菌檢測(cè)的最小檢出率為3 3個(gè)細(xì)菌個(gè)細(xì)菌簡便、快速簡便、快速一次性加好反應(yīng)液，一次性加好反應(yīng)液，2 24 4 小時(shí)完成擴(kuò)增小時(shí)完成擴(kuò)增擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析對(duì)標(biāo)本的純度要求低對(duì)標(biāo)本的純度要求低血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等組織的粗提等組織的粗提DN

50、ADNAPCR技術(shù)122儀器型號(hào)儀器型號(hào)生產(chǎn)廠家生產(chǎn)廠家型式型式特點(diǎn)特點(diǎn)管數(shù)管數(shù)報(bào)價(jià)報(bào)價(jià)1109型型 北京新北京新技術(shù)所技術(shù)所與軍科院聯(lián)合與軍科院聯(lián)合 變溫水浴變溫水浴 電子調(diào)溫電子調(diào)溫400.5ml 6400元元/臺(tái)臺(tái) 90A/B型型中科院遺傳所中科院遺傳所 機(jī)械臂變溫水浴機(jī)械臂變溫水浴電熱電熱14000元元/臺(tái)臺(tái)PTC-51A/B型型軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院變溫氣流變溫氣流電子調(diào)兼作套式電子調(diào)兼作套式300.5ml12000元元/臺(tái)臺(tái)DNA Thermal CyclerPerkin ElmerCetus(美美)變溫鋁塊變溫鋁塊壓縮機(jī)致冷壓縮機(jī)致冷480.5mlUS $ 20000.-T

51、hermocycler 60 00 180B.BraunBiotech(德德)變溫水浴變溫水浴98四檔四檔電熱電熱,自來水冷卻自來水冷卻601.5ml1001.5ml1801.5mlDM 30000.Automatic temperature Cy-cler Single Block Twin BlockEricomp Inc.(美美)變溫鋁塊變溫鋁塊25100電熱電熱,自來水冷卻自來水冷卻291.5ml581.5mlUS $4985.-US $7980.-Grant AutogenGrant Instrumant Ltd(美美)變溫水浴變溫水浴099電熱電熱,自來水冷卻自來水冷卻或加冷循環(huán)器

52、或加冷循環(huán)器501.5ml or501.5ml US $3500Techne PHC-1PHC-2Techne Ltd.(英英)變溫鋁塊變溫鋁塊099三檔三檔電熱電熱500W水冷水冷100W540.5ml540.5ml241.5ml3383. 3997. -BioOvenBioThrm Corp(美美)變溫氣流變溫氣流-150115V 11A200s of 496plateUS $ 2990. -Trio-Thermo-block TB-1Biomertra(德德)半導(dǎo)體變溫半導(dǎo)體變溫220V320管管分別控溫分別控溫DM12900. -Micro cycler EEppendorf(美美)變

53、溫鋁塊變溫鋁塊220V/100V329管管US $ 3500. -國內(nèi)外生產(chǎn)的幾種國內(nèi)外生產(chǎn)的幾種DNA擴(kuò)增儀擴(kuò)增儀 1232400型型PCR擴(kuò)增儀擴(kuò)增儀2700型型PCR擴(kuò)增儀擴(kuò)增儀 9600型型PCR擴(kuò)增儀擴(kuò)增儀9700型型PCR擴(kuò)增儀擴(kuò)增儀124一一 、概、概 述述 （一）（一） PCR反應(yīng)中的主要成份反應(yīng)中的主要成份 1. 引物引物 ：引物的好壞往往是：引物的好壞往往是PCR成敗的關(guān)成敗的關(guān)鍵。鍵。 1252PCR反應(yīng)系統(tǒng)的組成：反應(yīng)系統(tǒng)的組成： 耐熱耐熱DNA聚合酶（聚合酶（Taq酶）酶）模板模板DNA：即待分析的目的：即待分析的目的DNA，其長度不宜大于，其長度不宜大于10kb。

54、引物：為了保證引物：為了保證DNA聚合酶能夠?qū)蓷l互補(bǔ)鏈均能進(jìn)行延伸，聚合酶能夠?qū)蓷l互補(bǔ)鏈均能進(jìn)行延伸，需要兩種引物，分別位于兩條互補(bǔ)模板需要兩種引物，分別位于兩條互補(bǔ)模板DNA鏈的鏈的3-端。端。 四種四種dNTP。 緩沖溶液：保證緩沖溶液：保證DNA聚合酶催化時(shí)所需的適當(dāng)?shù)娜芤壕酆厦复呋瘯r(shí)所需的適當(dāng)?shù)娜芤簆H值。值。 1261.引物設(shè)計(jì)遵循的原則：引物設(shè)計(jì)遵循的原則： (1) 引物長度約為引物長度約為16-30bp， 太短會(huì)降低退火溫度影響引物與模板配對(duì)，從而使非太短會(huì)降低退火溫度影響引物與模板配對(duì)，從而使非特異性增高。太長則比較浪費(fèi)特異性增高。太長則比較浪費(fèi),且難以合成。且難以合成。(

55、2) 引物中引物中G+C含量通常為含量通常為40%-60%,可按下式粗略估計(jì)引物的解鏈溫度可按下式粗略估計(jì)引物的解鏈溫度 Tm4(G+C)+2(A+T).(3) 四種堿基應(yīng)隨機(jī)分布，在四種堿基應(yīng)隨機(jī)分布，在3端不存在連續(xù)端不存在連續(xù)3個(gè)個(gè)G或或C,因這樣易導(dǎo)致錯(cuò)誤引發(fā)。因這樣易導(dǎo)致錯(cuò)誤引發(fā)。(4) 引物引物3端最好與目的序列閱讀框架中密碼子第一或第二位核苷酸對(duì)應(yīng)端最好與目的序列閱讀框架中密碼子第一或第二位核苷酸對(duì)應(yīng), 以減少以減少由于密碼子擺動(dòng)產(chǎn)生的不配對(duì)。由于密碼子擺動(dòng)產(chǎn)生的不配對(duì)。(5) 在引物內(nèi)在引物內(nèi), 尤其在尤其在3端應(yīng)不存在二級(jí)結(jié)構(gòu)。端應(yīng)不存在二級(jí)結(jié)構(gòu)。(6) 兩引物之間尤其在兩引

56、物之間尤其在3端不能互補(bǔ)端不能互補(bǔ), 以防出現(xiàn)引物二聚體以防出現(xiàn)引物二聚體, 減少產(chǎn)量。兩引物間最減少產(chǎn)量。兩引物間最好不存在好不存在4個(gè)連續(xù)堿基的同源性或互補(bǔ)性。個(gè)連續(xù)堿基的同源性或互補(bǔ)性。 (7) 引物引物5端對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大端對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大, 可在引物設(shè)計(jì)時(shí)加上限制酶位點(diǎn)、核糖可在引物設(shè)計(jì)時(shí)加上限制酶位點(diǎn)、核糖 體結(jié)體結(jié)合位點(diǎn)、起始密碼子、缺失或插入突變位點(diǎn)以及標(biāo)記生物素、熒光素、地高辛等合位點(diǎn)、起始密碼子、缺失或插入突變位點(diǎn)以及標(biāo)記生物素、熒光素、地高辛等. 通常應(yīng)在通常應(yīng)在5端限制酶位點(diǎn)外再加端限制酶位點(diǎn)外再加1-2個(gè)保護(hù)堿基。個(gè)保護(hù)堿基。(8) 引物不與模板結(jié)合位點(diǎn)以外的

57、序列互補(bǔ)。所擴(kuò)增產(chǎn)物本身無穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)引物不與模板結(jié)合位點(diǎn)以外的序列互補(bǔ)。所擴(kuò)增產(chǎn)物本身無穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu), 以免產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增以免產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增,影響產(chǎn)量。影響產(chǎn)量。 (9) 簡并引物應(yīng)選用簡并程度低的密碼子簡并引物應(yīng)選用簡并程度低的密碼子, 例例如選用只有一種密碼子的如選用只有一種密碼子的Met, 3端應(yīng)不存在簡并性。否則可能由于產(chǎn)量低而看不端應(yīng)不存在簡并性。否則可能由于產(chǎn)量低而看不見擴(kuò)增產(chǎn)物。見擴(kuò)增產(chǎn)物。127 一般一般PCR反應(yīng)中的引物終濃度為反應(yīng)中的引物終濃度為0.2-1.0mol/L。引物過多。引物過多會(huì)產(chǎn)生錯(cuò)誤引導(dǎo)或產(chǎn)生引物二聚體會(huì)產(chǎn)生錯(cuò)誤引導(dǎo)或產(chǎn)生引物二聚體, 過低則降低產(chǎn)

58、量。過低則降低產(chǎn)量。利用紫外分光光度計(jì)利用紫外分光光度計(jì), 可精確計(jì)算引物濃度可精確計(jì)算引物濃度, 在在1cm光程比色杯光程比色杯中中,260nm下下,引物濃度可按下式計(jì)算：引物濃度可按下式計(jì)算：X mol/L OD260/ A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600) X: 引物摩爾濃度引物摩爾濃度,A、C、G、T: 引物中引物中4種不同堿基個(gè)數(shù)。種不同堿基個(gè)數(shù)。 128 dNTP應(yīng)用應(yīng)用NaOH 將將pH調(diào)至調(diào)至7.0,并用分光光度計(jì)測(cè)定并用分光光度計(jì)測(cè)定其準(zhǔn)確濃度其準(zhǔn)確濃度.dNTP原液可配成原液可配成5-10mmol/L并分裝并分裝,-20貯貯存。一般反應(yīng)中每種

59、存。一般反應(yīng)中每種dNTP的終濃度為的終濃度為20-200mol/L。理論。理論上上4 種種 dNTP各各20mol/L,足以在足以在100l反應(yīng)中合成反應(yīng)中合成2.6g的的DNA。當(dāng)。當(dāng)dNTP終濃度大于終濃度大于50mmol/L時(shí)可抑制時(shí)可抑制Taq DNA聚聚合酶的活性合酶的活性.4種種dNTP的濃度應(yīng)該相等的濃度應(yīng)該相等,以減少合成中由于某以減少合成中由于某種種dNTP的不足出現(xiàn)的錯(cuò)誤摻入。的不足出現(xiàn)的錯(cuò)誤摻入。 129 Mg2+濃度對(duì)濃度對(duì)Taq DNA聚合酶影響很大聚合酶影響很大,它可影響酶的活性它可影響酶的活性和真實(shí)性和真實(shí)性,影響引物退火和解鏈溫度影響引物退火和解鏈溫度, 影響

60、產(chǎn)物的特異性以及引影響產(chǎn)物的特異性以及引物二聚體的形成等。通常物二聚體的形成等。通常Mg2+ 濃度范圍為濃度范圍為0.5-2mmol/L.對(duì)于對(duì)于一種新的一種新的PCR反應(yīng)反應(yīng),可以用可以用0.1-5mmol/L的遞增濃度的的遞增濃度的Mg2+ 進(jìn)進(jìn)行預(yù)備實(shí)驗(yàn)行預(yù)備實(shí)驗(yàn),選出最適的選出最適的Mg2+濃度。在濃度。在PCR反應(yīng)混合物中反應(yīng)混合物中, 應(yīng)應(yīng)盡量減少有高濃度的帶負(fù)電荷的基團(tuán)盡量減少有高濃度的帶負(fù)電荷的基團(tuán), 例如磷酸基團(tuán)或例如磷酸基團(tuán)或EDTA等可能影響等可能影響Mg2+離子濃度的物質(zhì)離子濃度的物質(zhì),以保證最適以保證最適Mg2+濃度。濃度。3. Mg2+：1304. 模板：模板： PCR反應(yīng)必須以反