腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)(完整版)

1、.第 6 章腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)是研究癌變機(jī)理、抗癌藥的敏感性、腫瘤細(xì)胞和癌分子生物學(xué)特性的重要手段 。 癌細(xì)胞是比較容易培養(yǎng)的細(xì)胞，當(dāng)前所建立的細(xì)胞系中癌細(xì)胞是最多的。應(yīng)用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行腫瘤研究具有許多優(yōu)點(diǎn)：(1) 可免受機(jī)體內(nèi)環(huán)境因素的影響 ，避免了個(gè)體差異性 ，便于探索各種物理 、化和生物因素對(duì)腫瘤細(xì)胞生命活動(dòng)的影響 。(2) 既便于從細(xì)胞水平上研究腫瘤細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能 ，又便于從基因及分子水平上研究癌變的發(fā)生機(jī)理 ；(3) 可長(zhǎng)期傳代 、保存 ，便于觀察腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性和遺傳行為的改變。(4) 可用于快速篩選抗癌藥物和研究耐藥機(jī)理。(5) 研究周期短 ，比較經(jīng)濟(jì) 。但是它

2、也有缺點(diǎn) ，如長(zhǎng)期培養(yǎng)可使細(xì)胞生物學(xué)特性發(fā)生改變 ；體外實(shí)驗(yàn)所得的結(jié)果不能完全代表體內(nèi)的情況 ，應(yīng)與體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)合研究更為合理等 。一、腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)的生物學(xué)特性1、形態(tài)和性狀形態(tài)不規(guī)則 ，細(xì)胞界限清晰，伸展較差 ，核膜 、核仁輪廓明顯，核仁多 、核漿豐富 。折光性強(qiáng) ，電鏡觀察細(xì)胞表面微絨毛多而細(xì)密 ，與腫瘤細(xì)胞具不定向運(yùn)動(dòng)和鋪著不依賴性有關(guān) 。2、生物特性癌細(xì)胞在無(wú)血清或低血清(2% 5%) 時(shí)仍能生長(zhǎng) ，營(yíng)養(yǎng)要求不高，因能自分泌促增殖因子，在軟瓊脂培養(yǎng)時(shí)單個(gè)細(xì)胞能形成集落，生長(zhǎng)方向性消失，再加上失去了接觸抑制，癌細(xì)胞數(shù)量增多時(shí)可呈多層重疊生長(zhǎng) ，細(xì)胞飽和密度大 ，有豐富的三極有絲分裂 ，分裂

3、指數(shù)高，細(xì)胞倍增周期短 。3、永生性永生性也稱不死性，在體外培養(yǎng)中表現(xiàn)為可無(wú)限制傳代而不凋亡(Apoptosis) ，體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞系(株 )都表現(xiàn)有這種特性。但體外培養(yǎng)的永生性和體內(nèi)腫瘤的惡性(包括侵潤(rùn)性 )是兩種性狀 ，受不同基因調(diào)控的 ，因惡性腫瘤多數(shù)在體外培養(yǎng)時(shí)并不那么容易獲得成功，生長(zhǎng)增殖能力并不旺盛 ，有時(shí)只能傳若干代 ，說(shuō)明體外培養(yǎng)的永生性可在體外培養(yǎng)后獲得的 。 另外，體外培養(yǎng)的許多細(xì)胞系，如 NIH3T3 、Rat-1 10T1/2等均具有永生性而無(wú)惡性。但兩者有相關(guān)性，永生性可能是細(xì)胞惡性變的某一階段。4、侵潤(rùn)性侵潤(rùn)性是腫瘤細(xì)胞擴(kuò)張性增殖行為，體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞仍保持有

4、這種特性，當(dāng)與正常組織混合培養(yǎng)時(shí)，能侵潤(rùn)入其他正常組織中，甚至能穿透人工隔膜。5、異質(zhì)性所有腫瘤細(xì)胞都是由增殖能力、遺傳性 、起源 、周期狀態(tài)等性狀不同的細(xì)胞組成，屬于異質(zhì)性 ，其中有的衰老、退化 ，有的處于周期阻滯狀態(tài)，只有那些處于活躍增殖的腫瘤干細(xì)胞才是支持腫瘤生長(zhǎng)的成分，腫瘤干細(xì)胞易于生長(zhǎng)增殖，分離培養(yǎng)干細(xì)胞的方法稱干.專業(yè)學(xué)習(xí)資料.細(xì)胞培養(yǎng) (有干細(xì)胞系和數(shù)個(gè)亞系組成)。6、細(xì)胞遺傳性失去二倍體核型 ，呈異倍體或多倍體 ，常有標(biāo)記染色體出現(xiàn) ，正常細(xì)胞與惡性腫瘤細(xì)胞的區(qū)別 ，如表 6-1 所示 。表 6-1指標(biāo)形態(tài)生長(zhǎng)特性粘 附 性血清的要求在半固體瓊脂中生長(zhǎng)能力電子顯微鏡觀察細(xì)胞膜對(duì)

5、低分子物質(zhì)通透性粘多糖的合成和分泌腺苷酸環(huán)化酶活性細(xì)胞內(nèi) CAMP 濃度對(duì)松孢菌素的反應(yīng)區(qū)別正常成纖維細(xì)胞與惡性腫瘤細(xì)胞的常用指標(biāo)正常成纖維細(xì)胞惡性腫瘤細(xì)胞棱形或多角形，伸展良多角形或細(xì)長(zhǎng)形， 伸展較好， 折光較弱 ， 核漿比例差，折光強(qiáng)，核漿比例小， 嗜堿性弱 ， 核仁較少大，嗜堿性強(qiáng) ，核仁多 、較小 ，多核巨細(xì)胞少見(jiàn)大，常見(jiàn)多核巨細(xì)胞排列有方向性，單層生方向性消失，多層重疊生長(zhǎng)， 有接觸抑制 ，飽和密長(zhǎng) ，接觸抑制消失，飽和度低密度高細(xì)胞間粘附性強(qiáng)，緊貼壁細(xì)胞間粘附性弱 ，易脫落生長(zhǎng)必須有血清無(wú)需血清能生長(zhǎng)不能生長(zhǎng)能生長(zhǎng) ，形成集落核蛋白體較少，微絲微管核蛋白體豐富，微絲微管有規(guī)則排列消

6、失低高多少高低高低不刺激核分裂，或至多形核持續(xù)分裂，形成多核巨成雙核細(xì)胞細(xì)胞致瘤試驗(yàn)不能形成腫瘤能形成腫瘤二、培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性的檢測(cè)體外培養(yǎng)的細(xì)胞一旦建立細(xì)胞系就需要進(jìn)行一系列的細(xì)胞生物學(xué)特性鑒定，其目的在于：證明培養(yǎng)的細(xì)胞是否來(lái)自原來(lái)的腫瘤細(xì)胞。說(shuō)明腫瘤組織類型。描述腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性 。 通常要檢查下列項(xiàng)目：1、組織起源應(yīng)說(shuō)明培養(yǎng)材料起源于哪個(gè)胚層、器官組織 、什么樣供體 、何種疾病等 ，必要時(shí)要提供病理診斷鑒定資料。2、形態(tài)觀察觀察細(xì)胞一般形態(tài)如細(xì)胞形狀 ，核漿比例倒置 ，有豐富的三極或多極有絲分裂 ，核仁清晰 、多個(gè)，微絲 、微管排列紊亂 。3、細(xì)胞生長(zhǎng)特點(diǎn)檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

7、，細(xì)胞分裂指數(shù) ，倍增時(shí)間及細(xì)胞周期 。 癌細(xì)胞失去正常的接觸抑制，呈多層生長(zhǎng) ， 生長(zhǎng)旺盛 ，倍增時(shí)間縮短 ，飽和密度大 ，分裂指數(shù)較高 ，具無(wú)限增殖能.專業(yè)學(xué)習(xí)資料.力，細(xì)胞浸潤(rùn)能力較強(qiáng)等。4、軟瓊脂培養(yǎng)癌細(xì)胞在低密度下仍具有高度存活率，并在軟瓊脂中形成集落。5、細(xì)胞核型分析檢測(cè)核型特點(diǎn)，染色體數(shù)量，有無(wú)標(biāo)記染色體，染色體帶型等，癌細(xì)胞大多為異倍體，多倍體 ，并有標(biāo)記染色體 。6、動(dòng)物致瘤試驗(yàn)裸鼠背部皮下接種1×10 92 ×10 9/L癌細(xì)胞能生長(zhǎng)形成實(shí)體瘤，其組織學(xué)形態(tài)與原發(fā)瘤相似。7、組織化學(xué)檢查癌細(xì)胞中脫氧核糖核酸 、酸性磷酸酶和磷脂增多，堿性磷酸酶下降，乳酸脫

8、氫酶和琥珀酸脫氫酶活性也改變。8、其他生物學(xué)特性檢測(cè)有凝集試驗(yàn)等 。三、腫瘤細(xì)胞的取材和培養(yǎng)(一 )腫瘤細(xì)胞的取材方法培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的材料一般來(lái)自患者， 對(duì)實(shí)體瘤患者可取原發(fā)腫瘤組織或轉(zhuǎn)移灶，有胸、腹水患者可取胸水或腹水 ，白血病患者可取血液或骨髓液進(jìn)行培養(yǎng)。1、 實(shí)體瘤取材方法取術(shù)后或活檢標(biāo)本，要盡早浸入無(wú)血清培養(yǎng)液保鮮，盡快進(jìn)行培養(yǎng) 。 盡可能去除潰瘍及壞死組織 ，避免細(xì)菌 、霉菌污染 ，對(duì)取自外露的腫瘤組織，應(yīng)在培養(yǎng)前在含二性霉素B 2g/mL ，青霉素 200 1000u/mL，鏈霉素 500 g/mL的培養(yǎng)液中浸泡1020 分鐘，再用洗液反復(fù)沖洗干凈后 ，再作培養(yǎng) 。2、 體腔液的取材

9、方法在無(wú)菌條件下采取體腔液 (胸水或腹水 )，不需加抗凝劑 ，可直接以1200r/min 收集細(xì)胞，不要久置 ，也不要在冰中冷卻，而應(yīng)盡早接種 。3、 血液 (骨髓 )取材法白血病患者可取血液或骨髓，主要以取外周血為研究對(duì)象，用肝素抗凝的注射器無(wú)菌抽取 5 10mL 外周血 ，置于試管中立刻分離培養(yǎng) 。(二 )腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)方法腫瘤細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基要求不如正常細(xì)胞嚴(yán)格，一般常用 RPM1640 ， DMEM 、 Mc-Coy-5A等培養(yǎng)基 ，血清濃度不高， 10% 即可 ，建議在原代培養(yǎng)時(shí)最好能加入生長(zhǎng)因子或原患者血清(1% 2%) 以利細(xì)胞生長(zhǎng) ，培養(yǎng)方法很多 ，主要有組織塊法 、酶消化法 、鉭

10、網(wǎng)法 、脫落細(xì)胞法等 。 原代細(xì)胞的培養(yǎng)方法如下 ：1、組織塊培養(yǎng)法將取得的瘤組織去除脂肪結(jié)締組織及壞死部分，在平皿中用Hanks 液洗 3 次，剪碎組織 ，切成 12mm 3 小塊 ，接種于事先涂有鼠尾膠原的培養(yǎng)瓶（或皿）中，37 5%或加蓋瓶塞在普通恒溫箱中培養(yǎng)。2、酶消化法.專業(yè)學(xué)習(xí)資料.在上述的碎組織塊中加入0.25% 胰蛋白酶或 (2000u/ml膠原酶 )在 37水浴中消化30 分鐘(或更長(zhǎng)一些 )，去除消化液 ，用洗液洗 3 次，培養(yǎng)液洗 1 次后 ，用完全培養(yǎng)基懸浮，并用吸管吹打分散制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù) 。 以 5×108 10 ×10 8/L 細(xì)胞濃度 ，在

11、含有 10% 小牛血清的 RPMI1640( 或 Eagle MEM 或 DMEM) 中 37 5% CO 2 下分瓶 (或皿 )培養(yǎng) 。3、鉭網(wǎng)培養(yǎng)法在一張面積約為1cm 2 的鉭網(wǎng)上放入上述剪碎的一塊或幾塊腫瘤組織塊(12mm 3 大小)，用鑷子輕壓 ，使其粘于網(wǎng)上，再把鉭網(wǎng)放入培養(yǎng)皿中，使網(wǎng)下的組織塊與皿壁緊緊接觸，于 37 5% CO 2 下培養(yǎng) ，每隔 23 天換液一次 ， 5 天后可見(jiàn)有上皮細(xì)胞從網(wǎng)上移出，并能在相當(dāng)于腫瘤組織部位形成純凈的單層上皮細(xì)胞。3、脫落細(xì)胞法將新鮮的腫瘤組織去除脂肪和結(jié)締組織，洗液洗2 次后 ，用刀片將腫瘤組織切成細(xì)薄片，在切割的同時(shí)有許多上皮細(xì)胞脫落下來(lái)

12、，脫落細(xì)胞經(jīng)洗滌后，加入完全培養(yǎng)基，便可獲得較純的上層細(xì)胞 ，于培養(yǎng)瓶 (或皿 )中、 37 5% CO2 下培養(yǎng) ，每隔 2 3 天換液 ， 7 10 天上皮細(xì)胞逐漸長(zhǎng)成單層 。在原代培養(yǎng)中，常在培養(yǎng)物中混有正常成纖維細(xì)胞，若把正常細(xì)胞誤認(rèn)為是癌細(xì)胞，就會(huì)使整個(gè)工作失去意義，若不及時(shí)去除這些成纖維細(xì)胞，由于它比腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)快，最終能抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此 ，盡早排除成纖維細(xì)胞，已成為腫瘤細(xì)胞長(zhǎng)期培養(yǎng)建系的關(guān)鍵 ，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)有許多因素能抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)(見(jiàn)表 6-2) 。表 6-2抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的因素方法因素組織 細(xì)胞選擇性附著胰蛋白酶胚胎小腸 、心肌表皮膠原酶乳癌選擇性附著底物聚丙稀酰

13、胺各種腫瘤聚四氟乙烯 (Teflon)轉(zhuǎn)化細(xì)胞膠原 (豬皮 )表皮細(xì)胞匯合飼細(xì)胞層小鼠 3T3表皮人胎小腸正常和惡性乳腺上皮結(jié)腸癌選擇性培養(yǎng)基D- 纈氨酶 (Valine)腎組織MCDB-710乳腺M(fèi)CDB-153表皮Phenobarbitone肝細(xì)胞(三 )成纖維細(xì)胞的排除方法為了在腫瘤細(xì)胞中排除成纖維細(xì)胞，常采用五種方法 ， 即機(jī)械刮除法 、反復(fù)貼壁法 、消化排除法 、膠原酶消化法 、密度梯度離心法 。1、機(jī)械刮除法用不銹鋼絲末端的橡膠刮頭(用膠塞剪成三角形插入不銹鋼絲)或裹上少許脫脂棉制成，裝入試管中高壓蒸氣滅菌后備用(也可用特制電熱燒灼器刮除 )。 程序如下 ：(1)標(biāo)記鏡下觀察 ，用

14、記號(hào)筆在培養(yǎng)瓶 (皿 )的背面圈下腫瘤細(xì)胞的部位。(2)刮除棄掉培養(yǎng)液 ，把無(wú)菌膠刮伸入瓶(皿 )中，在肉眼或顯微鏡窺視下，刮除無(wú)標(biāo)記細(xì)胞空間 。.專業(yè)學(xué)習(xí)資料.(3)Hanks 液沖洗 1 2 次，洗除被刮掉的細(xì)胞。(4)加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，如仍有成纖維細(xì)胞殘留，可重復(fù)刮除至徹底刮凈為止。2、反復(fù)貼壁法根據(jù)腫瘤細(xì)胞比成纖維細(xì)胞貼壁速度慢的特點(diǎn)，并結(jié)合使用不加血清的營(yíng)養(yǎng)液，把含有兩類細(xì)胞的細(xì)胞懸液反復(fù)貼壁，使兩類細(xì)胞相互分離。方法如下 (同貼壁傳代 )：(1)待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)一定數(shù)量后，倒去舊液 ，用 0.25% 胰蛋白酶消化后， Hanks液洗2次，加入不含血清的培養(yǎng)液吹打分散，制成單細(xì)胞懸液。

15、(2)取三個(gè)培養(yǎng)瓶分別編號(hào)為A 、B、C，首先把細(xì)胞懸液接種入A 瓶，置溫箱中靜置培養(yǎng) 5 20 分鐘后 ，輕輕傾斜培養(yǎng)瓶，讓液體集中瓶角后，慢慢吸出全部培養(yǎng)物，再接種于B 瓶中 ，然后向 A 瓶中補(bǔ)充完全培養(yǎng)基置溫箱繼續(xù)培養(yǎng)。(3)B 瓶中的細(xì)胞靜置培養(yǎng)5 20 分鐘后 ，按處理 A 瓶的方法 ，把 B 瓶中的培養(yǎng)液和細(xì)胞懸液吸出并注入C 瓶中 ，再向B 瓶補(bǔ)加完全培養(yǎng)基， C 瓶補(bǔ)加少量小牛血清(濃度為10%) 。三個(gè)瓶一并在培養(yǎng)箱中培養(yǎng) ，如操作成功 ，次日觀察 ，可見(jiàn) A 瓶中主要為成纖維細(xì)胞， B 瓶中兩類細(xì)胞混雜 ， C 瓶中主要為上皮細(xì)胞 (癌細(xì)胞 )，必要時(shí)可反復(fù)處理幾次直至癌

16、細(xì)胞純化為止 。3、消化排除法此法曾用于乳癌細(xì)胞的培養(yǎng)，具體方法如下 ：(1)先是用0.25% 胰蛋白酶和0.02%EDTA(1:1) 混合液漂洗培養(yǎng)細(xì)胞一次，然后加入新的混合液繼續(xù)消化直到有半數(shù)細(xì)胞開(kāi)始脫落時(shí)，立即停止消化。(2)把消化液離心棄去上清，沉下的細(xì)胞用培養(yǎng)基重懸并吸入另一培養(yǎng)瓶中，置溫箱培養(yǎng)，向原瓶中補(bǔ)加新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，此法處理后，鑒于成纖維細(xì)胞比腫瘤細(xì)胞先脫落，原瓶中留下的多為腫瘤細(xì)胞，經(jīng)過(guò)幾次反復(fù)處理，就能把成纖維細(xì)胞除凈。4、膠原酶消化法本法是利用成纖維細(xì)胞對(duì)膠原較為敏感的特點(diǎn)，通過(guò)消化進(jìn)行選擇。(1)可用 0.5mg/mL 的膠原酶消化處理 ，邊消化邊在鏡下窺視 ，當(dāng)

17、發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞被除掉后即終止消化 。(2)用 Hanks 液洗滌處理一次后 ，更換新培養(yǎng)基 ，繼續(xù)培養(yǎng) ，可獲純凈腫瘤細(xì)胞 ，若未清除凈 ，可再次重復(fù) 。5、密度梯度離心法用泛影葡胺和聚蔗糖配制成比重1.025 1.085 的密度梯度分離液，加入細(xì)胞懸液后，2500r/min 離心 10 分鐘 ，在比重 1.025 1.050 層為成纖維細(xì)胞 ，在比重為 1.065 1.085 層為上皮細(xì)胞 ，將收集的上皮細(xì)胞經(jīng)洗液 3 次后，進(jìn)行培養(yǎng)可獲純凈的腫瘤細(xì)胞 。最近，有人用 SOD 來(lái)抑制成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)，這些方法都需進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)取得經(jīng)驗(yàn)，找出適合條件 ，才能獲得好結(jié)果。(四 )血癌細(xì)胞分離培養(yǎng)1、

18、采血與分離白細(xì)胞用肝素抗凝的注射器無(wú)菌抽取白血病患者外周血5 10mL ，置無(wú)菌離心管中，斜放于.專業(yè)學(xué)習(xí)資料.37 的水浴中 ，待紅細(xì)胞沉淀后 ，將血漿部分吸入另一離心管中 ，以 1500r/min 離心 15 分鐘，收集細(xì)胞 ，用含 20% 小牛血清的 RPMI1640 含 50u( g)/mL 青、鏈霉素 培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至 1×10 9 細(xì)胞 /L 以上 ，開(kāi)始接種濃度要大 。培養(yǎng)基中加入患者血清為 1%2% 。2、原代培養(yǎng)物的維持：將分離的患者白細(xì)胞種入鏈霉素小瓶中，每瓶 3mL 在 37 溫箱中進(jìn)行懸浮狀態(tài)的靜置培養(yǎng)，每隔 2 3 天半量換一次 ，吸出 1.5mL 舊液

19、棄去 ，加入新鮮完全培養(yǎng)基1.5mL 。 若換液前培養(yǎng)基中的pH 有下降 ，說(shuō)明細(xì)胞存活 ，起先一直堅(jiān)持換液，不分瓶傳代 ，直至細(xì)胞有明顯增殖再擴(kuò)大培養(yǎng)。3、傳代培養(yǎng) （直到建系 ）細(xì)胞增殖后 ， pH 下降明顯時(shí) ，說(shuō)明細(xì)胞有明顯增殖，此時(shí)搖動(dòng)細(xì)胞，在細(xì)胞懸液中有少量細(xì)胞結(jié)成的團(tuán)塊，可轉(zhuǎn)入傳代培養(yǎng)，開(kāi)始以 1:2 分瓶培養(yǎng) ，當(dāng)傳至 10 代左右 ，細(xì)胞開(kāi)始生長(zhǎng)減慢，幾乎不分裂，甚至有許多細(xì)胞死亡，此時(shí)再并瓶培養(yǎng)，堅(jiān)持每3 天換液一次， 2 3 周后細(xì)胞已適應(yīng)了外界環(huán)境，開(kāi)始增殖 ，然后每 2 天換一次液 ，每周傳一代 ，即加入等量培養(yǎng)基以1:2 分瓶培養(yǎng) ，細(xì)胞增殖快時(shí)以1:3 分瓶，即每

20、瓶加入6mL ，共計(jì) 9mL ，分成 3 瓶，每瓶 3mL ，繼續(xù)培養(yǎng) ，當(dāng)傳至 20 代以上時(shí)已基本穩(wěn)定，可以認(rèn)為已基本建系，我院共建了兩個(gè)白血病細(xì)胞系 ，即 S7811 粒單型白血細(xì)胞系和 S801 急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系。(五 )提高腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)存活率和生長(zhǎng)率的措施根據(jù)人們的經(jīng)驗(yàn) ，腫瘤細(xì)胞在體外不易培養(yǎng) ，建立能夠傳代的細(xì)胞系更為困難 ，當(dāng)腫瘤組織或細(xì)胞初代培養(yǎng)后 ，常出現(xiàn)以下幾種情況 ：（ 1）完全無(wú)細(xì)胞游離出或移動(dòng) 。（ 2）有細(xì)胞移動(dòng)和游出 ，但無(wú)細(xì)胞增殖 ，細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間處于停滯狀態(tài)以致難以傳代。（ 3）傳數(shù)代后細(xì)胞增殖緩慢 ，經(jīng)過(guò)一段停滯期后 ，才呈現(xiàn)旺盛生長(zhǎng)狀態(tài) ，形成穩(wěn)定生

21、長(zhǎng)的腫瘤傳代細(xì)胞系 。以上說(shuō)明 ：腫瘤細(xì)胞原代培養(yǎng)時(shí)對(duì)體外生存條件有較高要求，并需經(jīng)對(duì)新環(huán)境適應(yīng)才能生長(zhǎng) ，因此不能局限于一般培養(yǎng)法，必須采取特殊的措施。1、適宜底物把純化的細(xì)胞接種在不同的底物上，如鼠尾膠原底層或飼養(yǎng)細(xì)胞層等。2、生長(zhǎng)因子將促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)因子加入培養(yǎng)基中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，常用胰島素、氫化可的松 、雌激素以及其他生長(zhǎng)因子。3、動(dòng)物體媒介培養(yǎng)為了提高腫瘤細(xì)胞對(duì)體外培養(yǎng)環(huán)境的適應(yīng)和增加有活力的癌細(xì)胞(干細(xì)胞 )的數(shù)量 ，可采用動(dòng)物體轉(zhuǎn)嫁接種成瘤后，再?gòu)膭?dòng)物體內(nèi)取出進(jìn)行培養(yǎng)，能提高體外培養(yǎng)的成功率，受體動(dòng)物以裸鼠最好。方法如下 ：(1)瘤塊接種取新鮮瘤組織 ，用 Hanks 液洗凈血污 ，

22、切成 13mm 3 小塊，用穿刺針頭吸一小瘤塊 ，于皮下注入瘤塊。(2)待腫瘤生長(zhǎng)達(dá)較大體積后剝?nèi)〕隽鼋M織。(3)進(jìn)行體外培養(yǎng) 。.專業(yè)學(xué)習(xí)資料.(4)為防止失敗 ，可取部分瘤細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)傳代 ，通過(guò)裸鼠媒介接種 ，使腫瘤干細(xì)胞數(shù)量增多 ，細(xì)胞易于培養(yǎng)成功 。(六 )腫瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)應(yīng)注意的事項(xiàng)1、在原代培養(yǎng)時(shí)應(yīng)注意的問(wèn)題(1)培養(yǎng)材料應(yīng)取自腫瘤細(xì)胞集中 、活力較好的部分 ，取材后應(yīng)立即培養(yǎng)并存放于培養(yǎng)液中 。(2)取材和培養(yǎng)過(guò)程中要防止細(xì)菌和霉菌污染。(3)培養(yǎng)物中混有的成纖維細(xì)胞要盡快清除。(4)癌組織中若有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，應(yīng)采用密度離心法將淋巴細(xì)胞清除，否則癌細(xì)胞會(huì)被殺死 。(5)實(shí)驗(yàn)要

23、防止其他細(xì)胞株的交叉污染。2、在傳代腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)注意的問(wèn)題(1)當(dāng)癌細(xì)胞沒(méi)有生長(zhǎng)到足夠的量時(shí)，應(yīng)耐心等待 ，堅(jiān)持換液 ，不要急于傳代 。(2)癌細(xì)胞經(jīng)常重疊生長(zhǎng) ，如果混有成纖維細(xì)胞 ，應(yīng)在傳代時(shí)采用消化消除法及反復(fù)貼壁法加以清除 ，分離出癌細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。(3)在傳到 10 代前細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖極不穩(wěn)定，傳代要小心 ，該合并培養(yǎng)時(shí)還得合并，千萬(wàn)不能傳代 。要確定適合該細(xì)胞的培養(yǎng)方法。(4)在早期傳代時(shí)要適當(dāng)提高接種濃度。(5)對(duì)于增殖能力極低的細(xì)胞，應(yīng)放入飼養(yǎng)層中培養(yǎng)，并加入一些促生長(zhǎng)物質(zhì)，如胰島素、氫化考的松 、雌激素 、 EGF、軟鐵蛋白等因子 。(6)消除成纖維細(xì)胞始終為癌細(xì)胞培養(yǎng)中的重要條件，一旦發(fā)現(xiàn)應(yīng)盡早盡快按上述介紹的方法加以清除 。(七 )人類惡性腫瘤連續(xù)性細(xì)胞系(株 )的建系 (株)標(biāo)準(zhǔn)1、 共同特征能在體外培養(yǎng)半年以上 (或 20 代以上 )，生長(zhǎng)穩(wěn)定 ，保持特性 ，能連續(xù)傳代的 ，可稱為連續(xù)性細(xì)胞系 (株 )。 要具備如下原始資料：（1）標(biāo)本來(lái)源要記錄患者姓名 、年齡 、性別、臨床診斷的疾病類別和分期。（ 2）標(biāo)本收集日期 、細(xì)胞制