兩種常用纖維素酶活力測(cè)定方法---濾紙酶活-CMC酶活

1、檢測(cè)纖維素酶酶活力一濾紙酶活力（FPA）濾紙酶活力代表了纖維素酶的三種酶組分協(xié)同作用后的總酶活。采用3，5二硝基水楊酸法測(cè)定酶活：（簡(jiǎn)稱DNS!）1原理：纖維素經(jīng)纖維素酶水解后生成還原糖，還原糖能將3，5二硝基水楊酸中硝基還原成氨基，溶液變?yōu)槌壬陌被衔铮?即: 3氨基一 5二硝基水楊酸，在一定的還原糖濃 度范圍內(nèi)，橙色的深度與還原糖的濃度成正比，據(jù)此可以推算出纖維素酶的活力。2、 采用的濾紙酶活單位定義：濾紙酶活反映了纖維素酶的 3種水解酶，即內(nèi)切型葡聚糖酶、外切型葡聚糖酶和3葡聚糖苷酶組成的誘導(dǎo)復(fù)合酶系的協(xié)同水解纖維素能力。是該菌株整個(gè)纖維素酶系的酶活力水平的綜合體現(xiàn)。代表了纖維素酶的

2、三種酶組分協(xié)同作用后的總酶活。在此濾紙酶活單位定義為：以濾紙為底物，在一定反應(yīng)條件（pH4.8 , 50C，恒溫lh）下，以水解反應(yīng)中，1ml纖維素酶液1min催化纖維素生成lug葡萄糖為1個(gè)濾紙酶活單位，以U表示。3、濾紙酶活力（FPA）的測(cè)定： 取0. 5ml適當(dāng)稀釋的酶液，加入 PH直為4.8 , 0.1mol/L的乙酸-乙酸鈉緩沖液lml或 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液lml ; 再加入50 ± 0.5mg濾紙（1cmx6cm） 條，于50 C保溫酶解反應(yīng)1小時(shí)，（先預(yù)熱5分鐘）; 加入DNSI色液3ml（標(biāo)準(zhǔn)曲線用量是1.5ml），放入已沸騰的水中沸水浴lOmin，流水 冷卻后在

3、540nm下測(cè)吸光度； 同時(shí)用100 C煮沸IOmin后失活的酶液做對(duì)照，扣除本底； 根據(jù)吸光度從葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出相應(yīng)的葡萄糖含量，根據(jù)生成的葡萄糖克數(shù)計(jì)算出酶活值。濾紙酶活按下面公式計(jì)算：X= （WxNxlOOO/（ TxMX:為濾紙酶酶活力，單位 U/ mL。W 為從葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得的葡萄糖的濃度。N:為酶液稀釋總倍數(shù)。T：為反應(yīng)時(shí)間。M 為樣品的體積。4、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：取 25ml具塞刻度試管6支，加入1.0 mg /ml的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0ml,加蒸餾水 2.0、1.6、1.2、0.8、0.4、0.0ml,加 D

4、NS 試劑 1.5 ml，混勻后 在沸水浴中加熱5分鐘，取出立即用冷水冷卻，用水定容至 25 ml，搖勻，測(cè)吸光度 A，以 吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖的含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。5、3, 5二硝基水楊酸（DNS）試劑稱取6.3克3,5-二硝基水楊酸用水溶解，加入 21.0克NaOH , 182克酒石酸鉀鈉，加 500ml 水，加熱溶解后再加入 5.0克重蒸酚和5.0克亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻，定容至1000ml ,存于棕色瓶中，放置 7天后使用。1、定義：1毫升液體酶（或1克固體酶粉），在40C pH = 4.6條件下，每分鐘水解羧甲基 纖維素鈉（CMC-Na），產(chǎn)生I.Oug的葡萄糖，即為1個(gè)

5、酶活單位，以u(píng)/g（ u/ml）表示。2、原理：CMC-Na在纖維素酶的作用下，水解產(chǎn)生纖維寡糖、纖維二糖、葡萄糖等還原糖，還原 糖能將3, 5 -二硝基水楊酸中的硝基還原成橙黃色的氨基化合物，在540nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值A(chǔ)，吸光度與酶活成正比。CMC-Na糖化力主要代表內(nèi)切3 -1.4-葡聚糖的活力。3、試劑：3.1 0.1mol/LpH = 4.6醋酸-醋酸鈉緩沖溶液：將49.0ml0.2mol/L 醋酸鈉溶液和51.0ml0.2mol/L醋酸溶液混合后加 100ml蒸餾水。注意：0.2mol / L醋酸鈉溶液：稱取 27.22g結(jié)晶乙酸鈉（AR ）定容至1000ml。 0.2mol /

6、 L醋酸溶液：稱取冰乙酸（ AR） 11.5ml定容至1000ml。3.2 3, 5二硝基水楊酸（DNS）試劑：稱取 6.3克3,5-二硝基水楊酸用水溶解，加入21.0克NaOH , 182克酒石酸鉀鈉，加500ml水，加熱溶解后再加入 5.0克重蒸酚和5.0 克亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻，定容至1000ml，存于棕色瓶中，放置 7天后使用。3.3葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（1.0mg /ml ）:稱取1.000克葡萄糖（AR ） （105 C干燥至恒重）用 蒸餾水溶解后定容至 1000ml，冰箱保存?zhèn)溆谩?.4羧甲基纖維素鈉溶液：稱2.0gCMC-Na溶于200 ml蒸餾水中，加醋酸緩沖溶液100 ml,

7、混勻后存于冰箱內(nèi)備用。配后隔天使用。4、分析步驟：4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：取25ml具塞刻度試管6支，加入1.0 mg /ml的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.0、0.4、 0.8、1.2、1.6、2.0ml,加蒸餾水 2.0、1.6、1.2、0.8、0.4、0.0ml,加 DNS 試劑 1.5 ml，混 勻后在沸水浴中加熱 5分鐘，取出立即用冷水冷卻，用水定容至25 ml，搖勻，測(cè)吸光度A，以吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖的含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。4.2待測(cè)酶液制備：準(zhǔn)確稱取酶粉1.0克置研缽中，加入 pH4.6的醋酸緩沖溶液少量溶解，研細(xì)，將上清液小心傾入25ml刻度試管中，沉渣再加入少量緩沖液，如此搗研3-4次，最后全部移入試管中并定容至25ml，搖勻，過(guò)濾，濾液待測(cè)。4.3測(cè)定：取1.5mlCMC-Na溶液與0.5ml適當(dāng)稀釋的酶液于 25ml試管中，40C水浴保溫 30min后立即加1.5mlDNS顯色劑，沸水浴煮沸 5min，取出立即冷卻，用水定容25ml,在540nm測(cè)吸光度 As。空白樣：先加1.5mlDNS試劑，后加0.5ml待測(cè)酶液，與1.5mlCMC-Na溶液，于 25ml試管中，沸水浴煮沸 5min，冷卻后用水定容 25ml，在540nm測(cè)吸光度Ack。"A = As Ack 根據(jù)"A從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得葡萄糖含量P。5.4計(jì)算