NCBI基本功能與引物設(shè)計(jì).PPT

1、NCBI常用功能與引物設(shè)計(jì)常用功能與引物設(shè)計(jì)2010級(jí)博士：謝鵬 導(dǎo)師：鄒曉庭Your site here為何要接觸為何要接觸NCBI？如何使用如何使用NCBI？如何設(shè)計(jì)引物？如何設(shè)計(jì)引物？Your site hereNCBI簡(jiǎn)介NCBI：National Center for Biotechnology Information 美國(guó)國(guó)家信息技術(shù)中心美國(guó)國(guó)家信息技術(shù)中心 （/）1992年年10月，月，NCBI承擔(dān)起對(duì)承擔(dān)起對(duì)GenBank DNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)的責(zé)任。序列數(shù)據(jù)庫(kù)的責(zé)任。NCBI工作人員通過(guò)來(lái)自各個(gè)實(shí)驗(yàn)室遞交的序列和同國(guó)際核酸序列數(shù)

2、據(jù)庫(kù)（工作人員通過(guò)來(lái)自各個(gè)實(shí)驗(yàn)室遞交的序列和同國(guó)際核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)（EMBL和和DDBJ）交換數(shù)據(jù)建立起數(shù)據(jù)庫(kù)）交換數(shù)據(jù)建立起數(shù)據(jù)庫(kù). Genebank是遺傳序列數(shù)據(jù)庫(kù)，一個(gè)所有可以公開(kāi)獲得的是遺傳序列數(shù)據(jù)庫(kù)，一個(gè)所有可以公開(kāi)獲得的DNA序列的序列的注釋過(guò)的收集。注釋過(guò)的收集。 GenBank以指數(shù)形式增長(zhǎng)，核酸堿基數(shù)目大概每以指數(shù)形式增長(zhǎng)，核酸堿基數(shù)目大概每14個(gè)月就翻一個(gè)倍。最近，個(gè)月就翻一個(gè)倍。最近，GenBank擁有來(lái)自擁有來(lái)自47,000個(gè)物種的個(gè)物種的30億個(gè)億個(gè)堿基。堿基。 Your site hereSub titleYour site hereNCBI常用功能查找核酸/氨基酸序

3、列序列相似性分析引物驗(yàn)證Your site here一、查找核酸、氨基酸序列一、查找核酸、氨基酸序列1.以雞以雞FAT/CD36為例，為例，search：2.調(diào)整右側(cè)檢索目錄，調(diào)整右側(cè)檢索目錄，tree-list：Your site here3.瀏覽信息，下載序列，并以瀏覽信息，下載序列，并以Genebank、FASTA格式保存格式保存點(diǎn)擊點(diǎn)擊Genebank:Your site here氨基酸序列：氨基酸序列：Genebank核酸序列：核酸序列： FASTA格式的核酸序列：格式的核酸序列： Your site here二、序列相似性分析二、序列相似性分析 序列相似性分析：序列相似性分析： 就

4、是將待研究序列與就是將待研究序列與DNA或蛋白質(zhì)序列庫(kù)進(jìn)行比較，用于確定或蛋白質(zhì)序列庫(kù)進(jìn)行比較，用于確定該序列的生物屬性，也就是找出與此序列相似的已知序列是什么。該序列的生物屬性，也就是找出與此序列相似的已知序列是什么。完成這一工作只需要使用兩兩序列比較算法。常用的程序包有完成這一工作只需要使用兩兩序列比較算法。常用的程序包有BLAST、FASTA等等 序列同源性分析：序列同源性分析： 是將待研究序列加入到一組與之同源，但來(lái)自不同物種的序列中進(jìn)是將待研究序列加入到一組與之同源，但來(lái)自不同物種的序列中進(jìn)行多序列同時(shí)比較，以確定該序列與其它序列間的同源性大小。這行多序列同時(shí)比較，以確定該序列與其它

5、序列間的同源性大小。這是理論分析方法中最關(guān)鍵的一步。完成這一工作必須使用多序列比是理論分析方法中最關(guān)鍵的一步。完成這一工作必須使用多序列比較算法。常用的程序包有較算法。常用的程序包有DNAMAN、CLUSTAL等等Your site hereBlast簡(jiǎn)介簡(jiǎn)介 BLAST ： “局部相似性基本查詢工具”(Basic Local Alignment Search Tool)的 縮寫，是由NCBI開(kāi)發(fā)的一個(gè)基于序列相似性的數(shù)據(jù)庫(kù)搜索程序。程序名程序名查詢序列查詢序列數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索方法搜索方法Blastn核酸核酸核酸核酸核酸序列搜索逐一核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列核酸序列搜索逐一核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列Blast

6、p蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)序列搜索逐一蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列蛋白質(zhì)序列搜索逐一蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列Blastx核酸核酸蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)核酸序列核酸序列6框翻譯成蛋白質(zhì)序列后和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)框翻譯成蛋白質(zhì)序列后和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列逐一搜索。庫(kù)中的序列逐一搜索。Tblastn蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)核酸核酸蛋白質(zhì)序列和核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中的核酸序列蛋白質(zhì)序列和核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中的核酸序列6框翻譯框翻譯后的蛋白質(zhì)序列逐一比對(duì)。后的蛋白質(zhì)序列逐一比對(duì)。TBlastx核酸核酸核酸核酸核酸序列核酸序列6框翻譯成蛋白質(zhì)序列，再和核酸數(shù)據(jù)框翻譯成蛋白質(zhì)序列，再和核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中的核酸序列庫(kù)中的核酸序列6框翻譯成的蛋白質(zhì)序列逐框翻譯成的蛋白質(zhì)

7、序列逐一進(jìn)行比對(duì)。一進(jìn)行比對(duì)。主要的Blast程序：Your site hereBlast 序列相似性分析序列相似性分析1.修改測(cè)序結(jié)果，剔除克隆載體序列修改測(cè)序結(jié)果，剔除克隆載體序列在測(cè)序結(jié)果中找到上下游引物對(duì)應(yīng)位置，剔除引物外的多余部分以鴿子的I-FABP片段為例：GCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATTAGGAAGTTAGGAGCCCACGATAATCTGAAGATCACTATTCAACAAGATGGAAACAAATTTACGGTCAAAGAATCAAGCAACTTCCGTACTATAGATATTGAATTCACTCTGGGAGTCAATTTTGACTACAGTCTC

8、GCTGACGGAACGGAAATCTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCAC

9、TGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGT 上游引物：5-AGRAARYTDGSAGCYCAC-3下游引物： 5- TCHGTYCCRTCWGCBAGA-3TAGGAAGTTAGGAGCCCACGATAATCTGAAGATCACTATTCAACAAGATGGAAACAAATTTACGGTCAAAGAATCAAGCAACTTCCGTACTATAGATATTGAATTCACTCTGGGAGTCAATTTTGACTACAGTCTC

10、GCTGACGGAACGGAYour site here2.進(jìn)入進(jìn)入NCBI3.點(diǎn)擊點(diǎn)擊Basic BLAST中的中的nucleotide blast選項(xiàng)選項(xiàng)Your site hereYour site hereYour site here4.尋找相近物種，比較相似性尋找相近物種，比較相似性Your site here點(diǎn)擊點(diǎn)擊score，獲得相似性比較具體信息，獲得相似性比較具體信息NCBI官方說(shuō)明：官方說(shuō)明：/BLAST/tutorial/Altschul-1.htmlYour site here引物設(shè)計(jì)與簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)與簡(jiǎn)并PCR RTP

11、CR原理與技術(shù)簡(jiǎn)介 引物設(shè)計(jì)過(guò)程 簡(jiǎn)并PCR技術(shù) 后續(xù)研究Your site hereDNA mRNA 蛋白質(zhì)酶活力Western blotNorthern blot半定量RTPCR定量RTPCRYour site here12Your site here 引物設(shè)計(jì)原則 Primer5和Oligo6進(jìn)行引物分析Your site here引物的長(zhǎng)度一般為引物的長(zhǎng)度一般為15-30bp，常用的是，常用的是18-27bp，但不能大于，但不能大于38，因?yàn)檫^(guò)，因?yàn)檫^(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74，即，即Taq 酶的最適溫度。酶的最適溫度。引物引物3端的序列要比端的序列要比5端重要。

12、引物端重要。引物3端的堿基一般不用端的堿基一般不用A，因?yàn)椋驗(yàn)锳在錯(cuò)誤引在錯(cuò)誤引發(fā)位點(diǎn)的引發(fā)效率相對(duì)比較高。另外引物間發(fā)位點(diǎn)的引發(fā)效率相對(duì)比較高。另外引物間3端的互補(bǔ)、二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也端的互補(bǔ)、二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)失敗。反應(yīng)失敗。5端序列對(duì)端序列對(duì)PCR 影響不大。影響不大。引物的引物的GC含量一般為含量一般為40-60%，以，以45-55為宜，過(guò)高或過(guò)低都不利于引為宜，過(guò)高或過(guò)低都不利于引發(fā)反應(yīng)。發(fā)反應(yīng)。PCR引物的引物的GC/AT比率應(yīng)當(dāng)?shù)扔诨蚋哂谒糯蟮哪０宓谋嚷蕬?yīng)當(dāng)?shù)扔诨蚋哂谒糯蟮哪０宓腉C/AT比。比。G值值(自由能自由能)反映引物與模板結(jié)合的強(qiáng)弱程

13、度。一般情況下，引物的反映引物與模板結(jié)合的強(qiáng)弱程度。一般情況下，引物的G值值最好呈正弦曲線形狀，即最好呈正弦曲線形狀，即5端和中間端和中間G值較高，而值較高，而3端端G值相對(duì)較低，且值相對(duì)較低，且不要超過(guò)不要超過(guò)9（G值為負(fù)值，這里取絕對(duì)值）。值為負(fù)值，這里取絕對(duì)值）。 引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能量引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能量一般不要超過(guò)一般不要超過(guò)4.5，否則容易產(chǎn)生引物二聚體帶。，否則容易產(chǎn)生引物二聚體帶。 Your site here以雞的以雞的I-FABP為例，設(shè)計(jì)常規(guī)引物：為例，設(shè)計(jì)常規(guī)引物：1.輸入I-FABP的已知序列，點(diǎn)擊primer:Your site here2.點(diǎn)擊點(diǎn)擊sea

14、rch進(jìn)行引物條件設(shè)置：進(jìn)行引物條件設(shè)置：3.Search criteria 篩選篩選Your site here4.選擇最優(yōu)引物選擇最優(yōu)引物5.手動(dòng)修改，手動(dòng)修改，調(diào)整引物調(diào)整引物Your site here最為重要的環(huán)節(jié)：對(duì)自己設(shè)計(jì)的引物或文獻(xiàn)報(bào)道的引物進(jìn)行測(cè)試1.登陸NCBIBlastPrimer-BLAST: /Your site here以文獻(xiàn)報(bào)道雞的以文獻(xiàn)報(bào)道雞的MUC2的引物為例：的引物為例：Your site hereYour site hereYour site hereMore of an art than a sci

15、ence降低簡(jiǎn)并度（500以下）例如：上游 D Y N L F D L L 下游 P V N G N G K Q 根據(jù)密碼子表建立引物系列http:/www.kazusa.or.jp/codon/謹(jǐn)慎使用次黃嘌呤Symbol DefinitionB not AD not CH not GI InosineK G or T/UM A or CN A,C,G or T/UR A or GS C or GV not T/UW A or TY C or T/U簡(jiǎn)并引物：在常規(guī)引物的某些位點(diǎn)上以簡(jiǎn)并核苷酸代替。Your site here簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)過(guò)程簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)過(guò)程l傳統(tǒng)方法（適用于保守度高序列）

16、應(yīng)用BLAST進(jìn)行同源序列搜索 應(yīng)用DNAMAN選擇保守區(qū)域（氨基酸或核苷酸） 簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)原則 Primer5和Oligo6進(jìn)行引物分析lCODEHOP法（適用于保守度低序列）Your site here剪切然后粘貼DNA或蛋白序列；使用FASTA格式的序列； FASTA格式的序列以一個(gè)單行的說(shuō)明開(kāi)始，說(shuō)明行以其開(kāi)始處的一個(gè)大于號(hào)（）與序列數(shù)據(jù)區(qū)分開(kāi)。說(shuō)明行以下是序列數(shù)據(jù)。簡(jiǎn)單使用訪問(wèn)編號(hào)：RefSeq或Genebank序號(hào)。 /Your site hereYour site hereDNAMAN分析序列保守區(qū)分析序列保守區(qū)對(duì)Gallus、Taeniopygia、Mus、Ruttus的I-FABP的CDS進(jìn)行分析得到保守區(qū)序列Your site here原理原理方法方法：http:/bioinformatics.weizmann.ac.il/blocks/codehop.htmlYour site hereRNAcDNAcDNA反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄合并產(chǎn)物合并產(chǎn)物