信號(hào)通路研究思路

1、要證明你的藥物是通過(guò)抑制p38 表達(dá)而發(fā)揮保護(hù)作用，首先要證明p38 表達(dá)增加會(huì)導(dǎo)致?lián)p傷。其次，要證明你的藥物存在保護(hù)作用。再次，證明你的藥物可以抑制p38 表達(dá)。最后，證明你的藥物是由于抑制了p38表達(dá)而發(fā)揮保護(hù)作用。首先證明p38 表達(dá)增加會(huì)導(dǎo)致?lián)p傷。這里需要建立一個(gè)損傷模型。正如你提到的，鈣離子導(dǎo)致p38mapk 的增高，如果某種損傷可以通過(guò)鈣離子導(dǎo)致p38mapk 的增高，那么你就建立起了一個(gè)損傷模型。這時(shí)，對(duì)p38 做個(gè) rna干擾，使其表達(dá)下降，再來(lái)?yè)p傷刺激，如果這時(shí)損傷刺激不會(huì)導(dǎo)致?lián)p傷，那么可以說(shuō) p38mapk 的增高會(huì)導(dǎo)致?lián)p傷。這里最好不要用p38 的抑制劑sb來(lái)處理，因?yàn)檫@

2、個(gè)抑制劑是針對(duì)p38 活性的抑制劑，抑制的是 p38 的磷酸化，而不是表達(dá)量。如果說(shuō)明的問(wèn)題是p38 磷酸化水平增加而導(dǎo)致?lián)p傷，那么我建議用抑制劑。這時(shí)還可以用dominant-negative 。抑制劑的實(shí)驗(yàn)證實(shí)該藥物不影響p38 表達(dá)，而影響其活化。 （應(yīng)該首先考慮選用抑制劑， 因?yàn)槟壳耙恍┧幬锏淖饔脵C(jī)制不是抑制靶點(diǎn)的表達(dá)，而是抑制靶點(diǎn)的激活。如果在此應(yīng)用rnai 的話，很可能會(huì)漏掉這個(gè)機(jī)制或增加實(shí)驗(yàn)步驟。）其次，要證明你的藥物存在保護(hù)作用。當(dāng)然就是用你的藥物先處理一下，再來(lái)?yè)p傷刺激， 如果這時(shí)損傷刺激不會(huì)導(dǎo)致?lián)p傷，那么可以說(shuō)你的藥物存在保護(hù)作用。再次，證明你的藥物可以抑制p38 表達(dá) 。

3、用你的藥物先處理一下，再來(lái)?yè)p傷刺激，再檢測(cè)p38 表達(dá)，如果用藥組相對(duì)于沒(méi)有用藥組p38 表達(dá)下降，那么可以說(shuō)你的藥物可以抑制p38 表達(dá)。最后，證明你的藥物是由于抑制了p38表達(dá)而發(fā)揮保護(hù)作用。這一步看似不必要，其實(shí)是最重要的步驟，而國(guó)內(nèi)的文章往往忽略了這一關(guān)鍵環(huán)節(jié)。這里建議還是用rna干擾 p38 表達(dá)，再用你的藥物處理，再進(jìn)行損傷刺激，如果用藥組與沒(méi)有用藥組的損傷程度一致， 那么才可以說(shuō)你的藥物是由于抑制了p38 表達(dá)而發(fā)揮保護(hù)作用。抑制劑也有其局限性，有時(shí)是“致命”的，主要原因是抑制劑缺乏特異性。雖然我們?cè)谖恼吕锟吹接靡种苿┑臅r(shí)候都說(shuō)是什么什么的特異性抑制劑，但真的那么特異嗎？其實(shí)往往

4、是作者為了寫文章發(fā)文章的需要而夸大了抑制劑的特異性。細(xì)胞里無(wú)數(shù)的信號(hào)通路，誰(shuí)也不能保證抑制劑在作用于靶分子時(shí)不會(huì)影響其他信號(hào)通路。其實(shí)無(wú)論什么抑制劑，對(duì)劑量的要求都相對(duì)比較苛刻， 為什么？ 就是因?yàn)橐坏舛雀吡耍筒恢罆?huì)干擾到其他哪些信號(hào)通路，從而產(chǎn)生很多說(shuō)不清道不明的現(xiàn)象。pi3k的抑制劑 -ly294002和 wortmannin, 它們都能抑制pi3k和相關(guān)的激酶，但ly294002的濃度達(dá)到200m 常用來(lái)抑制dna依賴的蛋白激酶（dna-pk） ； wortmannin 在濃度超過(guò)3m 常用來(lái)抑制運(yùn)動(dòng)失調(diào)性毛細(xì)血管擴(kuò)張基因突變（atm)以及 dna-pk 。相對(duì)而言， mek1/2

5、的抑制劑u0126 和 pd98059 以及 p38mapk的抑制劑 sb203580就要好一些。所以研究人員一般應(yīng)用ly294002時(shí)采用 20m，應(yīng)用 wortmannin 時(shí)采用 0.2m，以此來(lái)最小化其他的效應(yīng)。 有些學(xué)者們同時(shí)應(yīng)用兩種抑制劑進(jìn)行對(duì)比，也許也有顧及于此的原因吧。但是， 從嚴(yán)謹(jǐn)?shù)慕嵌戎v起特異性的話，rnai 也不能說(shuō)是絕對(duì)特異的，我們只能說(shuō)它是高特異性，因?yàn)閞nai的機(jī)制中還有很多沒(méi)有完全闡明。一些研究者會(huì)在rnai處理后，還要在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用western 來(lái)同時(shí)檢測(cè)該蛋白所在家族的其他成員的表達(dá)量變化以檢測(cè)其特異性和選擇性，以表嚴(yán)謹(jǐn)。舉個(gè)例子：比如針對(duì)survivin 進(jìn)

6、行 rnai 之后，你最好同時(shí)檢測(cè)xiap , ciap1/2等蛋白。當(dāng)然，如果你所針對(duì)基因的sirna構(gòu)建已經(jīng)很成熟，有前人的文章檢測(cè)特異性做基礎(chǔ)，那就另當(dāng)別論了，所以給科研態(tài)度很嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膌wjssry 兄弟提個(gè)醒， 如果你的sirna序列尚無(wú)很好的文獻(xiàn)應(yīng)用基礎(chǔ)，這個(gè)問(wèn)題你也許應(yīng)該考慮的。臨時(shí)找到一個(gè)描訴相關(guān)內(nèi)容的06 年文獻(xiàn)， 影響因子3 分多， 截取其中的內(nèi)容供lwjssry 兄參考吧：信號(hào)通路有細(xì)胞特異性和條件特異性，即同一信號(hào)通路在不同的細(xì)胞之間或同一細(xì)胞在不同的條件下，作用機(jī)理可能是不同的。細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路之間存在復(fù)雜的相互作用，想證明哪一個(gè)分子是另一分子的充要條件真的很難。本人最近

7、研究了一個(gè)信號(hào)系統(tǒng)的兩個(gè)信號(hào)分子，a 和 b。a 在細(xì)胞質(zhì)， b 在細(xì)胞核。以往的研究已經(jīng)證明a 是 b 的上游信號(hào)通路之一。我們的研究是想證明在某種病理過(guò)程中a和 b作為一個(gè)系統(tǒng)發(fā)揮作用。我們首先應(yīng)用能夠提升該系統(tǒng)的藥物干預(yù)，發(fā)現(xiàn)a 升高的同時(shí) b也得到升高，但這也不能說(shuō)明什么問(wèn)題。所幸的是a 分子目前有特異性的阻斷劑，于是我們便對(duì)a 分子的激活進(jìn)行阻斷，結(jié)果發(fā)現(xiàn)b 分子的激活也收到抑制。由此初步推測(cè)a和 b 可能在某種病理過(guò)程中作為一個(gè)系統(tǒng)發(fā)揮作用。但也只能證明了a 是 b的必要條件而已。做信號(hào)傳導(dǎo)的在于你研究一種的機(jī)制有什么作用，其機(jī)制是否于信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)，有哪些關(guān)系，是什么原因?qū)е麓诵盘?hào)

8、傳導(dǎo)的表達(dá)，表達(dá)后的下游基因怎么變化？這中間最好有基因敲出或者抑制劑和激動(dòng)劑干預(yù)后看看上游下游之間的變化和你預(yù)期的結(jié)果有沒(méi)有關(guān)系。如果單純的做信號(hào)傳導(dǎo)而去做沒(méi)有什么意義的，就像前面樓上說(shuō)的一樣信號(hào)的啟動(dòng)/最終發(fā)揮功能！“想證明哪一個(gè)分子是另一分子的充要條件真的很難”。我最近正在做一個(gè)實(shí)驗(yàn)，證明a 對(duì)b的作用。先用外源物處理細(xì)胞，跑wetern blot ，發(fā)現(xiàn) a 和 b 都有所增加， b 的量增加在a之后。于是用抑制劑抑制a，以及用sirna使 a knockdown ，然后看 b的表達(dá)量也下來(lái)了。但是這也只能證明a 和 b有關(guān)聯(lián)，無(wú)法證明a 對(duì) b是直接作用還是間接作用。甚至無(wú)法說(shuō)明 b的

9、改變是a信號(hào) knockdown 造成的，還是a 信號(hào) knockdown 以后，細(xì)胞為了彌補(bǔ)該信號(hào)的不足，補(bǔ)充促進(jìn)了c信號(hào)，而c信號(hào)可以改變b 信號(hào)。最近在考慮用co-ip證明 a 和 b有結(jié)合作用，也許能證明a 和 b 的直接關(guān)系。探討信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中分子間的充要條件，與探討數(shù)學(xué)中的充要條件是不一樣的，因?yàn)榧?xì)胞中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路往往存在反饋機(jī)制。即使x是上游信號(hào)， y是下游信號(hào)，改變y信號(hào)也會(huì)通過(guò)反饋機(jī)制使得 x 信號(hào)發(fā)生改變。 所以， 在考慮生物體內(nèi)的信號(hào)分子間充要條件時(shí)會(huì)復(fù)雜得多，要慎之又慎下結(jié)論。信號(hào)分子的環(huán)路效應(yīng)普遍存在個(gè)人覺(jué)得研究a 分子與某個(gè)信號(hào)通路應(yīng)該更具體得分為兩種情況：1，以前還不

10、知道a 分子是這個(gè)信號(hào)通路的成分，這時(shí)我們要證明a 分子是這個(gè)信號(hào)通路的成分，這時(shí)的研究就是上文談到的研究?jī)?nèi)容了。2，a 分子是信號(hào)通路的成分，這是已知的，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)某個(gè)現(xiàn)象跟這個(gè)通路有關(guān)，現(xiàn)在我們要證明 a 分子是這個(gè)信號(hào)通路參與這個(gè)現(xiàn)象的關(guān)鍵分子，則又是另一種模式。1， “創(chuàng)造信號(hào)通路”，別人沒(méi)有研究過(guò)a 和 b 之間的相互作用，而你發(fā)現(xiàn)了，并證明了，這就是創(chuàng)造，其實(shí)準(zhǔn)確點(diǎn)說(shuō)應(yīng)該是“發(fā)現(xiàn)”，因?yàn)樾盘?hào)通路是客觀存在的，只不過(guò)被找到了而已，不過(guò)用“創(chuàng)造”這個(gè)詞比較形象。這一類的研究是開(kāi)創(chuàng)性的，比較困難的，研究的時(shí)候常常是用免疫共沉淀去把與某個(gè)蛋白結(jié)合的一堆蛋白都搞出來(lái)，再做質(zhì)譜分析， 進(jìn)行鑒定，

11、 再進(jìn)一步證明兩者間的相互作用，這就涉及到充分必要條件的證明。單純進(jìn)行這一類的研究缺乏目的性和研究的意義， 所以通常還是建立于某種現(xiàn)象基礎(chǔ)上的，用自己“創(chuàng)造” 的信號(hào)通路來(lái)解釋某種現(xiàn)象，也就是下面說(shuō)的第二種模式。2， “利用信號(hào)通路” ，利用別人或自己“創(chuàng)造”的信號(hào)通路來(lái)解釋某個(gè)具體的現(xiàn)象，比如，某個(gè)藥物、某種毒物、某種應(yīng)激、某種射線、等等，在這些刺激下，具體到某種細(xì)胞的某條信號(hào)通路發(fā)揮調(diào)控作用。在第一類中，是用充分必要條件來(lái)證實(shí)a 分子與 b分子的作用。在第二類中，是用充分必要條件來(lái)證實(shí)a 現(xiàn)象與 b 信號(hào)通路之間的關(guān)系?？次墨I(xiàn)是最基礎(chǔ)的訓(xùn)練，看文獻(xiàn)， 一是看思路，二是學(xué)技術(shù)和邏輯思維。思路

12、告訴我們?yōu)槭裁慈プ觯夹g(shù)和邏輯思維教我們?cè)趺慈プ?。過(guò)表達(dá) a 基因，發(fā)現(xiàn)b 基因的 mrna水平明顯增加，對(duì)應(yīng)的b 的蛋白水平也明顯增加；干擾 a 基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)b 基因的 mrna水平明顯降低，對(duì)應(yīng)的b 的蛋白水平也明顯降低。投稿，被拒稿，主要原因是審稿人提出：應(yīng)該弄清楚a 是如何調(diào)控b 的表達(dá)的。請(qǐng)問(wèn)各位老師， a調(diào)控 b 可能是通過(guò)什么途徑？需要做什么實(shí)驗(yàn)？a 和 b 都是脂類代謝中的酶基因，它們?cè)诎麧{和核內(nèi)都有表達(dá)?；卮穑?、下一步應(yīng)該搞清楚b基因 mrna改變的原因是什么，在轉(zhuǎn)錄水平還是影響了rna的穩(wěn)定性。2、假設(shè) a 和 b 是直接關(guān)聯(lián)的（假定a 影響 b的轉(zhuǎn)錄），是否一般得做兩

13、個(gè)實(shí)驗(yàn)：luciferase reporter assay 和 chip assay ？只做一個(gè)chip實(shí)驗(yàn)行不行？其中l(wèi)uciferase reporter assay 是否就是為了檢驗(yàn)a 蛋白是否能結(jié)合到b基因的 promoter 區(qū)？是不是a 蛋白必須得是轉(zhuǎn)錄因子才有可能結(jié)合到b 基因的 promoter 區(qū)？另外，怎么知道a 蛋白是不是轉(zhuǎn)錄因子呢？針對(duì)這個(gè)問(wèn)題的回答：不過(guò)建議找?guī)灼猨bc上的文章看看，jbc上這種調(diào)調(diào)的文章挺多的，精讀 3-5 篇，把它的outline 搞清楚，你就胸有成竹了。我打開(kāi)jbc網(wǎng)站一看，呵呵，每期專門有 gene regulation 板塊。根據(jù) jbc上面

14、的文章， a 調(diào)控 b 基因， 很多都是通過(guò)第三者如轉(zhuǎn)錄因子實(shí)現(xiàn)的。我再翻出以前自己的real-time pcr實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)a 基因后，轉(zhuǎn)錄因子c的 mrna水平顯著增加，而干擾a 基因表達(dá)，轉(zhuǎn)錄因子c 的 mrna 水平顯著降低。目前這個(gè)現(xiàn)象還沒(méi)有文獻(xiàn)報(bào)道。后期，我準(zhǔn)備通過(guò)luciferase reporter assay 和 chip assay來(lái)驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子c是否能與 b基因作用。我想請(qǐng)教的問(wèn)題是：a 基因調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子c，除了前期的 real-time pcr實(shí)驗(yàn)（當(dāng)然再補(bǔ)一個(gè)western blot 實(shí)驗(yàn)），我還需要做其他實(shí)驗(yàn)嗎？會(huì)不會(huì)審稿人再提出：你需要弄清楚a 基因如何調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子c 才行。 說(shuō)簡(jiǎn)單點(diǎn)： a 基因通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子c調(diào)控基因b，是否要將a 影響 c，c影響 b兩步都弄清楚？看你的目標(biāo)雜志了，如果是jbc這樣偏機(jī)制的，估計(jì)會(huì)要你說(shuō)清楚的3、a 可以影響b 的 mrna 水平，也能影響b 的蛋白水