飼料中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌活菌的檢測(cè)EMAPCR法

1、飼料中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌活菌的檢測(cè)EMA-PCR法河南省地方標(biāo)準(zhǔn)編制說明一、 編制的目的和意義單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes ）簡(jiǎn)稱單增李斯特菌，是危害公共衛(wèi)生和食品行業(yè)的一種重要人畜共患致病菌，主要存在于肉類、乳制品和蔬菜中，可引起腦膜炎、敗血癥和流產(chǎn)，特別對(duì)孕婦、新生兒、老年人和免疫缺陷病人危害嚴(yán)重。自1961 年，英國(guó)首次報(bào)道2 例由單增李斯特菌引起的腦膜炎病例以來，相繼在美國(guó)、加拿大、比利時(shí)等國(guó)家報(bào)道了新生兒?jiǎn)卧隼钏固鼐腥臼录?1985 年美國(guó)有 52 人死于食用受單增李斯特菌感染的軟干酪。 2011 年美國(guó) 18 個(gè)州 72 人因食用受李

2、斯特菌污染的甜瓜而染病。在我國(guó)感染性腹瀉致病菌中李斯特菌居首位。因此，建立快速、特異、靈敏的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)于單增李斯特菌早期預(yù)防及疫情的有效控制至關(guān)重要。我國(guó)目前主要采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法進(jìn)行單增李斯特菌的檢測(cè)，需要一周時(shí)間左右，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。本次研究以單增李斯特菌溶血素蛋白的基因 Hly 序列為靶基因設(shè)計(jì)一對(duì)引物，采用EMA與 PCR相結(jié)合的方法進(jìn)行檢測(cè)，能夠有效地區(qū)分單增李斯特菌的死菌與活菌，避免了因死菌 DNA存在造成的假陽性結(jié)果，同時(shí)減去了傳統(tǒng)培養(yǎng)方法中目標(biāo)菌分離純化的步驟，節(jié)約了大量檢測(cè)時(shí)間。本次研究結(jié)果顯示， PCR檢測(cè)單增李斯特菌的靈敏度在 1.0 × 102cfu/mL 左右，從預(yù)

3、增菌、樣品處理、PCR擴(kuò)增、凝膠電泳只需要2d左右，與傳統(tǒng)培養(yǎng)學(xué)方法相比，穩(wěn)定性好、靈敏度高、特異性強(qiáng)，可用于檢測(cè)飼料中單增李斯特菌的污染狀況，對(duì)飼料的安全監(jiān)測(cè)具有重大意義。二、 任務(wù)來源及編制原則和依據(jù)1、任務(wù)來源根據(jù)河南省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局文件河南省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局關(guān)于下達(dá) 2017年第一批河南省地方標(biāo)準(zhǔn)制修訂計(jì)劃的通知（豫質(zhì)監(jiān)標(biāo)發(fā) 2017104號(hào)）的要求，由河南省獸藥飼料監(jiān)察所負(fù)責(zé)對(duì)河南省地方標(biāo)準(zhǔn)飼料中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌活菌的檢測(cè)EMA-PCR法（立項(xiàng)編號(hào)：20171210481）的起草、制定工作。2、編制原則符合國(guó)家法律、法規(guī)和政策，本著嚴(yán)格遵循科學(xué)依據(jù)，與國(guó)際水平接軌，并且準(zhǔn)確、實(shí)用

4、、快速的原則，開展了本次研究工作。3、編制依據(jù)主要依據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)：NY/T 1902飼料中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的微生物學(xué)檢驗(yàn)，GB 4789.30食品微生物學(xué)檢驗(yàn)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)GB 19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求，GB4789.28食品微生物學(xué)檢驗(yàn)培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求。三、編制過程標(biāo)準(zhǔn)的編制過程分三個(gè)階段進(jìn)行：第一階段：?jiǎn)魏思?xì)胞增生李斯特氏菌活菌EMA-PCR檢測(cè)方法的建立1. 引物設(shè)計(jì)根據(jù)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌單核細(xì)胞增生李斯特氏菌Hly基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物。根據(jù)該基因中的保守且特異性序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增271 bp 大小的特異性引物對(duì)。表 1 引物序列引物序列片段大小上游5

5、'- GATGACGAAATGGCTTACAGTGAAT -3'271bp下游5'- CCACACTTGAGATATATGCAGGAGG -3'2. EMA-PCR方法參數(shù)的優(yōu)化首先是探索單核細(xì)胞增生李斯特氏菌培養(yǎng)物的最佳致死方法和 EMA最佳終濃度，分別采用煮沸裂解、紫外照射及化學(xué)方法對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行處理，再分別加入 EMA，制備成 EMA終濃度成梯度變化的菌懸液，采用鹵素?zé)暨M(jìn)行光照交聯(lián)。然后通過離心收集上清液，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，觀察凝膠電泳結(jié)果，選出最優(yōu)的致死方法和最佳 EMA添加終濃度。其次是最佳曝光時(shí)間的確定，在上述試驗(yàn)的結(jié)果上，選出最優(yōu)組合，采用鹵素?zé)粝路?/p>

6、別照射 0、 1、 2、4、 6、 8、 10min ，離心收集上清液，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。3. 確定方法的靈敏度和特異性。4. 用建立的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌 EMA-PCR方法檢測(cè)飼料及飼料原料樣品，并與 NY/T 1902-2010 飼料中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的微生物學(xué)檢驗(yàn)比對(duì)，以驗(yàn)證該方法的實(shí)用性和準(zhǔn)確性。第二階段：?jiǎn)魏思?xì)胞增生李斯特氏菌EMA-PCR檢測(cè)方法應(yīng)用實(shí)驗(yàn)本階段主要進(jìn)行單核細(xì)胞增生李斯特氏菌EMA-PCR檢測(cè)方法在河南省范圍內(nèi)的應(yīng)用實(shí)驗(yàn)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證所建立的診斷方法的特異性、敏感性和實(shí)用性，由河南省獸藥飼料監(jiān)察所進(jìn)行飼料樣品檢測(cè)應(yīng)用試驗(yàn)。共對(duì)來自全國(guó)4個(gè)省（大部分樣品來自

7、河南?。┕灿?jì) 216批飼料及飼料原料樣品進(jìn)行了應(yīng)用檢測(cè)；共檢測(cè)出 1 批單核細(xì)胞增生李斯特氏菌陽性樣品，并對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌進(jìn)行了分離鑒定。同時(shí)與 NY/T 1902-2010 飼料中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的微生物學(xué)檢驗(yàn) 進(jìn)行了對(duì)比， 檢測(cè)結(jié)果顯示，EMA-PCR方法檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)培養(yǎng)法 NY/T 1902-2010 檢測(cè)結(jié)果完全一致，但檢測(cè)時(shí)間比傳統(tǒng)培養(yǎng)法縮短了2-3 天的時(shí)間。通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)，EMA-PCR方法具有準(zhǔn)確、快速的特點(diǎn)，在應(yīng)用推廣方面具有一定的優(yōu)勢(shì)。第三階段：標(biāo)準(zhǔn)的起草、修改與制定根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)資料及所有參與實(shí)驗(yàn)人員意見，在系統(tǒng)統(tǒng)計(jì)、科學(xué)分析的基礎(chǔ)上，組織有關(guān)專家起草了飼料中

8、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌活菌的檢測(cè) EMA-PCR法河南省地方標(biāo)準(zhǔn)草案， 規(guī)定了適用范圍、樣品處理方法、實(shí)驗(yàn)操作方法、結(jié)果判定等，并將標(biāo)準(zhǔn)草案送微生物有關(guān)方面專家征求意見，按照專家意見對(duì)標(biāo)準(zhǔn)草案進(jìn)行多次修改完善，制定了當(dāng)前的飼料中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌活菌的檢測(cè) EMA-PCR法（草案）。項(xiàng)目主持人：吳志明，河南省獸藥飼料監(jiān)察所，主持本項(xiàng)地方標(biāo)準(zhǔn)的制定與編寫。主要起草人：高延玲：河南省獸藥飼料監(jiān)察所，負(fù)責(zé)標(biāo)準(zhǔn)的制定和技術(shù)推廣。方忠意：河南省獸藥飼料監(jiān)察所，負(fù)責(zé)標(biāo)準(zhǔn)的制定和檢測(cè)方法的優(yōu)化。董鵬：河南省獸藥飼料監(jiān)察所，負(fù)責(zé)標(biāo)準(zhǔn)的制定、校訂和檢測(cè)方法的建立。李金磊：河南省獸藥飼料監(jiān)察所，負(fù)責(zé)標(biāo)準(zhǔn)的制定

9、、校訂和檢測(cè)方法的建立。狄元冉：河南省獸藥飼料監(jiān)察所，負(fù)責(zé)標(biāo)準(zhǔn)的制定、校訂和優(yōu)化。四、主要內(nèi)容的確定1. 檢測(cè)方法基本原理EMA能夠穿過死細(xì)菌的細(xì)胞膜，在強(qiáng)光照射下可與其基因組DNA發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的結(jié)合，使死細(xì)菌和游離狀態(tài)的DNA不能作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。根據(jù)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌溶血素蛋白的基因 Hly 序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，通過對(duì)樣品進(jìn)行EMA處理然后進(jìn)行 PCR擴(kuò)增及凝膠電泳分析，含單增李斯特菌活菌的樣品會(huì)在 271 bp處出現(xiàn)一條目的條帶，而含有單增李斯特菌死菌DNA及非單增李斯特菌的樣品不會(huì)出現(xiàn)該條帶。2.最佳致死方法、EMA濃度及曝光時(shí)間向煮沸致死、紫外處理和異丙醇處理后的0.5

10、麥?zhǔn)蠁挝唬?MCF）單增李斯特菌菌懸液中分別加入EMA，使其終濃度分別為0、 0.2 、 0.5 、 1、 2、 4、8 g/mL， PCR結(jié)果電泳圖分別為圖1，圖 2，圖3。由圖可以看出煮沸法致死效果最理想，加入EMA終濃度為0.5g/mL既能完全抑制0.5 MCF單增李斯特菌死菌的擴(kuò)增。另向0.5 MCF活菌菌懸液加入EMA，使其終濃度分別為0、1、 2、4、 6、 8、10、 12、14、 16 g/mL，PCR電泳結(jié)果如圖4。由圖4 可以看出加入終濃度為4 g/mL的EMA樣品PCR電泳條仍無明顯減弱，表明終濃度低于4 g/mL的EMA不會(huì)抑制單增李斯特菌活菌的擴(kuò)增。圖 1 煮沸處理注

11、： M： Marker ；1：陰性對(duì)照；2 ： 0 g/mL EMA； 3 ：0.2g/mL EMA；4：0.5g/mL EMA； 5 ：1 g/mL EMA； 6：2 g/mL EMA； 7 ： 4 g/mL EMA； 8 ：4 g/mLEMA圖 2 紫外照射處理注： M： Marker ；1：陰性對(duì)照；2 ： 0 g/mL EMA；3： 0.2 g/mL EMA；4：0.5g/mL EMA； 5 ： 1 g/mL EMA； 6 ：2 g/mL EMA； 7 ： 4 g/mL EMA； 8 ：4 g/mL EMA圖 3 異丙醇處理注： M： Marker ；1：陰性對(duì)照；2 ： 0 g/mL

12、 EMA；3： 0.2 g/mL EMA；4：0.5g/mL EMA； 5 ： 1 g/mL EMA； 6 ：2 g/mL EMA； 7 ： 4 g/mL EMA； 8 ：4 g/mL EMA圖 4 EMA 抑制單核細(xì)胞增生李斯特氏菌活菌濃度注： M： Marker ；1：陰性對(duì)照； 2 ：0 g/mL EMA; 3：1 g/mL EMA； 4 ：2 g/mLEMA； 5 ：4 g/mL EMA；6： 8 g/mL EMA； 7 ：10 g/mL EMA； 8 ：12 g/mL EMA；9：14g/mL EMA；10： 16g/mL EMA將煮沸致死的0.5 MCF單增李斯特菌菌懸液，加入EM

13、A終濃度為0.5g/mL，黑暗環(huán)境下孵育5 min后，分別曝光0、1、2、4、 6、8、 10 min，處理后 PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖5 所示。由圖5可以看出只有不曝光的有條帶，其他均無條帶， 說明 EMA處理后，曝光 1 min ，即可使EMA與死菌充分交聯(lián)。圖 5 曝光時(shí)間注： M：Marker ；1：0 min； 2 ： 1 min； 3 ： 2 min； 4： 4 min； 5 ： 6 min； 6 ：8 min；7：10 min ； 8：陰性對(duì)照3. PCR 方法的靈敏度用滅菌棉簽蘸取新鮮培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)瓊脂固體平板上的單增李斯特菌菌落轉(zhuǎn)接于5 mL滅菌去離子水中， 用比濁儀調(diào)至0.5 M

14、CF，系列稀釋至10-1 -10 -8 ，以此為模板，按上述方法進(jìn)行EMA-PCR試驗(yàn)，同時(shí)對(duì)檢出的最低稀釋度進(jìn)行涂板計(jì)數(shù)，每個(gè)稀釋度做3 個(gè)重復(fù)， 37 培養(yǎng) 24 h ，檢測(cè) PCR反應(yīng)靈敏度。結(jié)果表明，建立的 PCR方法檢測(cè)最底線是 1.3 × 102 cfu/mL （圖 6）。圖 6 PCR 靈敏度檢測(cè)注： M： Marker ；1：陰性對(duì)照； 2 ：108 CFU； 3 ：107 CFU； 4：106 CFU； 5 ：105 CFU；6： 104 CFU； 7 ：103 CFU； 8 ：102 CFU； 9：10 CFU； 10：1 CFU4. PCR方法的特異性將單核細(xì)胞

15、增生李斯特氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株及其余待測(cè)菌株單菌落分別接種于LB 肉湯中過夜培養(yǎng)，取菌液作為PCR反應(yīng)模板，按上述方法進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果如圖7，由圖可以看出以單增李斯特菌菌株為模板的PCR產(chǎn)物出現(xiàn)有1 條特異性的271 bp條帶，與預(yù)測(cè)序列片段大小相符；陰性對(duì)照、 金黃色葡萄球菌、 志賀氏菌、大腸桿菌等10 株非李斯特氏菌及格氏李斯特氏菌、威氏李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌、斯氏李斯特氏菌等5 株非單增李斯特菌菌株未出現(xiàn)任何擴(kuò)增條帶；同時(shí)也未發(fā)現(xiàn)有其他非特異性擴(kuò)增條帶，表明建立的PCR方法具有很高的特異性。圖 7 PCR特異性注：M：Marker；1：?jiǎn)魏思?xì)胞增生李斯特氏菌；2：陰性對(duì)照； 3：斯氏李斯特氏菌； 4：伊氏李斯特氏菌；5 ：威氏李斯特氏菌； 6：格氏李斯特氏菌； 7：英諾克李斯特氏菌；8：福氏志賀氏菌； 9：宋內(nèi)氏志賀氏菌； 10：鮑氏志賀氏菌；11 ：金黃色葡萄球菌；12：大腸桿菌； 13：腸產(chǎn)毒性大腸桿菌； 14：腸致病性大腸桿菌； 15：鼠傷寒沙門氏菌： 16：腸炎沙門氏菌17：甲型副傷寒沙門氏菌5結(jié)果報(bào)告凡被檢樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果在271 bp 處出現(xiàn)一條目的條帶（見圖8），即可報(bào)告該樣品中檢出單核細(xì)胞增生李斯特氏菌。圖 8 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌活菌的 EMA-PCR鑒定注：