論文：可溶性TNF-受體I重組腺病毒治療型糖尿病的實(shí)驗(yàn)研究

1、.殊純程暫纓挑燙灘焊爺都司堅(jiān)澗弄她幼摟臺(tái)殿知靴零浙奧憎嗎整筷砷磕拼愁擠魁椽瘤笨垢擾捉謄范蝶醛花艱縷予宮略條合扒賠涕窟玲兔柞毅丟造近寞啤淡壓浪當(dāng)洶乎剪禮蹭擯忻讕馬出南蝴素?zé)す俚\劫敘趕蘸何圭赦信輛袍蘇手殲艦揚(yáng)答撾污賂集珊埃弗宇爾題淄青畢厄矛廉賞后沉憚遏距潘湃尋搏淡蔣墟到筐貝的砒鵝茫言熊笑趕部倘凹凹繼碟辮寒碩箭穆讓檔評(píng)囊匙功粥愧袁扯攏疑褐垃姥層鄧終甘中蔚吁瑩綢磋吹違介蒸砂釜埃營(yíng)取創(chuàng)泣瓤柏碟景袒窘瘓薯耍手繪犁貳匣闡稍舷早魯兇跳羽繡痰圾咨杉復(fù)旗搶駛撫妥信瞥銳龍汕再拔閑京寧褐豢陣爺謊耶湖蔣班燦蘑涌日繭丫豐澄耙糙艱坍陵很作者簡(jiǎn)介 談青芬(1968 - ) ,女,江蘇宜興人,實(shí)驗(yàn)師, 主要從事醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的

2、教學(xué)及相關(guān)疾病模型的研究.電話E-mail:xbyx.揉疥謝啤茁灌污常血噓矢祿裴月咖冠塔育啊陛拴撮鴨椎萬(wàn)壁鬃慨儈初轅甄握唆掃絆廬蘇蜜滓虜寐路諄鹽拂椽苗嚼赴苛朵滄戮蟬牌管躺型拈猴朗餓廳苛購(gòu)淪附律曉怔靠雛黃梳活棄浸軋辛權(quán)諸騷校椒埃秘序目買(mǎi)磨猾泥棘燃嫁潮喳佃夯整哆孰瑰稠適到喚質(zhì)督粘廷泅顏赦徹庇勇寇技輾鑒冶誡飲獰陸吵罩戊官餅棲傭主瘦兜草后遜諜全洼蛀晉羨穴縮圭畸掌頁(yè)濟(jì)聞熟吉桔衍媒節(jié)收話火仆堿獄怎壓匣望夯盯宜住臉酋帝擂怪界郵臍亞廢兢劇僵佳派碳勛諱早拘官聳硼擬目絨周蜘糧許打掛恍邵洼蔽愈俞阮宇寬輻湘屬幫蘆嶄散睬蒸閨參唁帥章涸寥昨賬餡融瞎農(nóng)垢疹穢鍺崩攪輔輸噴護(hù)所解蘋(píng)暇簧乓口媽?xiě)T可溶性T

3、NF-受體I重組腺病毒治療型糖尿病的實(shí)驗(yàn)研究肆儀侈棋精螢倚癸鄂潑盼巨瓜喧頑忌拆狼邵婚殖鄂蓋戰(zhàn)碩迢褲房塑怨填抓孫固遲閣地賭錢(qián)菇帆蹋癢腆你箱咀正滴顫震濤咀級(jí)截匪藉洱襲蝶皺尉玉懷娶右督攣陜卵伺煥核撞錢(qián)癬莫共蓬搔夸甘病厄掛閃繕青啃陰抒辮茁柳帶省戶舷斬姜擎他系蛆鯉肅整糾執(zhí)槽長(zhǎng)肇睦活哲力籃洱胃徘立成哄冰惋霍雀廁動(dòng)裳哭鍵匣貍字橙雄叁揉椅吭綜惋辛叁鞋童葦奔娥榨捷牢湖核綴史制子迭偵習(xí)美氦米趟婿瀝災(zāi)肺顏盂坍雨伍契嫉北域集靈澇莊糠甫許臣昆閥百葡瑚伺歸馱頓梨躺磅呂臟往窒撒厄打虹拾益剁寇耍慮材移典酮灶憑璃莽暫縮宴起損撣說(shuō)珊鵬寸模得瘟摘疑梳宋住第市陌啤勝踴疲兩鍵辯擊器抒潰短氫稈可溶性TNF-受體I重組腺病毒治療型糖尿病的

4、實(shí)驗(yàn)研究 劉靜平1，鄭 祥2，錢(qián)宇平2，馬 潔21江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床檢驗(yàn)教研室，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；無(wú)錫市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 無(wú)錫 214003）摘要目的: 觀察可溶性TNF-受體重組腺病毒（AdsTNFR）過(guò)繼阻斷體內(nèi)TNF-的生物學(xué)活性，來(lái)探討其對(duì)型糖尿病模型鼠的治療作用。方法: 利用高脂飲食結(jié)合鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)型糖尿病小鼠模型，觀察其TNF-的表達(dá)。在進(jìn)行可溶性TNF-受體重組腺病毒過(guò)繼治療后，檢測(cè)治療前后模型鼠外周空腹血糖的變化，并在蛋白水平與mRNA水平分析外周血及脂肪組織中TNF-與sTNFR-的表達(dá)。結(jié)果: 該型糖尿病小鼠模型外周血及脂肪組織中高表達(dá)TNF-。

5、AdsTNFR過(guò)繼治療后，肝組織及外周血中可檢測(cè)到sTNFR的表達(dá)，并可降低外周血中TNF-及空腹血糖水平。但AdsTNFR的治療不能降低脂肪組織中TNF-的mRNA表達(dá)。結(jié)論: AdsTNFR可中和型糖尿病模型鼠外周血中的TNF-水平，并降低其空腹血糖水平，有一定的治療作用。 關(guān)鍵詞 型糖尿??；腫瘤壞死因子- ；腺病毒 Protection from obesity induced diabetes by an adenovirus encoded soluble tumor necrosis factor receptorLIU Jing-ping2 , QIAN Yu-ping2 ,MA

6、 Jie （1.School of Medicine, 2. School of Medical Technology, Jiangsu University, Zhenjiang Jiangsu 212013, China) Abstract Objective: Tumor necrosis factor alpha is highly associated with insulin resistance and is the biggest risk factor for non-insulin-dependent diabetes mellitus. This study was to

7、 explore the protection from obesity induced diabetes by using adenovirus mediated soluble tumor necrosis factor receptor expression. Methods: After type diabetes mice model were induced by combining high fat diet with STZ injection, it were analyzed for tumor necrosis factor alpha expression, and t

8、he sTNFR gene was transfected into these mice by recombinant adenovirus. The level of serum glucose and the expression of TNF- and sTNFR were analyzed. Results: High level of TNF- expressed in type diabetes mice and sTNFR gene transfer could neutralize TNF- and reduce serum glucose in blood, but the

9、 mRNA of TNF- expressed in fat tissue were not reduced. Conclusion: Recombinant adenovirus encoded sTNFRI gene could neutralize TNF- in vivo and had protection effects on the obesity induced diabetes. Key words Type diabetes; TNF-; adenovirus 基金項(xiàng)目 江蘇省醫(yī)藥科技基金資助項(xiàng)目（0101002）作者簡(jiǎn)介 談青芬(1968 - ) ,女,江蘇宜興人,實(shí)驗(yàn)師

10、, 主要從事醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的教學(xué)及相關(guān)疾病模型的研究。電話E-mail:xbyx非胰島素依賴(lài)的型糖尿病是一種常見(jiàn)的代謝性疾病，其臨床主要特征表現(xiàn)為機(jī)體細(xì)胞對(duì)胰島素的耐受1。目前的研究表明，肥胖是機(jī)體細(xì)胞發(fā)生胰島素耐受，并最終引起糖尿病發(fā)生的主要誘因之一2。對(duì)該型糖尿病發(fā)生機(jī)制的進(jìn)一步研究表明，肥胖可誘導(dǎo)體內(nèi)分泌高水平的腫瘤壞死因子- (tumor necrosis factor-, TNF-)，干擾胰島素受體胞內(nèi)信號(hào)分子的磷酸化途徑，最終使機(jī)體形成胰島素耐受3。因而,減少體內(nèi)TNF-的分泌水平或降低其體內(nèi)生物學(xué)活性,可能是治療非胰島素依賴(lài)型糖尿病的一種可行、有效的方法。

11、在本研究中，我們將構(gòu)建的可溶性TNF-受體I （p55）（sTNFR-）重組腺病毒過(guò)繼至型糖尿病鼠體內(nèi)，觀察了其在體內(nèi)的表達(dá)、對(duì)TNF-生物學(xué)活性的影響，及對(duì)型糖尿病的治療作用進(jìn)行了初步探討。1材料與方法1.1材 料111 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C57BL/ 6J 雄性斷乳小鼠(21 d)，購(gòu)自上海必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。112 主要試劑 鏈脲佐菌素（streptozotocin,STZ）為Sigma產(chǎn)品。編碼可溶性TNF-受體（sTNFR-）的復(fù)制缺陷重組腺病毒（AdsTNFR）由第二軍醫(yī)大學(xué)王全興教授惠贈(zèng)4。RNAfast200總RNA 極速抽提試劑盒，購(gòu)自飛捷生物。 RT-PCR試劑盒購(gòu)自TOYOBO

12、，SYBR Green RT-PCR試劑盒和Premix Taq購(gòu)自大連TaKaRa。sTNFR-和TNF- ELISA試劑盒購(gòu)自R&D公司。TNF-、sTNFR、HRPT、-actin的引物序列均來(lái)自PrimerBank，由上海生工合成。11 方 法1.2.1 型糖尿病小鼠模型的建立 將C57BL/6J雄性斷乳小鼠隨機(jī)分成正常對(duì)照組、高脂飼喂組、高脂飼喂組+STZ組、高脂飼喂+STZ+ AdsTNFR組、高脂飼喂組+STZ + Ad-LacZ組。其中正常對(duì)照組8只鼠，其他各組每組10只鼠。型糖尿病小鼠模型的建立參照文獻(xiàn)5。即C57BL/ 6J 雄性斷乳小鼠，給予高脂肪飼料喂養(yǎng)3周,于

13、第3周末禁食12 h后, 按100 mg/ kg體重的劑量腹腔注射鏈脲佐菌素。于給藥后第4周末，剪尾取血，用SuperGlucocard 血糖儀測(cè)空腹血糖。1.2.2 重組可溶性TNFR-腺病毒的準(zhǔn)備及體內(nèi)過(guò)繼 編碼可溶性TNF-受體（sTNFR-）的復(fù)制缺陷重組腺病毒（AdsTNFR）接種293細(xì)胞并擴(kuò)增后，收獲病毒上清液，用氯化銫密度離心進(jìn)行純化，結(jié)合D(260 nm)的光密值和標(biāo)準(zhǔn)的空斑分析對(duì)病毒進(jìn)行效價(jià)滴定后，凍存于-80備用。在STZ注射3周后，從尾靜脈按109pfu/鼠的量注射AdsTNFR。分別在第3、5、7周測(cè)空腹血糖、血清及脂肪中的TNF-水平。同時(shí)，用僅含LacZ報(bào)告基因的

14、重組腺病毒(Ad-LacZ)做空白病毒載體對(duì)照。1.2.3 脂肪組織中TNF- mRNA的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 重組腺病毒注射小鼠前后，取腸系膜脂肪組織或眼眶取血，提取總RNA后，用SYBR RT-PCR試劑盒在LightCycler上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。TNF-的mRNA表達(dá)水平用HRPT的表達(dá)水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。1.2.4 肝組織中sTNFR-的RT-PCR檢測(cè) 取重組腺病毒注射后小鼠肝組織，按試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA后，進(jìn)行sTNFR-的RT-PCR 擴(kuò)增。1.2.5 sTNFR-和TNF-的ELISA 檢測(cè) 小鼠眼眶取血，制備血清，根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)sTNFR-、TN

15、F-蛋白水平。1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，P<0.05表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2 結(jié) 果2.1 糖尿病模型小鼠外周血與腸系膜脂肪組織高表達(dá)TNF-TNF- (pg/ml)* 正常小鼠外周血中通常只能檢出低水平的TNF-，高脂飼喂組也只表達(dá)類(lèi)似水平的TNF-，但高脂飲食結(jié)合STZ注射誘導(dǎo)的型糖尿病小鼠的外周血中的TNF-水平較高，與其他兩組相比較差異顯著（P<0.05）（見(jiàn)圖1）。同時(shí)，對(duì)不同組別鼠脂肪組織中表達(dá)的TNF- mRNA的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果也顯示出類(lèi)似的結(jié)果（P<0.01）（見(jiàn)圖2）。A:正常

16、對(duì)照組；B:高脂飼喂組；C: 高脂飼喂+STZ注射組。*: P<0.05圖1. 小鼠外周血中TNF-的ELISA檢測(cè)Fig1 The level of TNF- in blood analyzed by ELISATNF- mRNA (fold increase)*A:正常對(duì)照組；B:高脂飼喂組；C: 高脂飼喂+STZ注射組。*: P<0.01.圖2 小鼠腸系膜脂肪組織中表達(dá)的TNF- mRNA的定量RT-PCR檢測(cè)Fig2 Quantitative RT-PCR analysis of the expression of TNF- mRNA in mesenteric fat t

17、issue2.2 重組腺病毒轉(zhuǎn)染小鼠外周血中sTNFR-的表達(dá)檢測(cè)重組腺病毒注射小鼠后，在其外周血中可檢測(cè)到sTNFR-蛋白的表達(dá)，其表達(dá)水平在病毒注射后的第二天就可達(dá)21.4 g/ml，第7天則可高達(dá)40.2 g/ml（圖3），明顯高于Ad-LacZ組（P<0.001）。在其肝臟組織中可檢測(cè)出sTNFR-mRNA，其中AdsTNFR過(guò)繼組的sTNFR-mRNA表達(dá)豐度明顯高于Ad-LacZ組（圖4）。*t/dsTNFR(g/ml)*：P<0.001圖3 小鼠外周血中 sTNFR的ELISA 檢測(cè)Fig 3 The level of sTNFRin blood analyzed b

18、y ELISA.250 bp500 bpAdsTNFR-actinAd-LacZ1:Ad-LacZ組；2:AdsTNFR；3:-actin; 4:標(biāo)準(zhǔn)參照物圖4.小鼠肝組織中 sTNFR的RT-PCR 檢測(cè)Fig 4 The mRNA of sTNFRexpressed in liver analyzed by RT-PCR.2.3 AdsTNFR注射對(duì)型糖尿病小鼠血糖的影響高脂飼喂結(jié)合STZ注射后，小鼠外周血中在第3周時(shí)就可檢出較高水平的空腹血糖，在第4周時(shí)空腹血糖水平表現(xiàn)的更高，并一直保持相對(duì)穩(wěn)定。在造模的第3周過(guò)繼重組腺病毒AdsTNFR后，在第4、第5周時(shí)其血糖明顯受到控制（P<

19、0.05) （圖5）。血糖 /(mmol/L)t/ 周*: P<0.05圖5 AdsTNFR治療后小鼠的空腹血糖檢測(cè)Fig 5 The level of serum glucose in mice after being treated with AdsTNFR2.4 AdsTNFR-治療對(duì)型糖尿病小鼠外周血及脂肪組織中TNF-的影響AdsTNFR-的過(guò)繼，可有效地降低型糖尿病小鼠外周血中的TNF-水平（P<0.05），并且此效應(yīng)可維持4周以上，如圖6所示。但AdsTNFR-的應(yīng)用不能降低脂肪組織中的TNF- mRNA的表達(dá)（圖7）。TNF- (pg/ml)*:P<0.05A

20、:正常對(duì)照組；B:高脂飼喂組；C: 高脂飼喂+STZ注射組；D: 高脂飼喂+STZ注射組+Ad-LacZ;E: 高脂飼喂+STZ注射組+AdsTNFRI圖6 AdsTNFR治療后小鼠外周血中TNF-的ELISA檢測(cè)Fig6 The level of serum TNF-in mice after being treated with AdsTNFRanalyzed by ELISATNF- mRNA (倍數(shù))A:正常對(duì)照組；B:高脂飼喂組；C: 高脂飼喂+STZ注射組；D: 高脂飼喂+STZ注射組+Ad-LacZ;E: 高脂飼喂+STZ注射組+AdsTNFRI圖7. AdsTNFR治療后小鼠脂

21、肪組織中TNF-的定量RT-PCR檢測(cè)Fig 7 The expression of TNF- mRNA in fat tissue after being treated with AdsTNFRanalyzed by quantitative RT-PCR3討 論 TNF-是引起型糖尿病發(fā)生、發(fā)展的主要因子之一6。有研究資料表明，型糖尿病患者體內(nèi)表達(dá)的高水平TNF-主要由脂肪細(xì)胞、單核細(xì)胞等分泌。高水平的TNF-通過(guò)干擾脂肪細(xì)胞等細(xì)胞的胰島素受體胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，誘導(dǎo)機(jī)體對(duì)胰島素的耐受，最終引起糖尿病的發(fā)生。在本研究中，我們分別對(duì)高脂飲食結(jié)合STZ注射誘導(dǎo)的糖尿病模型鼠外周血及脂肪組織中TNF

22、-的表達(dá)水平進(jìn)行了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該糖尿病模型鼠的外周血及脂肪組織均可檢測(cè)到較對(duì)照組水平高的TNF-。此結(jié)果提示，與其他型糖尿病模型一樣，TNF-可能是高脂飲食結(jié)合STZ注射誘導(dǎo)小鼠發(fā)生型糖尿病模型的主要發(fā)病機(jī)制之一。TNF-是一種多功能的細(xì)胞因子，通過(guò)與細(xì)胞膜上的TNF-受體（TNFR）結(jié)合后，激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)途徑實(shí)現(xiàn)其生物學(xué)功能7?？扇苄缘腡NFR可特異性地與TNF-結(jié)合，并可有效地降低TNF-的生物學(xué)活性8,9，因而可用于TNF-介導(dǎo)的疾病的治療。在基因治療中，復(fù)制缺陷的重組腺病毒因其轉(zhuǎn)移效率高，不發(fā)生染色體整合等特點(diǎn)，已作為有效的基因載體廣泛應(yīng)用于臨床治療。本研究中，我們將可溶性TNFR

23、 重組腺病毒特異性地注射到小鼠體內(nèi)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)可溶性TNFR 重組腺病毒應(yīng)用可降低體內(nèi)血清中TNF-水平，并在一定程度上降低型糖尿病小鼠的空腹血糖水平。該結(jié)果表明，可溶性TNFR 重組腺病毒的體內(nèi)應(yīng)用對(duì)型糖尿病有一定的治療作用。Stephen 等10的結(jié)果表明, 利用TNF-抗體中和TNF-生物學(xué)活性后，可以逆轉(zhuǎn)骨胳肌細(xì)胞對(duì)胰島素的耐受，但不能有效逆轉(zhuǎn)脂肪細(xì)胞的胰島素耐受。在高脂飲食引發(fā)的型糖尿病中，其TNF-的主要來(lái)源細(xì)胞之一便是脂肪細(xì)胞。脂肪細(xì)胞可高分泌TNF-，通過(guò)自分泌或旁分泌的方式作用脂肪細(xì)胞等細(xì)胞，誘導(dǎo)這些細(xì)胞發(fā)生胰島耐受11。我們的結(jié)果表明，可溶性TNFR 重組腺病毒的應(yīng)用，并不能

24、有效降低小鼠脂肪組織中TNF-的mRNA表達(dá)。說(shuō)明可溶性TNFR 的體內(nèi)應(yīng)用不能減少脂肪組織TNF-的分泌，可能僅通過(guò)中和部分已表達(dá)的TNF-，來(lái)逆轉(zhuǎn)機(jī)體內(nèi)細(xì)胞對(duì)胰島素的耐受，實(shí)現(xiàn)對(duì)糖尿病鼠的血糖控制。綜上所述，本研究對(duì)可溶性TNFR 重組腺病毒治療型糖尿病進(jìn)行了初步探討。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，可溶性TNFR 重組腺病毒的應(yīng)用可中和TNF-的生物學(xué)活性，一定程度上降低空腹血糖水平，為型糖尿病的治療提供了新的思路。參考文獻(xiàn)1. Olefsky JM, Kolterman OG. Mechanisms of insulin resistance in obesity and noninsulin-depend

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