醫(yī)學標書范文

1、醫(yī)學標書范文 色素上皮衍生因子（ PEDF ）在膀胱癌中的表 達及其對膀胱癌治療作用的研究一、趨勢判斷和需求分析國內(nèi)外現(xiàn)狀、 水平和發(fā)展趨勢 （含知識產(chǎn)權狀況和技術標準狀況） ；經(jīng)濟建 設和社會發(fā)展需求；科學技術價值、特色和創(chuàng)新點。膀胱癌是危及人類健康的重大疾病，全世界范圍內(nèi) 統(tǒng)計其發(fā)病率占全身腫瘤的第 8 位，在男性其標準發(fā)病 率 9.9/10 萬；在女性，其標準發(fā)病率為 2.3/10 萬，占第 25 位。死亡率在男性為 4.2/10萬，占全身腫瘤死亡率的 第 9 位，在女性為 1.1/10 萬，占第 16 位。在我國 , 膀胱 癌也是泌尿外科的最常見惡性腫瘤， 占全身惡性腫瘤的 3.2%

2、，1995 年，北京市城區(qū)膀胱癌發(fā)病率大約為 7/10 萬人，上海市城區(qū)發(fā)病率為 8.6/10 萬人1 ，且今后發(fā)病 率仍有上升趨勢。作為危害人類健康的常見惡性腫瘤， 膀胱癌發(fā)病機制和治療方面的研究始終是臨床基礎研 究的重點之一。目前膀胱癌的治療仍以手術切除為主，輔以膀胱 灌注化療和免疫治療、全身化療、放療和生物治療等措 施, 但這些治療方法效果都不滿意，主要是治療后易復 發(fā)，復發(fā)率高達 80%，其中大約 16%-25% 復發(fā)的腫瘤 其惡性程度增加， 有 10% 發(fā)展為浸潤性或轉移性癌， 因 此,尋找一種新的、 更有效的生物治療方法， 是當前臨床 迫切需要解決的問題。在膀胱癌的這些輔助性治療方

3、法中，無論是化療還 是免疫治療，主要機制是通過直接殺死腫瘤細胞、阻斷 腫瘤細胞分裂或誘導細胞調(diào)亡的方式來抑制腫瘤生長。 做為一種實體性腫瘤生長，腫瘤細胞的增殖固然重要， 而新生血管的形成在腫瘤的生長和復發(fā)、 轉移過程中也 發(fā)揮非常重要作用。在正常狀態(tài)下，人體內(nèi)的脈管系統(tǒng) 在血管生長因子和抑制因子網(wǎng)絡式的相互作用下處于 平衡狀態(tài)；病理狀態(tài)下，尤其是發(fā)生惡性腫瘤時，這種 平衡向血管生成的方向發(fā)展。 當腫瘤生長達到腫瘤組織 超過 2mm 時就會有新生血管形成，如果沒有新生血管 生成，腫瘤生長明顯受到抑制，甚至停止 2， 3?？寡?管生成療法是不同于目前常規(guī)療法的新的腫瘤治療策 略，具有高效低毒和不易

4、產(chǎn)生耐藥性的特點 4 。有關血 管生長因子和血管生長抑制因子在腫瘤中所起作用， 以 及通過抗血管生成治療腫瘤已經(jīng)成為當前腫瘤研究的 一個熱點。近來研究發(fā)現(xiàn)，色素上皮衍生因子( pigment epithelium derived factor, PEDF )是一種對腫瘤有抑制 作用的細胞因子。這種細胞因子是 Tombran-Tink 等在 實驗中發(fā)現(xiàn)的， 由人視網(wǎng)膜色素上皮細胞分泌的一種蛋 白質(zhì)，分子量為 50 KD5 ，屬于 serpin 卵白蛋白/PAT-2 亞群，其基因全長 16 kb ，位于染色體 17p13.1-pter 6 。 多項研究表明， PEDF 是一種天然的高效的新 生血管

5、抑制劑 7 ，并通過誘導腫瘤細胞分化起到抑制腫 瘤生長的作用。 Tombran-Tink 等將 PEDF 基因定位于 染色體 17p13.1,腫瘤發(fā)生與該區(qū)域關系密切，提示該基 因可能是抑癌基因或腫瘤相關基因 5 。對腫瘤細胞進行 編碼 PEDF 的腺病毒轉染，在血管內(nèi)皮生長因子 ( Vascular endothelial growth factor ， VEGF )存在的 情況下， PEDF 明顯阻止了血管內(nèi)皮細胞管腔形成和遷 移。對患有 CNV/AMD 患者的體外實驗也發(fā)現(xiàn)， PEDF 大量減少的情況下，內(nèi)皮細胞有明顯遷移 ; 而對照組含 有正常水平 PEDF,則抑制了內(nèi)皮細胞的遷移6

6、。 Crawford 等發(fā)現(xiàn) PEDF 在神經(jīng)母細胞瘤中是腫瘤細胞 分化調(diào)控的主要的抗血管生成的抑制劑 7 。肝癌患者 血管增生和腫瘤發(fā)展中， PEDF 作為 VEGF 的拮抗因子， 起到了抑制作用。 對裸小鼠的在體實驗以及鼠的肺癌模 型也同樣證明了 PEDF 對腫瘤的抑制作用。 其機制乃因 PEDF 減少腫瘤微血管的密度，因而可被用于抑制腫瘤 新生血管形成，從而抑制腫瘤的生長，在腫瘤的治療前 景上非常樂觀 8 。我們最近對 PEDF 在膀胱癌中表達情況的初步 研究發(fā)現(xiàn)， PEDF 在膀胱癌組織中表達明顯低于正常膀 胱組織，而且 PEDF 表達情況與膀胱癌的惡性程度以及 癌組織中微血管密度呈負

7、相關， 提示 PEDF 在膀胱癌的 發(fā)生、發(fā)展中具有一定的作用， PEDF 的正常表達可能 抑制膀胱癌細胞的生長、增殖， PEDF 有可能成為膀胱 癌生物學治療的一種有效的新方法。目前國內(nèi)、外尚未 見此項研究的相關報道。因此我們設想，擴大樣本量， 應用分子生物學技術檢測膀胱癌組織及非癌膀胱組織 中 PEDF 的表達水平，進一步研究 PEDF 在膀胱癌中的 表達情況，并結合臨床資料分析 PEDF 表達與膀胱癌分 期、分級、轉移及預后的關系；通過研究膀胱癌組織中 PEDF 與 VEGF 表達的相關性， PEDF 與血小板反應素 -1表達的相關性，探討膀癌組織中 PEDF 表達與腫瘤血 管形成的相關

8、性及可能的作用機制； 通過研究 PEDF 表 達與金屬蛋白酶 -9（ MMP-9 ）的相關性，探討 PEDF 表達與膀胱癌浸潤的相關性； 通過研究 PEDF 表達與已 知的對腫瘤生長有明確調(diào)節(jié)作用的腫瘤壞死因子 （TNF- ）、白細胞介素 1（IL-1 ）、血栓調(diào)節(jié)蛋白 （thrombomodulin ）和白介素 8（ IL-8 ）等細胞因子表 達的相關性，探討 PEDF 表達對膀癌細胞調(diào)節(jié)的可能機 制，從而探討 PEDF 在膀胱癌發(fā)生、 發(fā)展過程中的可能 作用機制；在此基礎上，以連接有 PEDF 編碼基因的腺 病毒載體轉染膀胱癌細胞株、 以 PEDF 蛋白治療裸鼠膀 胱癌模型，進一步探討 P

9、EDF 表達對膀胱癌細胞生長的 抑制作用以及對膀胱癌的治療效果 ,為膀胱癌的生物學 治療探索一種有效的新方法。參考文獻2 吳階平， 吳階平泌尿外科學，山東科學技術出 版社， 2004.5：898-917二、研究內(nèi)容和技術關鍵 研究的總體目標：（1）研究 PEDF 表達與膀胱癌的發(fā)生、分期、分級、 轉移及預后的關系， 探討 PEDF 表達在膀胱癌發(fā)生、 發(fā) 展及轉移過程中可能的作用機制。（2）研究 PEDF 對膀胱癌細胞的治療效果， 為臨床治 療膀胱癌的生物治療探索一種新的有效方法 研究的創(chuàng)新點： 本課題研究的內(nèi)容和思路不同于以往的其他研究， 應用 分子生物學方法從研究 PEDF 表達與膀胱癌的

10、發(fā)生、 分 期、分級、轉移及預后的關系入手，探討 PEDF 表達在 膀胱癌發(fā)生、發(fā)展和轉移中可能的作用機制。在此基礎上，以連接有 PEDF 編碼基因的腺病毒載體轉染膀胱癌 細胞株、以PEDF 蛋白治療裸鼠膀胱癌模型， 探討 PEDF 對膀胱癌的治療作用。目前，本項研究國內(nèi)、外尚未見 報道。本研究的順利完成，將為膀胱癌的生物學行為的 研究開辟了新的途徑， 也將為膀胱癌的生物學治療探索 一種新的有效方法。研究的主要內(nèi)容：(1) 膀胱癌組織和非癌膀胱組織中 PEDF 和相關細 胞因子表達的檢測及相關性研究： 應用分子生物學技術研究膀胱癌組織和非癌膀胱 組織中 PEDF表達狀況，并檢測 VEGF 、T

11、SP-1、MMP-9 、 TNF- 、IL-1 、血栓調(diào)節(jié)蛋白( thrombomodulin )和 IL-8 的表達狀況；采用免疫組化技術檢測膀胱癌組織和 非癌膀胱組織中的微血管密度( microvascular density ， MVD )，分析 PEDF 與 VEGF 、TSP-1、MMP-9 、TNF- 、IL-1 、血栓調(diào)節(jié)蛋白和 IL-8 表達的相關性， PEDF 與 MVD 的相關性； 并結合臨床資料分析研究 PEDF 表 達與膀胱癌患者 5年生存率之間的關系； 闡明 PEDF 表 達與膀胱癌的發(fā)生、分期、分級、轉移及預后的關系， 探討 PEDF 表達在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展中的可能

12、機制。(2) PEDF 對膀胱癌細胞株的治療： 以連接有 PEDF 編碼基因的腺病毒載體轉染膀胱 癌細胞株 ,以空載轉染膀胱癌細胞株作為對照， 觀察檢測 VEGF 、TNF- 的表達情況及膀胱癌細胞的凋亡、增殖情況。(3) PEDF 對裸鼠膀胱癌模型的治療： 以人膀胱癌細胞種植于裸鼠皮下，建立裸鼠膀胱 癌模型。以 PEDF 蛋白(購自吉泰生物科技有限公司) 直接注射于裸鼠皮下腫瘤組織內(nèi)作為治療組， 以未注射 PEDF 組為陰性對照組。觀察各組的 MVD 、VEGF 及 腫瘤增殖情況， 探討 PEDF 表達在膀胱癌發(fā)生、 發(fā)展中 的作用機制， 評估 PEDF 對膀胱癌的治療效果， 為進一 步過度

13、到臨床應用提供依據(jù)。需要解決的技術關鍵：(1) 連接有 PEDF 編碼基因的腺病毒載體轉染膀胱 癌細胞株的轉染成功率。(2) PEDF 定量檢測：我們已有對前列腺癌、腎癌、 膀胱癌等組織標本的 PEDF 定量分析的基礎， 已形成較 成熟技術條件、設備和研究經(jīng)驗。(3) 膀胱癌裸鼠模型的構建。 我們已有成功構建裸鼠 膀胱癌和前列腺癌模型的經(jīng)驗。研究方法：方法( 1)膀胱癌組織和非癌膀胱組織中 PEDF和相關細 胞因子表達的檢測及相關性研究：實驗組對照組膀胱癌組織非癌膀胱組織炎性B期CD 期期標A 本期癌旁膀 正常膀膀胱胱組織 胱組織組織例 3030 30 30 數(shù)120 120 120應用 SY

14、BR Green I 實時定量聚合酶 鏈反應real-time PCR ）技術,對膀胱癌、非癌膀胱組織中 PEDF進行定量測定。Western blot 法檢測 VEGF、TSP-1、 MMP-9。ELISA法檢測 TNF- 、IL-1 、血栓調(diào)節(jié)蛋白、 IL-8濃度。免疫組化方法檢測標本 MVD。 整理臨床資料：膀胱癌患者性別、年齡、組織病理、分期、分級、是否轉移、 5 年生存率。數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 （使用 SPSS統(tǒng)計分析軟件 ）：PEDF與 VEGF表達的相關性。PEDF與 TSP-1 表達的相關性PEDF與 MMP-9表達的相關性-8 濃PEDF與 TNF- 、IL-1 、血栓調(diào)節(jié)蛋白、IL

15、 度的相關性。PEDF與組織 MVD相關性。PEDF與膀胱癌分期的相關性。PEDF與膀胱癌惡性程度（分級）的相關性。PEDF與膀胱癌轉移的相關性。PEDF與膀胱癌 5 年生存率的相關性。方法（ 2）PEDF對膀胱癌細胞株的治療：以連接有 PEDF編碼基因的腺病毒載體轉染膀胱癌 細胞, 以空載轉染膀胱癌細胞作為對照， 檢測 VEGF、TNF-濃度，觀察細胞的增殖、凋亡情況，分析相關性。 以 RT- PCR法擴增 PEDF基因。 將擴增后的 PEDF基因連接入腺病毒載體，轉染膀 胱癌細胞。并以空載轉染為對照。 Western blot 法檢測 VEGF 、TSP-1、MMP-9表達 觀察膀胱癌細胞

16、增殖、侵襲、凋亡情況。 統(tǒng)計分析 方法（ 3）PEDF對裸鼠膀胱癌模型的治療：以人膀胱癌細胞種植于裸鼠皮下， 建立裸鼠膀胱癌 模型。以 PEDF蛋白直接注射于裸鼠皮下腫瘤內(nèi)作為治 療組，以未注射 PEDF為陰性對照組。觀察兩組膀胱癌 組織 MVD、 VEGF表達情況、腫瘤增殖情況，評價 PEDF對膀胱癌的治療效果 以人膀胱癌細胞種植于裸鼠皮下構建膀胱癌裸鼠模型。將 PEDF蛋白注射于裸鼠瘤體內(nèi)。應用免疫組化方法檢測 MVD；應用 Western blot法檢測 VEGF、TSP-1、MMP-9；觀察腫瘤增殖、亡情況。分析 PEDF與 VEGF的相互作用關系及其對腫瘤生長的作用機制。技術路線：(

17、1)膀胱癌組織和非癌膀胱組織中 PEDF及相關細胞因子表達的檢測及相關性研究：膀胱癌標本癌旁膀胱組織標正常膀胱組織標炎性膀胱組織標120 例本 120 例本 120 例本 120 例RT-PCR 檢測 PEDF mRNA 表達Western blot 法檢測 VEGF、 TSP-1、MMP-9ELISA 法檢測 TNF- 、 IL-1 、 血栓調(diào) 節(jié)蛋白、 IL-8 濃度免疫組化方法檢測標本微血管密度(MVD)結合臨床資料，數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析(2) PEDF 對膀胱癌細胞株的治療：將 PEDF轉染膀胱癌細胞株，檢測 VEGF、 TSP-1、MMP-9、TNF-濃度，觀察腫瘤細胞的增殖、 凋亡情RT

18、PCR法擴增 PEDF基因空載體 連接入腺病毒載體轉染膀胱癌細胞株結果分析(3) PEDF 對裸鼠膀胱癌模型的治療：觀察 PEDF與 VEGF、MVD相關性及其對膀胱癌細胞 的抑制作用觀察微血 管密度 （MVD）VEGF、TSP-1、MMP-9定量測 定腫瘤凋亡、增 殖、侵襲情況結果分析先后開展了膀胱癌、前列腺癌等的一系列基礎 研究（包括分子生物學研究）和臨床研究，如：裸鼠膀 胱癌模型的建立、 CD44 基因、端粒酶、 P53和 Ras基 因等表達與膀胱癌的關系、 VEGF 表達與膀胱癌的關系 等，熟練掌握了泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤分子生物學和細胞學 研究的技術方法，如 RT-PCR 、 southe

19、rn 、 northern 雜交、 DNA 測序、擁有獨立的泌尿外科免疫、病理、 分子生物學和細胞學實驗室，實驗室設備完善，技術方 法先進，擁有 PCR- 擴增儀、酶標儀、各種電泳槽、凝 膠成像設備、細胞房及各種基礎實驗設備等 ,為本課題的 順利進行提供了有力的技術和儀器設備保證。細胞培 養(yǎng)、腺病毒載體構建等技術， 積累了較豐富的研究經(jīng)驗。 最近我們開展了對膀胱癌、前列腺癌組織中 PDEF 表達的初步研究，掌握了對腫瘤組織包括膀胱癌 組織中 PDEF 表達的檢測方法， 對本課題的順利進行提 供了便利條件。例如：已完成對膀胱腫瘤與正常膀胱組 織 PEDF 表達情況的對照性研究，初步結果顯示如下

20、:（1）定量 PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結果可見： PEDF 在正常膀胱組織中高表達 , 而在膀胱癌組織中表達明顯 降低（見圖 1）。圖 1： 正常膀胱組織與膀胱癌組織PEDF定量 PCR注：N1，N2，N3：正常膀胱組織T1，T2，T3：膀胱癌組織GAPDH：內(nèi)參照M：為標記分子量（2）在膀胱癌組織中 PEDF 低表達與微血管增殖相關 （見圖 2）。預期成果：（1）明確測定出 PEDF 在膀胱癌中的表達情況以及 其與相關細胞因子表達之間的關系。（2）PEDF 在膀胱癌發(fā)生、 發(fā)展過程中起重要作用。（3）PEDF 對膀胱癌的治療有效，為最終過渡到臨 床應用提供強有力的實驗依據(jù)。成果以論文的形式表達， 并申請“ PEDF 治療裸鼠膀 胱癌模型技術”的專利；擬發(fā)表論著 5 7 篇，其中國 內(nèi)權威雜志 45 篇， SCI 收錄雜志 2 篇。申請成果鑒本課題實施過程中，形成一整套的細胞因子檢測方 法、膀胱癌細胞株培養(yǎng)及腺病毒轉染膀胱