蛋白質(zhì)化學(xué)理化性質(zhì)與分離分析

1、會(huì)計(jì)學(xué)1蛋白質(zhì)化學(xué)理化性質(zhì)與分離分析蛋白質(zhì)化學(xué)理化性質(zhì)與分離分析-+-顆粒大?。涸?-100 nm之間，屬膠體，因此溶于水，成為親水膠體。 穩(wěn)定親水膠體的因素： 水化膜 表面電荷相同 不通透性：半透膜(semipermeable membrane)蛋白質(zhì)溶液是一種蛋白質(zhì)溶液是一種分散分散系統(tǒng)系統(tǒng)，蛋白質(zhì)分子顆粒，蛋白質(zhì)分子顆粒是分散相，水是分散介是分散相，水是分散介質(zhì)。分散相質(zhì)點(diǎn)小于質(zhì)。分散相質(zhì)點(diǎn)小于1 nm為真溶液，大于為真溶液，大于100 nm為懸濁液，介于為懸濁液，介于1-100 nm為膠體溶液。為膠體溶液。透析透析即用半透膜（透析袋）將大分子蛋白質(zhì)分即用半透膜（透析袋）將大分子蛋白質(zhì)分

2、離出來。在生物大分子制備過程中離出來。在生物大分子制備過程中除去鹽除去鹽、少量少量有機(jī)溶劑有機(jī)溶劑、生物小分子雜質(zhì)生物小分子雜質(zhì)和和濃縮樣品濃縮樣品，透析法，透析法最簡便。最簡便。透析時(shí)，小于透析時(shí)，小于MWCO（截留分子量）的分子在（截留分子量）的分子在透析膜二邊溶液濃度差產(chǎn)生的擴(kuò)散壓作用下滲過透析膜二邊溶液濃度差產(chǎn)生的擴(kuò)散壓作用下滲過透析膜，其透析膜，其速度與濃度梯度、膜面積及溫度成正速度與濃度梯度、膜面積及溫度成正比比。欲快速透析可采用直徑較小的透析袋以增加。欲快速透析可采用直徑較小的透析袋以增加膜面積。常用溫度：膜面積。常用溫度：4，升溫、更換袋外透析，升溫、更換袋外透析液或用磁力攪拌

3、器，均能提高透析速度。液或用磁力攪拌器，均能提高透析速度。 MWCO: molecular weight cut-off蛋白質(zhì)大分子溶液在一定溶劑中超速離心時(shí)可發(fā)生沉降。沉降速度與向心加速度之比值即為蛋白質(zhì)的沉降系數(shù)S。 s=v/2r s是沉降系數(shù)(sedimentation coefficient)，是離心轉(zhuǎn)子的角速度（弧度/秒），r是到旋轉(zhuǎn)中心的距離，v是沉降速度。沉降系數(shù)以每單位重力的沉降時(shí)間表示，蛋白質(zhì)、核酸、核糖體、病毒等的沉降系數(shù)通常為1-200 10-13秒范圍，10-13這個(gè)因子叫做沉降單位S（斯維德貝格單位，Svedberg unit），即1S=10-13秒，如血紅蛋白的S約

4、為410-13秒或4S。大多數(shù)蛋白質(zhì)和核酸的沉降系數(shù)在4S和40S之間，核糖體及其亞基在30S和80S之間，多核糖體在100S以上。 1924年年Svedberg（離心法創(chuàng)始（離心法創(chuàng)始人人-瑞典蛋白質(zhì)化學(xué)家）對瑞典蛋白質(zhì)化學(xué)家）對沉沉降系數(shù)降系數(shù)的定義：的定義：顆粒在單位離顆粒在單位離心力場中粒子移動(dòng)的速度心力場中粒子移動(dòng)的速度。 pH與鹽濃度對蛋白與鹽濃度對蛋白質(zhì)溶解度的共同作用質(zhì)溶解度的共同作用在變性因素的作用下，可導(dǎo)致各種變性現(xiàn)象。首先是生理活性喪失，如酶變性后，失去催化功能；激素變性后，失去生理調(diào)節(jié)功能；微生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)變性后，微生物失去生命力而死亡。這是變性作用最主要的特征。此外

5、，變性后的蛋白質(zhì)還表現(xiàn)出各種物理和化學(xué)性質(zhì)的改變。天然蛋白質(zhì)變性后，多肽鏈松弛伸展，導(dǎo)致粘度增大，內(nèi)部的側(cè)鏈?zhǔn)杷鶊F(tuán)暴露于表面，導(dǎo)致溶解度下降而易沉淀。同時(shí)由于變性后，結(jié)構(gòu)松散，側(cè)鏈基團(tuán)暴露，還使得其易于發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，例變性蛋白質(zhì)容易被酶水解。由于疏水側(cè)鏈暴露，可能導(dǎo)致紫外吸收增加。RNase的變性與復(fù)性的變性與復(fù)性硫酸銨對馬血紅蛋白的溶解度的影響硫酸銨對馬血紅蛋白的溶解度的影響離子強(qiáng)度（硫酸銨濃度）離子強(qiáng)度（硫酸銨濃度）+-+-（沉淀）（疏水膠體）（疏水膠體）三氯乙酸、苦味酸、磷鎢酸、鞣酸等生物堿沉淀試劑，能與蛋白質(zhì)陽離子結(jié)合生成不溶物, 而使蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆沉淀。如： +H3N-Pr-CO

6、O- + Cl3C-COO- H2N-Pr-COO-O-CO-CCl3 Cu2+、Hg2+、Pb2+、Ag+等重金屬陽離子，能與蛋白質(zhì)陰離子結(jié)合生成不溶物，使蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆沉淀。例如： H2N-Pr-COO- +Ag+ H2N-Pr-COOAg波長范圍：200-400 nm1、根據(jù)化學(xué)組成測定最低分子量用化學(xué)分析方法測出蛋白質(zhì)中某一微量元素的含量，并假設(shè)分子中只有一個(gè)這種元素的原子，就可以計(jì)算出蛋白質(zhì)的最低分子量。如肌紅蛋白含鐵0.335%，其最低分子量：最低分子量鐵的原子量鐵的百分含量100=16700 與其他方法測定結(jié)果極為接近，可見肌紅蛋白中只含一個(gè)鐵原子。真實(shí)分子量是最低原子量的n倍

7、，n是蛋白質(zhì)中鐵原子的數(shù)目，肌紅蛋白n1。血紅蛋白鐵含量也是0.335%，最低分子量也是16700，因?yàn)楹?個(gè)鐵原子，所以n4，因此其真實(shí)分子量為66800。有時(shí)蛋白質(zhì)分子中某種氨基酸含量很少，也可用這種方法計(jì)算最低分子量。如牛血清白蛋白含色氨酸0.58%，最低分子量為35200，用其他方法測得分子量為69000，所以其分子中含兩個(gè)色氨酸。最低分子量只有與其他方法配合才能確定真實(shí)分子量。2、滲透壓法理想溶液中，滲透壓是濃度的線性函數(shù)，而與溶質(zhì)的形狀無關(guān)。所以可用滲透壓計(jì)算蛋白質(zhì)的分子量。但是實(shí)際的高分子溶液與理想溶液有較大偏差，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度不大時(shí)，可用以下公式計(jì)算： /c =RT/M + Kc

8、 M=RT/lim( /c) 其中R是氣體常數(shù)(0.082)，T是絕對溫度， 是滲透壓（以大氣壓計(jì)），c溶質(zhì)濃度（g/L）。測定時(shí)需測定幾個(gè)不同濃度的滲透壓，以/c對c作圖并外推求出c為零時(shí)的/c值，帶入公式求出分子量（1-100000）。方法簡單準(zhǔn)確，與蛋白質(zhì)的形狀和水化程度無關(guān)，但要求樣品均一，否則測定結(jié)果是樣品中各種蛋白的平均分子量。 c03、沉降分析法蛋白質(zhì)在溶液中受到強(qiáng)大離心力作用時(shí)，如其密度大于溶液密度，就會(huì)沉降。用超速離心機(jī)（每分鐘68萬轉(zhuǎn)）測定蛋白質(zhì)的分子量有兩種方法：沉降速度法和沉降平衡法。沉降速度法沉降速度法： M=RTsD (1v)其中其中D是擴(kuò)散系數(shù)，是擴(kuò)散系數(shù)，v是蛋

9、白質(zhì)的偏微分比容，是蛋白質(zhì)的偏微分比容，是溶劑是溶劑的密度。的密度。偏微分比容的定義偏微分比容的定義是：當(dāng)加入是：當(dāng)加入1克干物質(zhì)于無克干物質(zhì)于無限大體積的溶劑中時(shí)，溶液的體積增量。限大體積的溶劑中時(shí)，溶液的體積增量。蛋白質(zhì)溶于蛋白質(zhì)溶于水的偏微分比容約為水的偏微分比容約為0.74立方厘米每克立方厘米每克。為獲得準(zhǔn)確結(jié)。為獲得準(zhǔn)確結(jié)果，果，s和和D的值應(yīng)外推到無限稀釋的值應(yīng)外推到無限稀釋。其中的。其中的R是氣體常數(shù)，是氣體常數(shù)，在采用厘米在采用厘米.克克.秒制時(shí)，等于秒制時(shí)，等于8.314107爾格爾格/秒。秒。沉降平衡法 在離心過程中，外圍高濃度區(qū)的蛋白質(zhì)向中心擴(kuò)散，如轉(zhuǎn)速較低，二者可達(dá)到穩(wěn)

10、定平衡。此時(shí)測定離心管中不同區(qū)域的蛋白濃度，可按下式計(jì)算分子量： M=2RTln(c2/c1)2(1v)(x22x12)其中c2和c1是離軸心距離為x2和x1時(shí)的蛋白質(zhì)濃度，x為蛋白質(zhì)界面到旋轉(zhuǎn)中心的距離，為溶劑的密度，為角速度，v為蛋白質(zhì)的偏微比容。沉降平衡法的優(yōu)點(diǎn)是不需要擴(kuò)散系數(shù)，且離心速度較低（800020000轉(zhuǎn)每分），但要達(dá)到平衡常常需要幾天時(shí)間。4、分子排阻層析法層析柱中填充凝膠顆粒，凝膠的網(wǎng)格大小可通過交聯(lián)劑含量控制。小分子物質(zhì)可進(jìn)入網(wǎng)格中，流出慢；大分子被排阻在顆粒外，流經(jīng)距離短，流出快。此方法較簡單，但與分子形狀有關(guān)。測分子量時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白的分子形狀應(yīng)與待測蛋白相同。 lgMK

11、1K2 Ve其中Ve是洗脫體積，即從加樣到出峰時(shí)流出的體積，K1和K2是常數(shù)，隨實(shí)驗(yàn)條件而定。先測定幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的Ve, 以它們的logM對Ve作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線，由待測樣品的Ve可求得。5、 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳蛋白質(zhì)電泳時(shí)的遷移率與其所帶凈電荷、分子大小和形狀有關(guān)，加入SDS后，每克蛋白可結(jié)合1.4克SDS，將原有電荷掩蓋，而且使分子變成棒狀。由于凝膠的分子篩效應(yīng)，相對遷移率R與分子量有如下關(guān)系： lgM=K1K2R其中K1和K2是與試驗(yàn)條件有關(guān)的常數(shù)，R為相對遷移率=樣品遷移距離/染料前沿遷移距離。用已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可求出未知蛋白的分子量。有些蛋白不適宜采用這個(gè)方法，

12、如帶電荷較多的（組蛋白），帶較大輔基的（糖蛋白），結(jié)構(gòu)特殊的（膠原）等。6、激光解吸電離飛行時(shí)間曲線(LDI-TOF-MS)高度純化的蛋白質(zhì)樣品與有機(jī)酸混合，在靶金屬表面干燥；激光發(fā)出的射線使蛋白質(zhì)離子化，離子經(jīng)加速后飛入自由漂移區(qū)，最后到達(dá)檢測器；飛行時(shí)間與分子量成反比，與電量成正比；測定誤差0.0001。16%N微量凱氏定氮蒸餾裝置微量凱氏定氮蒸餾裝置1.測定范圍：0.1-200 mg氮 2.蒸餾時(shí)間：3.5分鐘/樣品（30 mg氮）3.蒸餾能力：40 ml/分鐘4.滴定精度：3.8 ul/步，最快40 ml/分鐘5.重現(xiàn)性：1%相對誤差（包括消化過程）6.回收率：99.5% （1-200

13、 mg 氮）7.數(shù)據(jù)存儲(chǔ)：400個(gè)樣品8.試管排空：200 ml在2秒內(nèi)完成9.試劑泵體積：0-150 ml，10 ml/級(jí)Kjeltec 2300 自動(dòng)凱氏定自動(dòng)凱氏定氮儀氮儀 丹麥丹麥 NH2CONHCONH2 + NH3NH2CONH2 + NH2CONH2The Protein Protocols Handbook , by John M.Walker, Humana Press. Basic Principles of Protein PurificationAmmonium sulfate fractionationCellOrganelleHomogenizationMacrom

14、oleculeNucleic acidCarbohydrate(Lipid)SizeChargePolarityAffinitySmall moleculeCell DebrisProteinAmino acid, Sugar,Nucleotides, etc Gel filtration,SDS-PAGE,UltrafiltrationIon exchange,Chromatofocusing,Disc-PAGE,Isoelectric focusingReverse phasechromatography,HIC,Salting-outAffinitychromatography,Hydr

15、oxyapatiteJuang RH (2004) BCbasicsSubcellular Fractionation of TissueFractionationIsopycnic Centrifugation等密度（梯度）離心等密度（梯度）離心鹽析法 有機(jī)溶劑沉淀法 等電點(diǎn)沉淀法重金屬鹽沉淀法 生物堿試劑和某些酸類沉淀法 加熱變性沉淀法How to Separate These Objects 123910111264857458woodstone cotton wood woodcotton stone wood stone cotton stone cottoncottonwoodst

16、oneShapeSizeDensityShapeDensitySizeSieving different sizesDifferent sedimentationDifferent rolling speed467 8513467 8 910111225Juang RH (2004) BCbasics透析（dialysis）Ultracentrifugation Meeting of the Warsaw Society of Natural Scientists, Mikhail Semenovich Tswett presented a lecture entitled On a New

17、Category of Adsorption Phenomena and its Application in Biochemical Analysis. K=1/3K=2/3 1952年獲獎(jiǎng)年獲獎(jiǎng)如如陽離子交換層析陽離子交換層析，固體，固體填料上帶負(fù)電荷填料上帶負(fù)電荷，流動(dòng)相中帶凈正電荷的蛋白質(zhì)與帶凈負(fù)電荷的蛋流動(dòng)相中帶凈正電荷的蛋白質(zhì)與帶凈負(fù)電荷的蛋白質(zhì)相比流得更慢，前者因?yàn)榕c固定相電荷的作白質(zhì)相比流得更慢，前者因?yàn)榕c固定相電荷的作用受到更大的阻滯。兩種不同類型的蛋白質(zhì)可以用受到更大的阻滯。兩種不同類型的蛋白質(zhì)可以被分離成明顯的兩個(gè)帶。蛋白質(zhì)樣品在流動(dòng)相中被分離成明顯的兩個(gè)帶。蛋白質(zhì)樣品在

18、流動(dòng)相中的擴(kuò)展受到分離蛋白質(zhì)不同性質(zhì)的影響及擴(kuò)散的的擴(kuò)展受到分離蛋白質(zhì)不同性質(zhì)的影響及擴(kuò)散的影響。當(dāng)影響。當(dāng)柱長增加時(shí)，帶有不同凈電荷的兩類蛋柱長增加時(shí)，帶有不同凈電荷的兩類蛋白質(zhì)的分辨率增加白質(zhì)的分辨率增加。然而柱長增加通常會(huì)引起樣。然而柱長增加通常會(huì)引起樣品流速的降低，樣品流經(jīng)柱的時(shí)間長度增加，擴(kuò)品流速的降低，樣品流經(jīng)柱的時(shí)間長度增加，擴(kuò)散作用會(huì)引起分辨率的下降。散作用會(huì)引起分辨率的下降。離子交換層析 分子排阻層析(size-exclusion chromatography)，也稱凝膠過濾(gel filtration)，根據(jù)蛋白質(zhì)分子的大小進(jìn)行分離。柱料是具有特定孔徑大小的交聯(lián)聚合物。由

19、于較大分子的蛋白質(zhì)不能進(jìn)入柱料的微孔內(nèi)部，流經(jīng)柱的直接路徑短，因而比較小分子蛋白質(zhì)的移動(dòng)速度快而先被洗脫出來；較小分子的蛋白質(zhì)進(jìn)入微孔內(nèi)部，因相對較長的流經(jīng)距離而移動(dòng)得慢而后被洗脫。Gel filtration chromatography親和層析(affinity chromatography)，根據(jù)蛋白質(zhì)分子的結(jié)合特性分離蛋白質(zhì)。滯留在柱料上的蛋白質(zhì)是能特異性與柱料表面交聯(lián)的配體結(jié)合的蛋白質(zhì)。非結(jié)合的蛋白質(zhì)在平衡過程被洗掉，結(jié)合到柱上的目的蛋白質(zhì)用含有游離配體的溶液洗脫下來。親和層析需要有共價(jià)交聯(lián)在層析填料上的親和層析需要有共價(jià)交聯(lián)在層析填料上的生物配體生物配體，交聯(lián)的配體必需，交聯(lián)的配體

20、必需與目標(biāo)分子間有特與目標(biāo)分子間有特異性的親和結(jié)合異性的親和結(jié)合。非結(jié)合分子被洗去后，結(jié)合。非結(jié)合分子被洗去后，結(jié)合在配體上的生物分子必需是可逆的，被競爭洗在配體上的生物分子必需是可逆的，被競爭洗脫后保持生物活性。脫后保持生物活性。泵的結(jié)構(gòu)泵的結(jié)構(gòu) 0.5-5 cm 5-100 cm依賴于洗脫液中樣品分子與介質(zhì)可逆的相互作用。起始條件主要是水相的，有利于高度有序的水結(jié)構(gòu)圍繞著樣品分子。通常一小部分有有機(jī)修飾，常用3-5%的乙腈來“造成”濕表面。樣品結(jié)合到填料上，暴露給洗脫液的疏水區(qū)域被最小化，分離依賴于樣品分子在洗脫液中和填料表面達(dá)到的平衡。樣品的分布依賴于填料的性質(zhì)、樣品的疏水性和洗脫液的組

21、成（流動(dòng)相）。通常一個(gè)特定蛋白質(zhì)的分離純化會(huì)用到幾種不同手段的組合，每通常一個(gè)特定蛋白質(zhì)的分離純化會(huì)用到幾種不同手段的組合，每種方法的選擇也是經(jīng)驗(yàn)性的，在最終確定最有效的方法前需要進(jìn)種方法的選擇也是經(jīng)驗(yàn)性的，在最終確定最有效的方法前需要進(jìn)行多種方法及其組合的嘗試。一般情況會(huì)出現(xiàn)以下不同方法的試行多種方法及其組合的嘗試。一般情況會(huì)出現(xiàn)以下不同方法的試驗(yàn)和最終組合。驗(yàn)和最終組合。蛋白質(zhì)的電泳通常在交聯(lián)的多聚物凝膠（如聚丙烯酰胺凝膠）上進(jìn)行。聚丙烯酰胺凝膠起著分子篩的作用，能減緩電荷/質(zhì)量比相近蛋白質(zhì)的遷移。待分離物質(zhì)的遷移可能還受分子形狀的影響。電泳中，驅(qū)動(dòng)大分子運(yùn)動(dòng)的力是電勢梯度-E（場強(qiáng)）。分

22、子的電泳遷移率等于粒子的電壓與電場場強(qiáng)的比值，還等于分子的凈電荷Z與摩擦系數(shù)f (frictional coefficient)（部分反映蛋白質(zhì)分子的形狀）的比值。 =V/E=Z/f因此，蛋白質(zhì)在電場中的電泳遷移是大小和形狀的作用結(jié)果。E. coli RNA Pol.電泳現(xiàn)象早在1809年就已發(fā)現(xiàn)，用于蛋白質(zhì)電泳也有100多年的歷史（1907年）。1937年瑞典的Tiselius因?qū)﹄娪径糠矫娴呢暙I(xiàn)而獲得諾貝爾獎(jiǎng)。以后瓊脂電泳和紙電泳技術(shù)進(jìn)一步發(fā)展，并與醫(yī)學(xué)廣泛結(jié)合。在20世紀(jì)60年代凝膠電泳的興起，樹立了電泳史上的一個(gè)里程碑，蛋白質(zhì)電泳普及到生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的大部分實(shí)驗(yàn)室。30多年前，現(xiàn)代雙向

23、電泳的出現(xiàn)，奠定了目前蓬勃發(fā)展的蛋白質(zhì)組學(xué)的基礎(chǔ)；20年前，商品化的毛細(xì)管電泳突飛猛進(jìn)的發(fā)展，使電泳操作實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化。 1948年分離血清蛋白的工作獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)，成功將血清蛋白分成5個(gè)主要成分-清蛋白、1-、2-、-和-球蛋白。紙電泳的儀器裝置包括電泳槽及電泳儀兩大部分。 電泳槽是進(jìn)行電泳的裝置，其中包括鉑電極(直徑0.5-0.8 cm)、緩沖液槽、電泳介質(zhì)的支架和一個(gè)透明的罩。常見的電泳槽有水平式和懸架式等。電泳儀是提供直流電源的裝置，它能控制電壓和電流的輸出。電泳槽內(nèi)的鉑電極經(jīng)隔離導(dǎo)線穿過槽壁與外接電泳儀電源相連，電源為具有穩(wěn)壓器的直流電源。 單體：丙烯酰胺，甲叉雙丙烯酰胺引發(fā)劑引發(fā)劑

24、加速劑加速劑引發(fā)反應(yīng)引發(fā)反應(yīng)(NH4)2S2O8(NH4)2S2O8核黃素核黃素TEMEDDMAPNTEMED化學(xué)聚合化學(xué)聚合化學(xué)聚合化學(xué)聚合光聚合光聚合聚合反應(yīng)催化劑的搭配聚合反應(yīng)催化劑的搭配TEMED: N, N, N1, N1-tetramethylethylenediamine N,N,N1,N1-四甲基乙二胺四甲基乙二胺DMAPN: 3-dimethylaminpropionitrile，3-二甲基氨丙腈二甲基氨丙腈化學(xué)聚合：過硫酸銨在TEMED或DMAPN的催化下形成氧自由基，進(jìn)而使單體形成自由基，引發(fā)聚合反應(yīng)。聚丙烯酰胺凝胺的分離膠(小孔膠)，就是通過這種化學(xué)聚合而合成的。光聚合

25、：核黃素在光下形成無色基，后者被氧再氧化形成自由基，從而引發(fā)聚合反應(yīng)。但過量的氧會(huì)阻止鏈長的增加。此法比上法制得凝膠的膠孔大，因此常作電泳中的濃縮膠。聚丙烯酰胺凝膠有下列特性：(1)在一定濃度時(shí)，凝膠透明，有彈性，機(jī)械性能好；(2)化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不反應(yīng)，很多溶劑中不溶；(3)對pH和溫度變化較穩(wěn)定；(4)幾乎無吸附和電滲作用，只要Acr純度高，操作條件一致，則樣品分離重復(fù)性好；(5)樣品不易擴(kuò)散，且用量少，其靈敏度可達(dá)10-6g （1 g）(6)凝膠孔徑可調(diào)節(jié)，根據(jù)被分離物的分子量選擇合適的濃度，通過改變單體及交聯(lián)劑的濃度調(diào)節(jié)凝膠的孔徑。正面正面剖面剖面樣品和濃縮膠中含 Tris-H

26、Cl (pH 6.8), 上下槽緩沖液含Tris-甘氨酸(pH 8.3), 分離膠中含Tris-HCl (pH 8.8)。系統(tǒng)中所有組分都含有0.1% 的 SDS (Laemmli, 1970)。 （1）樣品濃縮效應(yīng)（a）凝膠孔徑不連續(xù)性（b）緩沖體系離子成分及pH值的不連續(xù)性在pH6.7的凝膠緩沖體系中： 前導(dǎo)離子或快離子：HC1解離出的氯根(C1-) 尾隨離子(trailing ion)或慢離子：甘氨酸根 mclclmppmGG (Cl代表氯根，P代表蛋白質(zhì)，G代表甘氨酸根) 有效遷移率=m，m為遷移率，為解離度)當(dāng)進(jìn)入pH8.9的分離膠時(shí)，甘氨酸解離度增加，其有效遷移率超過蛋白質(zhì)；（c）電位梯度的不連續(xù)性：（2）分子篩效應(yīng)（3）電荷效應(yīng)A為電泳前3層凝膠排列順序，3層膠中均有快離子，慢離子；B顯示電泳開始后，蛋白質(zhì)樣品夾在快、慢離子之間被濃縮成極窄的區(qū)帶