實時熒光定量PCR方法簡介

1、實時熒光定量PCR方法簡介一.實時熒光定量PCR的基本原理理論上，PCR過程是按照2n （ n代表PCR循環(huán)的次數(shù)）指數(shù)的方式進行模板的擴增。但 在實際的PCR反應(yīng)過程中，隨著反應(yīng)的進行由于體系中各成分的消耗（主要是由于聚合酶 活力的衰減）使得靶序列并非按指數(shù)方式擴增，而是按線性的方式增長進入平臺期。因此在起始模板量與終點的熒光信號強度間沒有可靠的相關(guān)性。如采用常規(guī)的終點檢測法（利用 EB染色來判斷擴增產(chǎn)物的多少，從而間接的判斷起始拷貝量），即使起始模板量相同經(jīng) PCR 擴增、EB染色后也完全有可能得到不同的終點熒光信號強度。為了能準確判斷樣品中某基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（mRNA ）的起始拷貝數(shù)，實時熒

2、光定量PCR采用新的參數(shù)一一Ct值，定量的根本原理是 Ct值與樣品中起始模板的拷貝數(shù)的對數(shù)成線性反 比關(guān)系。Ct值是如何得到的在實時熒光定量 PCR的過程中，靶序列的擴增與熒光信號的檢測 同時進行，定量PCR儀 全程采集熒光信號，實驗結(jié)束后 分析軟件自動按數(shù)學算法扣除熒光本底信號并設(shè)定閾值從而 得到每個樣品的 Ct值。FborMCflrKDtectiaryCt值的定義Ct值中的“ C”代表Cycle （循環(huán)），“t”代表檢測threshhold （閾值），其含義是 PCR擴 增過程中熒光信號強度達到閾值所需要的循環(huán)數(shù)；也可以理解為擴增曲線與閾值線交點所對應(yīng)的橫坐標。Ct值與樣品中模板的對應(yīng)關(guān)系

3、Ct值與樣品中起始模板的拷貝數(shù)的對數(shù)成線性反比關(guān)系（y=ax+b，x代表起始模板拷貝數(shù)的對數(shù)，y代表Ct值）。Log Starting QuantitynanogramsCorrelation Coefficient： 0.99-1 Slope: -3.717 Intercept: 31.995 V-3.717 X + 3L.995PCR Efficiency: 85.8%Unknowns»Standad;與終點法相比利用Ct值的優(yōu)勢由于Ct值是反映實際PCR反應(yīng)過程中擴增即將進入指數(shù)期的參數(shù)，該參數(shù)幾乎不受試劑消耗等因素的影響，因此利用Ct值判斷的起始模板拷貝數(shù)更加精確，重復性也更

4、好。傳統(tǒng)的終點檢測法是在 PCR擴增經(jīng)歷了指數(shù)擴增期進入平臺期后利用EB等染料染色來判斷擴增產(chǎn)物的多少，從而間接的判斷起始拷貝量，這種方法的精確度不高、重復性也不好。下圖中是96個復孔的實時擴增曲線（完全相同的反應(yīng)體系、相同的反應(yīng)protocol、相同的樣品起始濃度），可以看到Ct值具有很好的重復性，而終點的熒光信號強度差異達到300個單位。nILLuLLUPEP畑七qns £g沿 8864222%84240 >I336342330>'u2此外，采用實時熒光定量 PCR還能從方法學上有效的防止PCR實驗中交叉污染的問題。因為熒光定量 PCR中模板的擴增與檢測是同時

5、進行的，當實驗完成后即可獲得定量結(jié)果,直接丟棄含有大量擴增產(chǎn)物的反應(yīng)管， 徹底避免了傳統(tǒng)方法中取出擴增產(chǎn)物進行電泳鑒定時 擴增產(chǎn)物對實驗室造成二次污染的可能性。二 熒光定量 PCR 的 2 類方法（按熒光產(chǎn)生的原理分類） 染料法（ SYBR Green 法）染料法即利用 SYBR Green 分子產(chǎn)生的熒光信號來進行樣品定量 。該方法與常規(guī)的 PCR 類似，唯一的區(qū)別是在反應(yīng)體系中加入了SYBR Green染料分子。該染料分子的激發(fā)波長為497nm,發(fā)射波長為520nm。與EB的性能類似，SYBR Green也是一種扁平狀的分子，處 于游離狀態(tài)時具有很低的熒光本底，當反應(yīng)體系中存在dsDNA時

6、，SYBR Green能特異性的與之結(jié)合并在 497nm 激發(fā)下。染料法的優(yōu)點： 1,無需設(shè)計、合成探針,實驗成本低；2,使用方便,與常規(guī) PCR 的操作幾乎相同。染料法的缺點：1，由于SYBR Green與dsDNA的結(jié)合只具有結(jié)構(gòu)特異性而不具有序列特 異性，除了與特異性的靶序列擴增產(chǎn)物結(jié)合外，還能與在 PCR 擴增過程中形成的 引物二聚 體、非特異性擴增產(chǎn)物結(jié)合 ,從而造成擴增效率的降低、 結(jié)果的不準確。 因此采用該方法對 于引物的設(shè)計及實驗條件的優(yōu)化要求很高,確保反應(yīng)過程中沒有非特異性產(chǎn)物的擴增；2,由于 SYBR Green 的上述特點,該方法 不能應(yīng)用于 Multiplex QPCR

7、 技術(shù)。（在一個反應(yīng)管中 同時檢測多個目的基因的表達情況）探針法（以 TaqMan 探針為例）探針法熒光定量 PCR 與常規(guī) PCR 的不同之處在于： 在上、下游引物外還加入了具有序 列特異性的探針 （探針本身具有熒光標記） ,該探針根據(jù)需要擴增的靶序列設(shè)計因此只能與 待檢測序列結(jié)合,與染料法相比提高了實驗的特異性。目前市場上的探針主要種類有： TaqMan、Molecular Beacon 、Scorpions、Hybirdization 等,其中以 TaqMan 探針應(yīng)用最廣泛。TaqMan探針的結(jié)構(gòu)：長度與普通 PCR引物類似，大約20bp左右。在5與3 '端各標記有 一 個 熒

8、光 基團 , 5'的 熒光 基團 稱為 報告 基團 （ Report ）, 3'的 熒光 基團 稱為 淬滅 基 團 （Quencher）。TaqMan探針的性能：在探針結(jié)構(gòu)完整的情況下用特定的波長激發(fā)報告基團，由于報告基 團與淬滅基團的空間位置很近, 因此報告基團能夠通過 FRET（ Fluorescence Resonance Energy Transfer）將接受的能量轉(zhuǎn)移到淬滅基團，使后者以發(fā)射熒光或熱量的方式釋放能量，而報 告基團并不發(fā)射特定波長的熒光信號。TaqMan探針法工作原理：變性（95° C）:模板dsDNA充分解鏈； 復性、延伸、酶切降解（ 60&

9、#176; C）： 1,探針與靶序列結(jié)合；上、下游引物與靶序列結(jié)合；3,上、下游引物在Taq酶的作用下合成互補鏈（5'宀3'聚合功能）;4,當上游引物延伸 到TaqMan探針的5'端時，延伸不能繼續(xù)，此時 Taq酶發(fā)揮53'外切功能將探針逐一水 解并繼續(xù)向前延伸直至完成互補鏈的合成；熒光信號的檢測：由于TaqMan探針被水解，報告基團在受到激發(fā)后不能再通過 FRET作 用將接受的能量轉(zhuǎn)移給淬滅基團, 因此可以檢測到報告基團特定波長的熒光信號, 起始 模板濃度越高熒光信號越強。FluorophoreQuencherPCR PrimerC TaqMon AProbe

10、PCR PrimerPolymerizationFluorescenceAmplification AssayProbe Displacementand CleavageResultFluorescencePCR ProductsCleavage Products與染料法相比TaqMan探針法的優(yōu)點：1實驗的特異性得到了提高；2，對探針的5'端采用不同的熒光標記就可以進行 Multiplex QPCR。與染料法相比TaqMan探針法的缺點：1,探針的使用提高了實驗成本；2，探針的使用需要設(shè)計及優(yōu)化。三.確定樣品起始模板拷貝數(shù)的 2類方法絕對定量采用絕對定量的方法需要使用 標準品（已知起

11、始拷貝數(shù)的樣品）建立標準曲線 ，建立Ct 值與樣品起始模板拷貝數(shù)的對數(shù)之間的線性關(guān)系，從而通過實驗后樣品的 Ct值得出起始模板量。標準品的種類：含目的基因的質(zhì)粒（經(jīng)酶切線性化處理，其中的插入片段必須采用與 QPCR 實驗中相同的引物擴增得到）、PCR擴增產(chǎn)物（經(jīng)純化，必須采用與QPCR實驗中相同的引物 擴增得到）、化學合成的寡聚核苷酸、cDNA、gDNA等，前2種標準品使用較為廣泛。標準品的定量：UV A260、熒光分光光度檢測等。1，對各樣品進行為了使實驗最終得到的 Ct值之間具有可比性，必須進行歸一化的處理：細胞計數(shù)，使各樣品的起始細胞數(shù)一致(可操作性不強，尤其是針對組織、腫瘤等樣品)；2

12、,對純化后得到的總 RNA進行定量，使各樣品進行 RT-PCR時加入的RNA用量一致。相對定量與絕對定量不同，相對定量不關(guān)心每個樣品中目的基因表達產(chǎn)物(mRNA)的具體拷貝數(shù)，而關(guān)注目的基因在不同的細胞類型、不同的發(fā)育周期等條件下不同的轉(zhuǎn)錄效率，即基因的差異化表達。就研究目的而論，該方法比絕對定量的應(yīng)用范圍更廣泛、更符合研究的目的。 某目的基因在樣品與對照品間表達差異倍數(shù)的計算公式如下：GO1 sampleRel.Quantity 二/GO1 controlNorm sampleNorm control“ , % ( Ctcontrol Cisample )(1Eff )goi“ + 匚ff

13、( Ctcontrol-Ctsample )(1Eff ) Norm公式說明:Rel.Quantity : 目的基因在樣品與對照品間表達差異的倍數(shù)；GOI :目的基因(Gene of Interest)；Norm :內(nèi)參基因( Reference Gene，Normalizer， House Keeping Gene)Eff: PCR擴增效率，分子部分為目的基因擴增效率，分母部分為內(nèi)參基因的擴增效率； 使用該公式時，需要通過實驗分別確定目的基因與內(nèi)參基因的擴增效率然后代入公式進行計 算；如果目的基因與內(nèi)參基因的擴增效率都接近于100%且相差小于5%,也可將PCR擴增效率默認為100%，這樣公式

14、就簡化為 2-AACt。為什么需要設(shè)立內(nèi)參基因？如果僅僅比較目的基因的ACt是不能準確反映樣品間目的基因的表達差異的，最主要是受到3個變量的影響：1，樣品處理時不同的純化得率；2, RT-PCR過程中不同的逆轉(zhuǎn)錄效率；3，QPCR反應(yīng)體系中不同的 cDNA加入量。由于上述3個變量在樣品間都很難控制 在相同的水平上，因此需要引入內(nèi)參基因來 矯正上述變量進行歸一化處理，使得所有樣品目的基因表達水平的比較是在相同的水平上進行的，這樣得出的結(jié)果才具有可信性與良好的重復性。(注意：內(nèi)參基因的(1+Eff ACt)位于分母的位置，進行除法的運算。)如何選擇內(nèi)參基因？符合什么標準的基因可以作為內(nèi)參基因？由于

15、上述內(nèi)參基因的用途，因此內(nèi)參基因的選擇必須滿足以下3個條件：1，在不同的細胞、組織中具有 恒定的表達；2，在不同的細胞周期、發(fā)育周期中具有恒定的表達；3,在不同的實驗狀態(tài)下具有恒定的表達。 內(nèi)參基因的 ACt 一般小于2 (即小于1倍的表達差異)， 一般采用的內(nèi)參基因都是一些管家基因，使用最多的為：？-actin、GAPDH、18sRNA等。需要注意的是：并非傳統(tǒng)意義上的管家基因都能作為內(nèi)參基因，還是需要與具體的實驗結(jié)合起來綜合考慮。例如GAPDH在II型糖尿病病人中就明顯的高表達，不能作為內(nèi)參基因。因此在選擇內(nèi)參基因時建議：1,查閱相關(guān)文獻；2，設(shè)立多個內(nèi)參基因；3,采用表達譜的方法確定理想

16、的內(nèi)參基因。采用 Singleplex 還是 Multiplex ?可 以采用 Singleplex 的方法在不同的反應(yīng)管內(nèi)得到同一樣品目的基因與內(nèi)參基因的 Ct 值，再利用上述公式進行計算。在這種情況下可以使用 SYBR Green 法進行實驗。也可采用 Multiplex 的方法在一個反應(yīng)管內(nèi)得到同一樣品目的基因與內(nèi)參基因的 Ct 值， 再利用上述公式進行計算。 采用 TaqMan 探針法 （目的基因與內(nèi)參基因的探針進行不同的熒 光標記）可以采用 Multiplex 的方法。Multiplex 對于 Singleplex 的優(yōu)點： 1，節(jié)約了 樣品的使用量 ，尤其是針對樣品比較珍貴 的情況

17、； 2，可以加快實驗的 速度 ，節(jié)約實驗成本； 3，避免了 Singleplex 的誤差 ，因為目的 基因與內(nèi)參基因是在不同的反應(yīng)管內(nèi)得到的。四 引物與探針的設(shè)計QPCR 引物設(shè)計與常規(guī) PCR 引物設(shè)計的原則基本相同，需特別注意的就是為了盡可能 使PCR擴增的效率達到100%,因此QPCR擴增產(chǎn)物的 片段長度一般小于 400bp,在設(shè)計引 物的時候盡可能將產(chǎn)物長度控制的短些。引物與探針設(shè)計的要求： 1，高 PCR 擴增效率，接近 100%；2，高特異性，擴增過程中 沒有非特異性產(chǎn)物； 3，實驗的重復性，相關(guān)系數(shù)接近 1。SYBR Green 法（引物設(shè)計基本原則）PCR 擴增產(chǎn)物長度范圍 1

18、00400bp， 擴增片段中避免出現(xiàn)強烈的二級結(jié)構(gòu)； 引物的 GC 含量為 3080%，最佳范圍 5060%；引物的Tm值范圍為6267°,上、下游引物的 ATm小于2°C; 引物序列中避免出現(xiàn)連續(xù) 4 個相同的堿基 ；避免引物本身或引物間形成 二級結(jié)構(gòu) ，在引物 3'端最后 5個堿基中避免出現(xiàn) 2個以上 的G或C;引物最好設(shè)計在不同 Exon 的區(qū)域，其間含有一些比較大的 Intron ；禾U用BLAST或其他引物設(shè)計軟件（如 Beacon Designer）對引物的特異性進行檢查。TaqMan 探針法（引物設(shè)計基本原則）PCR擴增產(chǎn)物長度范圍 70150bp，擴

19、增片段中避免出現(xiàn)強烈的二級結(jié)構(gòu)； 先確定探針的位置與序列再設(shè)計相對應(yīng)的引物；引物的 GC 含量為 3080%，最佳范圍 5060%；引物的Tm值范圍為5860 °C, 上、下游引物的 ATm小于2°C; 引物序列中避免出現(xiàn)連續(xù) 4個相同的堿基； 避免引物本身或引物間形成二級結(jié)構(gòu)，在引物3'端最后 5個堿基中避免出現(xiàn) 2個以上的 G 或 C；引物最好設(shè)計在不同 Exon 的區(qū)域，其間含有一些比較大的 Intron ；禾U用BLAST或其他引物設(shè)計軟件（如 Beacon Designer）對引物的特異性進行檢查。TaqMan 探針法（探針設(shè)計基本原則） 先確定探針的位置

20、與序列再設(shè)計相對應(yīng)的引物； 探針的 GC 含量為 3080%，最佳范圍 4060%； 探針的 Tm 值比上、下游引物的 Tm 值高 10°C； 探針 5'端的第一個堿基不能是 G；探針5'端第一個堿基與上游引物 3'端最后一個堿基的距離控制在 110bp范圍內(nèi)； 探針序列中避免出現(xiàn)連續(xù) 3個以上相同的堿基，尤其是 G；采用分析軟件（如 Beacon Desig ner）分析，避免探針本身或探針與引物間形成強烈的 二級結(jié)構(gòu)。五.QPCR實驗優(yōu)化的3大指標與引物、探針設(shè)計的要求相同，QPCR實驗優(yōu)化的目的就是獲得：1高PCR擴增效率;2，高特異性；3,良好實驗的重復性；4盡可能廣的檢測動力學范圍。一般在采用設(shè)計好的 引物與探針進行大規(guī)模樣品實驗前，需要通過預(yù)實驗確認PCR擴增效率、特異性、重復性并進行優(yōu)化。PCR擴增效率無論采用絕對定量還是相對定量，PCR擴增效率越接近100%越好，因為在這種情況下實際的PCR擴增就越符 合2n擴增，這樣在 相對定量時就能采用 2- A