第章 色譜分析法

1、第七章第七章 色譜分析法色譜分析法chromatography 第一節(jié)第一節(jié) 色譜基本理論色譜基本理論 第二節(jié)第二節(jié) 氣相色譜法氣相色譜法 (gas chromatography, gc) 第三節(jié)第三節(jié) 高效液相色譜法高效液相色譜法 (high performance liquid chromatography, hplc)第一節(jié)第一節(jié) 色譜基本理論色譜基本理論一、一、 概述概述（一）色譜法（一）色譜法o 色譜法色譜法(chromatography)是一種是一種分離分離分析分析方法。方法。o 色譜法由俄國植物學(xué)家茨維特色譜法由俄國植物學(xué)家茨維特(tswett)分分離植物色素時(shí)采用。離植物色素時(shí)

2、采用。 ntswett在研究植物葉的色素成分時(shí)，將植物葉子的萃取物倒入填有碳酸鈣的直立玻璃管內(nèi)，然后加入石油醚使其自由流下，結(jié)果色素中各組分互相分離形成各種不結(jié)果色素中各組分互相分離形成各種不同顏色的同顏色的譜帶譜帶。這種方法因此得名為色譜法。這種方法因此得名為色譜法。n以后此法逐漸應(yīng)用于無色物質(zhì)的分離，“色譜色譜”二字雖已失去原來的含義，但仍被人們沿用至今。 固定相固定相caco3顆粒顆粒(stationary phase) 流動(dòng)相流動(dòng)相石油醚石油醚 (mobile phase) 洗脫（淋洗）洗脫（淋洗）(elution) 試樣混合物的分離過程試樣混合物的分離過程也就是試樣中各組分在也就是試

3、樣中各組分在稱之為色譜分離柱中的稱之為色譜分離柱中的兩相間不斷進(jìn)行著的分兩相間不斷進(jìn)行著的分配過程。配過程。 其中的一相固定不動(dòng)，其中的一相固定不動(dòng)，稱為稱為固定相固定相； 另一相是攜帶試樣混另一相是攜帶試樣混合物流過此固定相的流合物流過此固定相的流體（氣體或液體），稱體（氣體或液體），稱為為流動(dòng)相流動(dòng)相chromatogram of compounds from fermented cabbagechromatogram of orange juice compounds（二）色譜法的本質(zhì)（二）色譜法的本質(zhì) 當(dāng)流動(dòng)相中攜帶的混合物流經(jīng)固定相時(shí)，其與固定相發(fā)當(dāng)流動(dòng)相中攜帶的混合物流經(jīng)固定相時(shí)，

4、其與固定相發(fā)生相互作用。由于混合物中各組分在性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上的差異，生相互作用。由于混合物中各組分在性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上的差異，與固定相之間產(chǎn)生的與固定相之間產(chǎn)生的作用力作用力的大小、強(qiáng)弱不同，隨著流動(dòng)相的大小、強(qiáng)弱不同，隨著流動(dòng)相的移動(dòng)，混合物在兩相間經(jīng)過反復(fù)多次的分配平衡，使得各的移動(dòng)，混合物在兩相間經(jīng)過反復(fù)多次的分配平衡，使得各組分被固定相保留的時(shí)間不同，從而按一定次序由固定相中組分被固定相保留的時(shí)間不同，從而按一定次序由固定相中流出。流出。 與適當(dāng)?shù)闹髾z測(cè)方與適當(dāng)?shù)闹髾z測(cè)方法結(jié)合，實(shí)現(xiàn)混合物中各法結(jié)合，實(shí)現(xiàn)混合物中各組分的分離與檢測(cè)組分的分離與檢測(cè)。 兩相及兩相的相對(duì)運(yùn)兩相及兩相的相對(duì)運(yùn)動(dòng)構(gòu)成

5、了色譜法的基礎(chǔ)動(dòng)構(gòu)成了色譜法的基礎(chǔ)慢慢中等中等快快temporal course淋洗液淋洗液（三）分類（三）分類o1. 按兩相狀態(tài)分類按兩相狀態(tài)分類o2. 按分離機(jī)理分類按分離機(jī)理分類o3. 按固定相的外型分類按固定相的外型分類1. 按兩相狀態(tài)分類按兩相狀態(tài)分類o 氣體為流動(dòng)相的色譜稱氣體為流動(dòng)相的色譜稱為為氣相色譜（氣相色譜（gc） 根據(jù)固定相是固體吸根據(jù)固定相是固體吸附劑還是固定液（附著附劑還是固定液（附著在惰性載體上的一薄層在惰性載體上的一薄層有機(jī)化合物液體），又有機(jī)化合物液體），又可分可分:n氣固色譜（氣固色譜（gsc）n氣液色譜（氣液色譜（glc）1-載氣鋼瓶；2-減壓閥；3-凈化干

6、燥管；4-針形閥；5-流量計(jì);6-壓力表；7-進(jìn)樣器；8-色譜柱;9-熱導(dǎo)檢測(cè)器；10-放大器；11-溫度控制器；12-記錄儀；o 液體為流動(dòng)相的色譜稱液體為流動(dòng)相的色譜稱液相液相色譜（色譜（lc）n 液固色譜（lsc）n 液液色譜（llc）n 超臨界流體為流動(dòng)相的色譜為超臨界流體色譜（sfc）2. 按分離機(jī)理分類按分離機(jī)理分類o 利用組分在吸附劑（固定相）上的吸附能力強(qiáng)弱不利用組分在吸附劑（固定相）上的吸附能力強(qiáng)弱不同而得以分離的方法，稱為同而得以分離的方法，稱為吸附色譜法吸附色譜法（adsorption chromatography）。o 利用組分在固定液（固定相）中溶解度不同而達(dá)到利用組

7、分在固定液（固定相）中溶解度不同而達(dá)到分離的方法稱為分離的方法稱為分配色譜法分配色譜法(partition chromatography)。o 利用組分在離子交換劑（固定相）上的親和力大小利用組分在離子交換劑（固定相）上的親和力大小不同而達(dá)到分離的方法，稱為不同而達(dá)到分離的方法，稱為離子交換色譜法離子交換色譜法（ion exchange chromatography）。o 利用大小不同的分子在多孔固定相中的選擇滲透而利用大小不同的分子在多孔固定相中的選擇滲透而達(dá)到分離的方法，稱為達(dá)到分離的方法，稱為凝膠色譜法凝膠色譜法（gel chromatography）或或尺寸排阻色譜法尺寸排阻色譜法（

8、size exclusion chromatography）。o 利用不同組分與固定相（固定化分子）的高專屬性利用不同組分與固定相（固定化分子）的高專屬性親和力進(jìn)行分離的技術(shù)稱為親和力進(jìn)行分離的技術(shù)稱為親和色譜法親和色譜法(affinity chromatography) 。3. 按固定相的外型分類按固定相的外型分類o 固定相裝于柱內(nèi)的色譜法，稱為固定相裝于柱內(nèi)的色譜法，稱為柱色譜柱色譜(column chromatography) :n填充柱色譜填充柱色譜(packed column chromatography)n開管柱色譜開管柱色譜(open tubular column chromat

9、ography)o 固定相呈平板狀的色譜，稱為固定相呈平板狀的色譜，稱為平板色譜平板色譜(planar chromatography ):n薄層色譜薄層色譜(thin-layer chromatography)n紙色譜紙色譜(paper chromatography)4. 按照展開程序分類按照展開程序分類o洗脫法洗脫法(elution method)o頂替法頂替法(displacement method)o迎頭法迎頭法(frontal method)1）洗脫法）洗脫法(elution method)o 洗脫法洗脫法也稱沖洗法，淋洗法。也稱沖洗法，淋洗法。o 首先將樣品加到色譜柱頭上，首先將樣品

10、加到色譜柱頭上，然后用吸附或溶解能力比試然后用吸附或溶解能力比試樣組分弱得多的氣體或液體樣組分弱得多的氣體或液體作沖洗劑。作沖洗劑。o 由于各組分在固定相上的吸由于各組分在固定相上的吸附或溶解能力不同，被沖洗附或溶解能力不同，被沖洗劑帶出的先后次序也不同，劑帶出的先后次序也不同，從而使組分彼此分離。從而使組分彼此分離。ab洗脫法流出曲線n能使樣品的各組分獲得良好的分離，能使樣品的各組分獲得良好的分離，色譜峰清晰。此外，除去沖洗劑后，色譜峰清晰。此外，除去沖洗劑后，可獲得純度較高的物質(zhì)?？色@得純度較高的物質(zhì)。n色譜法中最常用的一種方法。色譜法中最常用的一種方法。2）頂替法）頂替法(displac

11、ement method)o 頂替法頂替法是將樣品加到色譜柱頭后，在惰性流是將樣品加到色譜柱頭后，在惰性流動(dòng)相中加入對(duì)固定相的吸附或溶解能力比所動(dòng)相中加入對(duì)固定相的吸附或溶解能力比所有試樣組分強(qiáng)的物質(zhì)為頂替劑（或直接用頂有試樣組分強(qiáng)的物質(zhì)為頂替劑（或直接用頂替劑作流動(dòng)相），通過色譜柱，將各組分按替劑作流動(dòng)相），通過色譜柱，將各組分按吸附或溶解能力的強(qiáng)弱順序，依次頂替出固吸附或溶解能力的強(qiáng)弱順序，依次頂替出固定相。定相。o 吸附或溶解能力最弱的組吸附或溶解能力最弱的組分最先流出，最強(qiáng)的最后分最先流出，最強(qiáng)的最后流出。流出。abn適于制備純物質(zhì)或濃縮分離某一組分；適于制備純物質(zhì)或濃縮分離某一組分；

12、n缺點(diǎn)缺點(diǎn)n經(jīng)一次使用后，柱子就被樣品或頂替劑飽和，經(jīng)一次使用后，柱子就被樣品或頂替劑飽和，必須更換柱子或除去被柱子吸附的物質(zhì)后，才必須更換柱子或除去被柱子吸附的物質(zhì)后，才能再使用。能再使用。頂替法流出曲線3）迎頭法）迎頭法(frontal method)o 該法在分離多組分混合該法在分離多組分混合物時(shí)，除第一組分外，物時(shí)，除第一組分外，其余均非純態(tài)。其余均非純態(tài)。o 僅適用于從含有微量雜僅適用于從含有微量雜質(zhì)的混合物中切割出一質(zhì)的混合物中切割出一個(gè)高純組分（組分個(gè)高純組分（組分a），），而不適用于對(duì)混合物進(jìn)而不適用于對(duì)混合物進(jìn)行分離。行分離。 aa+ bn迎頭法迎頭法是將試樣混合物連續(xù)通過色

13、譜柱，吸附是將試樣混合物連續(xù)通過色譜柱，吸附或溶解能力最弱的組分首先以純物質(zhì)的狀態(tài)流或溶解能力最弱的組分首先以純物質(zhì)的狀態(tài)流出，其次則以第一組分和吸附或溶解能力較弱出，其次則以第一組分和吸附或溶解能力較弱的第二組分混合物，以此類推。的第二組分混合物，以此類推。迎頭法流出曲線（四）色譜法的特點(diǎn)（四）色譜法的特點(diǎn)（1）分離效率高分離效率高 復(fù)雜混合物，有機(jī)同系物、異構(gòu)體。手性異構(gòu)體。復(fù)雜混合物，有機(jī)同系物、異構(gòu)體。手性異構(gòu)體。（2 2） 靈敏度高靈敏度高 可以檢測(cè)出可以檢測(cè)出g.gg.g-1-1(10(10-6-6) )級(jí)甚至級(jí)甚至ng.gng.g-1-1(10(10-9-9) )級(jí)的物質(zhì)量。級(jí)的

14、物質(zhì)量。（3） 分析速度分析速度快快 一般在幾分鐘或幾十分鐘內(nèi)可以完成一個(gè)試樣的分析。一般在幾分鐘或幾十分鐘內(nèi)可以完成一個(gè)試樣的分析。（4 4） 應(yīng)用范圍應(yīng)用范圍廣廣 氣相色譜：沸點(diǎn)低于氣相色譜：沸點(diǎn)低于300300的各種有機(jī)或無機(jī)試樣的分析。的各種有機(jī)或無機(jī)試樣的分析。 液相色譜：高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定、生物試樣的分離分析。液相色譜：高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定、生物試樣的分離分析。二、二、 色譜流出曲線及有關(guān)術(shù)語色譜流出曲線及有關(guān)術(shù)語（一）（一）色譜流出曲線色譜流出曲線(chromatogram)和和色譜峰色譜峰(peak) 由檢測(cè)器輸出的電信號(hào)強(qiáng)度對(duì)時(shí)間作圖，所得曲線稱由檢測(cè)器輸出的電信號(hào)強(qiáng)度對(duì)時(shí)間作圖，

15、所得曲線稱為為色譜流出曲線色譜流出曲線。曲線上突起部分就是。曲線上突起部分就是色譜峰色譜峰。 如果進(jìn)樣量很小，如果進(jìn)樣量很小，濃度很低，在吸附等濃度很低，在吸附等溫線（氣固吸附色譜）溫線（氣固吸附色譜）或分配等溫線（氣液或分配等溫線（氣液分配色譜）的線性范分配色譜）的線性范圍內(nèi)，則圍內(nèi)，則色譜峰是對(duì)色譜峰是對(duì)稱的稱的。（二）（二）基線基線(baseline) 在實(shí)驗(yàn)操作條件下，色譜柱后沒有樣品組分流出時(shí)的流在實(shí)驗(yàn)操作條件下，色譜柱后沒有樣品組分流出時(shí)的流出曲線稱為基線，穩(wěn)定的基線應(yīng)該是一條水平直線。出曲線稱為基線，穩(wěn)定的基線應(yīng)該是一條水平直線。n基線漂移基線漂移(baseline drift)

16、: 指基線隨時(shí)間定向的緩慢變化。指基線隨時(shí)間定向的緩慢變化。n基線噪聲基線噪聲(baseline noise): 指由各種因素所引起的基線起伏。指由各種因素所引起的基線起伏。（三）（三）峰高峰高(peak height) 色譜峰頂點(diǎn)與基線之間的垂直距離，以（色譜峰頂點(diǎn)與基線之間的垂直距離，以（h）表示。）表示。（四）（四）保留值保留值(retention value)1. 死時(shí)間死時(shí)間(dead time)tm 不被固定相吸附或溶解的物質(zhì)進(jìn)入色譜柱時(shí)，從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰極大值所需的時(shí)間稱為死時(shí)間死時(shí)間，它正比于色譜柱的空隙體積。信號(hào)進(jìn)樣tmn因?yàn)檫@種物質(zhì)不被固定相吸附或溶解，故其流動(dòng)速度將與流動(dòng)相

17、流動(dòng)速度相近。n測(cè)定流動(dòng)相平均線速時(shí)，可用柱長l與tm的比值計(jì)算，即 = l/tm2. 保留時(shí)間保留時(shí)間(retention time) tr 試樣從進(jìn)樣到柱后出現(xiàn)峰極大點(diǎn)時(shí)所經(jīng)過的時(shí)間，稱為保留時(shí)間。信號(hào)進(jìn)樣tr3. 調(diào)整保留時(shí)間調(diào)整保留時(shí)間(adjusted retention time) tr o 某組分的保留時(shí)間扣除死時(shí)間后，稱為該組分的調(diào)整保留調(diào)整保留時(shí)間時(shí)間，即 tr= tr tm o 由于組分在色譜柱中的保留時(shí)間tr包含了組分隨流動(dòng)相通過柱子所需的時(shí)間和組分在固定相中滯留所需的時(shí)間，所以tr實(shí)際上是組分在固定相中保留的總時(shí)間。保留時(shí)間是色譜法定性的基本依據(jù)，但同一組分的保留時(shí)間常

18、受到流動(dòng)相流速的影響，因此色譜工作者有時(shí)用保留體積來表示保留值。4. 死體積死體積(dead volume) vm 指色譜柱在填充后，柱管內(nèi)固定相顆粒間所剩留的空間、色譜儀中管路和連接頭間的空間以及檢測(cè)器的空間的總和。當(dāng)后兩相很小可忽略不計(jì)時(shí)，死體積可由死時(shí)間與色譜柱出口的載氣流速fo（cm3min-1）計(jì)算。 vm = tmfo5. 保留體積保留體積(retention volume) vr 指從進(jìn)樣開始到被測(cè)組分在柱后出現(xiàn)濃度極大點(diǎn)時(shí)所通過的流動(dòng)相的體積。保留時(shí)間與保留體積關(guān)系： vr= tr fo6. 調(diào)整保留體積調(diào)整保留體積(adjusted retention volume) vr

19、某組分的保留體積扣除死體積后，稱為該組分的調(diào)整保留體積。 vr = vr vm = tr fo 7. 7. 相對(duì)保留值相對(duì)保留值r21 組分組分2與組分與組分1調(diào)整保留值之比：調(diào)整保留值之比： r21 = t r2 / t r1= v r2 / v r1 相對(duì)保留值只與柱溫相對(duì)保留值只與柱溫和固定相性質(zhì)有關(guān)，與其和固定相性質(zhì)有關(guān)，與其他色譜操作條件無關(guān)，它他色譜操作條件無關(guān)，它表示了固定相對(duì)這兩種組表示了固定相對(duì)這兩種組分的選擇性。分的選擇性。(五五) 區(qū)域?qū)挾葏^(qū)域?qū)挾?peak width) 色譜峰的區(qū)域?qū)挾仁巧V流出曲線的重要參數(shù)之一，用于衡量柱效率及反映色譜操作條件的動(dòng)力學(xué)因素。表示色譜

20、峰區(qū)域?qū)挾韧ǔＳ腥N方法。1. 標(biāo)準(zhǔn)偏差標(biāo)準(zhǔn)偏差(standard deviation) 即0.607倍峰高處色譜峰寬的一半。2.半峰寬半峰寬(peak width at half-height)y1/2 即峰高一半處對(duì)應(yīng)的峰寬。它與標(biāo)準(zhǔn)偏差的關(guān)系為 y1/2=2.3543. 峰底寬度峰底寬度(peak width at peak base) w 即色譜峰兩側(cè)拐點(diǎn)上的切線在基線上截距間的距離。 w = 4 從色譜流出曲線中，可得許多重要信息從色譜流出曲線中，可得許多重要信息(i) 根據(jù)色譜峰的個(gè)數(shù)，可以判斷樣品中所含組分的最少個(gè)根據(jù)色譜峰的個(gè)數(shù)，可以判斷樣品中所含組分的最少個(gè)數(shù)；數(shù)；(ii)

21、根據(jù)色譜峰的保留值，可以進(jìn)行定性分析；根據(jù)色譜峰的保留值，可以進(jìn)行定性分析；(iii) 根據(jù)色譜峰的面積或峰高，可以進(jìn)行定量分析；根據(jù)色譜峰的面積或峰高，可以進(jìn)行定量分析；(iv) 色譜峰的保留值及其區(qū)域?qū)挾?，是評(píng)價(jià)色譜柱分離效色譜峰的保留值及其區(qū)域?qū)挾龋窃u(píng)價(jià)色譜柱分離效能的依據(jù)；能的依據(jù)；(v) 色譜峰兩峰間的距離，是評(píng)價(jià)固定相（或流動(dòng)相）選色譜峰兩峰間的距離，是評(píng)價(jià)固定相（或流動(dòng)相）選擇是否合適的依據(jù)擇是否合適的依據(jù)。三、三、色譜法基本原理色譜法基本原理o 色譜分析的目的是將樣品中各組分彼此分離，組分色譜分析的目的是將樣品中各組分彼此分離，組分要達(dá)到完全分離，兩峰間的距離必須足夠遠(yuǎn)，要達(dá)

22、到完全分離，兩峰間的距離必須足夠遠(yuǎn)，兩峰兩峰間的距離是由組分在兩相間的分配系數(shù)決定的間的距離是由組分在兩相間的分配系數(shù)決定的，即，即與色譜過程的與色譜過程的熱力學(xué)性質(zhì)熱力學(xué)性質(zhì)有關(guān)。有關(guān)。o 但是兩峰間雖有一定距離，如果每個(gè)峰都很寬，以但是兩峰間雖有一定距離，如果每個(gè)峰都很寬，以致彼此重疊，還是不能分開。這些峰的寬或窄是由致彼此重疊，還是不能分開。這些峰的寬或窄是由組分在色譜柱中傳質(zhì)和擴(kuò)散行為決定的，即與色譜組分在色譜柱中傳質(zhì)和擴(kuò)散行為決定的，即與色譜過程的過程的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)動(dòng)力學(xué)性質(zhì)有關(guān)。有關(guān)。o 因此，要從熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)兩方面來研究色譜行為。因此，要從熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)兩方面來研究色譜行為。（一

23、）（一）分配系數(shù)分配系數(shù)k和分配比和分配比k1. 分配系數(shù)分配系數(shù)(partition coefficient) ko 分配色譜的分離是基于樣品組分在固定相和流動(dòng)相之間分配色譜的分離是基于樣品組分在固定相和流動(dòng)相之間反復(fù)多次的分配過程，而吸附色譜的分離是基于反復(fù)多反復(fù)多次的分配過程，而吸附色譜的分離是基于反復(fù)多次的吸附次的吸附-脫附過程。脫附過程。o 這種分離過程經(jīng)常用樣品分子在兩相間的分配來描述，這種分離過程經(jīng)常用樣品分子在兩相間的分配來描述，而描述這種分配的參數(shù)稱為分配系數(shù)而描述這種分配的參數(shù)稱為分配系數(shù)k。o 分配系數(shù)分配系數(shù)k是指在一定溫度和壓力下，組分在固定相和是指在一定溫度和壓力下

24、，組分在固定相和流動(dòng)相之間分配達(dá)平衡時(shí)的濃度之比值，流動(dòng)相之間分配達(dá)平衡時(shí)的濃度之比值，即即 k=溶質(zhì)在固定相中的濃度溶質(zhì)在固定相中的濃度 / 溶質(zhì)在流動(dòng)相中的濃度溶質(zhì)在流動(dòng)相中的濃度 = cs / cm分配系數(shù)分配系數(shù) k 的討論的討論 一定溫度下，組分的分配系數(shù)一定溫度下，組分的分配系數(shù)k越大，出峰越慢；越大，出峰越慢；試樣一定時(shí)，試樣一定時(shí)，k主要取決于固定相性質(zhì)；主要取決于固定相性質(zhì)；每個(gè)組份在各種固定相上的分配系數(shù)每個(gè)組份在各種固定相上的分配系數(shù)k不同；不同；選擇適宜的固定相可改善分離效果；選擇適宜的固定相可改善分離效果；試樣中的各組分具有不同的試樣中的各組分具有不同的k值是分離的基

25、礎(chǔ)；值是分離的基礎(chǔ)；某組分的某組分的k = 0時(shí)，即不被固定相保留，最先流出。時(shí)，即不被固定相保留，最先流出。 組分在流動(dòng)相中的濃度組分在流動(dòng)相中的濃度組分在固定相中的濃度組分在固定相中的濃度 k分配系數(shù)是色譜分離的依據(jù)。分配系數(shù)是色譜分離的依據(jù)。o 分配系數(shù)分配系數(shù)是由組分和固定相的熱力學(xué)性質(zhì)決定的，它是每一個(gè)溶質(zhì)的特征值。o 分配系數(shù)分配系數(shù)與兩個(gè)變量有關(guān)：固定相和溫度。o 分配系數(shù)分配系數(shù)與兩相體積、柱管的特性以及所使用的儀器無關(guān)。2.分配比分配比 (partition ratio)k 分配比又稱容量因子容量因子，它是指在一定溫度和壓力下，組分在兩相間分配達(dá)平衡時(shí)，分配在固定相和流動(dòng)相中

26、的質(zhì)量比質(zhì)量比。即 k = 組分在固定相中的質(zhì)量 / 組分在流動(dòng)相中的質(zhì)量 = ms / mmo k值越大，說明組分在固定相中的量越多，相當(dāng)于柱的容量大，因此又稱分配容量分配容量或容量因子容量因子。n它是衡量色譜柱對(duì)被分離組分保留能力的重要參數(shù)數(shù)值越大，數(shù)值越大，該組分的保留時(shí)間越長該組分的保留時(shí)間越長。nk值也決定于組分及固定相熱力學(xué)性質(zhì)。它不僅隨柱溫、柱壓變化而變化，而且還與流動(dòng)相及固定相的體積有關(guān)。k = ms / mm =csvs / cmvm式中o cs,cm分別為組分在固定相和流動(dòng)相的濃度；o vm為柱中流動(dòng)相的體積，近似等于死體積。o vs為柱中固定相的體積，在各種不同的類型的色

27、譜中有不同的含義。分配比可以由實(shí)驗(yàn)測(cè)得分配比可以由實(shí)驗(yàn)測(cè)得3. 分配系數(shù)分配系數(shù)k與分配比與分配比 k 的關(guān)系的關(guān)系 其中稱為相比率稱為相比率(phase ratio)，它是反映各種色譜柱柱型特點(diǎn)的又一個(gè)參數(shù)。 例如，對(duì)填充柱，其值一般為635；對(duì)毛細(xì)管柱，其值為60600。kvvkvmvmccksmmmssms/4. 分配比與保留時(shí)間的關(guān)系分配比與保留時(shí)間的關(guān)系 滯留因子（滯留因子（retardation factor）：）：uurss us：組分在分離柱內(nèi)的線速度；：組分在分離柱內(nèi)的線速度；u：流動(dòng)相在分離柱內(nèi)的線：流動(dòng)相在分離柱內(nèi)的線速度；速度；滯留因子滯留因子rs也可以用質(zhì)量分?jǐn)?shù)也可以

28、用質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示：表示：kmmmmmrs 1111msmss 若組分和流動(dòng)相通過長度為若組分和流動(dòng)相通過長度為l的分離柱，需要的時(shí)間分的分離柱，需要的時(shí)間分別為別為tr和和tm，則：，則：ultult msr;由以上各式，可得：由以上各式，可得： tr = tm(1+k)mrmmrtttttk 塔板理論的假設(shè)：塔板理論的假設(shè)： (1) 在每一個(gè)平衡過程間隔內(nèi)，平衡可以迅在每一個(gè)平衡過程間隔內(nèi)，平衡可以迅速達(dá)到；速達(dá)到； (2) (2) 將載氣看作成脈動(dòng)（間歇）過程；將載氣看作成脈動(dòng)（間歇）過程； (3) (3) 試樣沿色譜柱方向的擴(kuò)散可忽略；試樣沿色譜柱方向的擴(kuò)散可忽略； (4) (4) 每次分

29、配的分配系數(shù)相同。每次分配的分配系數(shù)相同。（二）、塔板理論二）、塔板理論- -柱分離效能指標(biāo)柱分離效能指標(biāo) 1.1.塔板理論塔板理論（plate theory）半經(jīng)驗(yàn)理論；半經(jīng)驗(yàn)理論； 將色譜分離過程比擬作蒸餾過程，將連續(xù)將色譜分離過程比擬作蒸餾過程，將連續(xù)的色譜分離過程分割成多次的平衡過程的重復(fù)的色譜分離過程分割成多次的平衡過程的重復(fù) （類似于蒸餾塔塔板上的平衡過程）；（類似于蒸餾塔塔板上的平衡過程）；塔板理論假設(shè)：塔板理論假設(shè)：1. 在柱內(nèi)一小段長度在柱內(nèi)一小段長度h內(nèi)，組分可以在兩相間迅速達(dá)到平衡。內(nèi)，組分可以在兩相間迅速達(dá)到平衡。這一小段柱長稱為這一小段柱長稱為理論塔板高度理論塔板高度

30、h。2. 以氣相色譜為例，載氣進(jìn)入色譜柱不是連續(xù)進(jìn)行的，而是以氣相色譜為例，載氣進(jìn)入色譜柱不是連續(xù)進(jìn)行的，而是脈動(dòng)式，每次進(jìn)氣為一個(gè)塔板體積（脈動(dòng)式，每次進(jìn)氣為一個(gè)塔板體積（vm）。）。3. 所有組分開始時(shí)存在于第所有組分開始時(shí)存在于第0號(hào)塔板上，而且試樣沿軸（縱）號(hào)塔板上，而且試樣沿軸（縱）向擴(kuò)散可忽略。向擴(kuò)散可忽略。4. 分配系數(shù)分配系數(shù)在所有塔板上是在所有塔板上是常數(shù)常數(shù)，與組分在某一塔板上的量，與組分在某一塔板上的量無關(guān)。無關(guān)。o 簡單地認(rèn)為：在每一塊塔板上，溶質(zhì)在兩相間很快簡單地認(rèn)為：在每一塊塔板上，溶質(zhì)在兩相間很快達(dá)到分配平衡，然后隨著流動(dòng)相按一個(gè)一個(gè)塔板的達(dá)到分配平衡，然后隨著流

31、動(dòng)相按一個(gè)一個(gè)塔板的方式向前移動(dòng)。方式向前移動(dòng)。o 對(duì)于一根長為對(duì)于一根長為l的色譜柱，溶質(zhì)平衡的次數(shù)應(yīng)為：的色譜柱，溶質(zhì)平衡的次數(shù)應(yīng)為： n = l / h n稱為稱為理論塔板數(shù)理論塔板數(shù)。o 與精餾塔一樣，色譜柱的柱效隨理論塔板數(shù)與精餾塔一樣，色譜柱的柱效隨理論塔板數(shù)n的增的增加而增加，隨板高加而增加，隨板高h(yuǎn)的增大而減小。的增大而減小。塔板理論塔板理論 10.50.50.250.250.250.250.50.50.250.250.250.25 v=0 v=1 v=2 v=2 v=2 v=2 v=3 v=3 v=3流動(dòng)相流動(dòng)相固定相固定相流動(dòng)相流動(dòng)相+組分組分分配平衡分配平衡r=1r=2r

32、=3r=n設(shè)色譜柱n=5，某組分的分配比k=1，進(jìn)樣量m=1mg塔板理論指出：塔板理論指出：o 第一，第一，當(dāng)溶質(zhì)在柱中的平衡次數(shù)，即理論塔板數(shù)理論塔板數(shù)n大于50時(shí)，可得到基本對(duì)稱的峰形曲線。n在色譜柱中，n值一般很大，如氣相色譜柱的n約為103 106，因而這時(shí)的流出曲線可趨近于正態(tài)分布曲線。222)(02rttecc式中：c0為進(jìn)樣濃度，tr為保留時(shí)間，為標(biāo)準(zhǔn)偏差，c為時(shí)間t時(shí)在柱出口的濃度流出曲線方程式o 第二第二，當(dāng)樣品進(jìn)入色譜柱后，當(dāng)樣品進(jìn)入色譜柱后，只要各組分在兩相只要各組分在兩相間的分配系數(shù)有微小差異間的分配系數(shù)有微小差異，經(jīng)過反復(fù)多次的分配，經(jīng)過反復(fù)多次的分配平衡后，仍可獲得

33、良好的分離。平衡后，仍可獲得良好的分離。o 第三第三，n與半峰寬及峰底寬的關(guān)系式為：與半峰寬及峰底寬的關(guān)系式為： n = 5.54(tr/ w1/2)2 = 16 (tr / w)2 n式中式中tr 與與w1/2 ( w )應(yīng)采用同一單位（時(shí)間或距離）。應(yīng)采用同一單位（時(shí)間或距離）。n從公式可以看出，在從公式可以看出，在tr 一定時(shí)，如果色譜峰很窄，則一定時(shí)，如果色譜峰很窄，則說明說明n越大，越大，h越小，柱效能越高越小，柱效能越高。 在實(shí)際工作中，由公式在實(shí)際工作中，由公式 n = l / h 和和 n = 5.54(tr / w1/2)2 = 16 (tr / w)2 計(jì)算出來的的計(jì)算出來

34、的的n和和h值有時(shí)并不能充分地反映色譜柱的分離值有時(shí)并不能充分地反映色譜柱的分離效能，因?yàn)椴捎眯?，因?yàn)椴捎胻r計(jì)算時(shí)，沒有扣除死時(shí)間計(jì)算時(shí)，沒有扣除死時(shí)間tm， 所以常用所以常用有效塔板數(shù)有效塔板數(shù)n有效有效表示柱效：表示柱效： n有效有效= 5.54(tr / w1/2)2 = 16 ( tr / w)2 有效板高有效板高 ： h有效有效 = l / n有效有效例題 已知某組分峰的峰底寬為40 s，保留時(shí)間為400 s ，計(jì)算此色譜柱的理論塔板數(shù)。 解： n = 16 ( tr / w)2 = 16 （400 / 40）2 = 1600 塊 o 成功之處：成功之處：n 塔板理論是一種半經(jīng)驗(yàn)

35、性理論。它用熱力學(xué)的觀塔板理論是一種半經(jīng)驗(yàn)性理論。它用熱力學(xué)的觀點(diǎn)定量說明了溶質(zhì)在色譜柱中移動(dòng)的速率，解釋點(diǎn)定量說明了溶質(zhì)在色譜柱中移動(dòng)的速率，解釋了流出曲線的形狀，并提出了計(jì)算和評(píng)價(jià)柱效高了流出曲線的形狀，并提出了計(jì)算和評(píng)價(jià)柱效高低的參數(shù)。低的參數(shù)。o 不足：不足：n 色譜過程不僅受熱力學(xué)因素的影響，而且還與分色譜過程不僅受熱力學(xué)因素的影響，而且還與分子的擴(kuò)散、傳質(zhì)等動(dòng)力學(xué)因素有關(guān)，因此塔板理子的擴(kuò)散、傳質(zhì)等動(dòng)力學(xué)因素有關(guān)，因此塔板理論只能定性地給出板高的概念，卻不能解釋板高論只能定性地給出板高的概念，卻不能解釋板高受哪些因素影響；也不能說明為什么在不同的流受哪些因素影響；也不能說明為什么在

36、不同的流速下，可以測(cè)得不同的理論塔板數(shù)，因而限制了速下，可以測(cè)得不同的理論塔板數(shù)，因而限制了它的應(yīng)用。它的應(yīng)用。（三）速率理論（三）速率理論(rate theory) 1956年荷蘭學(xué)者van deemter（范第姆特）等在研究氣液色譜時(shí)，提出了色譜過程動(dòng)力學(xué)理論速率理論。 他們吸收了塔板理論中板高的概念，并充分考慮了組分在兩相間的擴(kuò)散和傳質(zhì)過程，從而在動(dòng)力學(xué)基礎(chǔ)上較好地解釋了影響板高的各種因素。 該理論模型對(duì)氣相、液相色譜都適用。 van deemter方程的數(shù)學(xué)簡化式為 h = a + b / u + c u 式中u為流動(dòng)相的線速度；a、b、c、為常數(shù)，分別代表渦流擴(kuò)散系數(shù)渦流擴(kuò)散系數(shù)、分

37、子擴(kuò)散項(xiàng)系數(shù)分子擴(kuò)散項(xiàng)系數(shù)、傳質(zhì)阻力項(xiàng)系數(shù)傳質(zhì)阻力項(xiàng)系數(shù)。1. 渦流擴(kuò)散項(xiàng)渦流擴(kuò)散項(xiàng) a 在填充色譜柱中，當(dāng)組分隨流動(dòng)相向柱出口遷移時(shí)，流動(dòng)相由于受到固定相顆粒障礙，不斷改變流動(dòng)方向，使組分分子在前進(jìn)中形成紊亂的類似渦流的流動(dòng)，故稱渦流擴(kuò)散渦流擴(kuò)散。o 由于填充物顆粒大小的不同及填充物的不均勻性，使組分在色譜柱中路徑長短不一，因而同時(shí)進(jìn)色譜柱的相同組分到達(dá)柱口時(shí)間并不一致，引起了色譜峰的變寬。n色譜峰變寬的程度由下式?jīng)Q定： a = 2dp 上式表明，a與填充物的平均直徑平均直徑dp的大小和填充不規(guī)則因子填充不規(guī)則因子有關(guān)，與流動(dòng)相的性質(zhì)、線速度和組分性質(zhì)無關(guān)。 為了減少渦流擴(kuò)散，提高柱效，使用

38、細(xì)而均勻的顆粒，并且填充均勻是十分必要的。對(duì)于空心毛細(xì)管，不存在渦流擴(kuò)散。因此 a = 0。2. 2. 分子擴(kuò)散項(xiàng)分子擴(kuò)散項(xiàng) b / u b / u （縱向擴(kuò)散項(xiàng)）（縱向擴(kuò)散項(xiàng)）o 縱向分子擴(kuò)散是由濃度梯度造成的。組分從柱入口加縱向分子擴(kuò)散是由濃度梯度造成的。組分從柱入口加入，其濃度分布的構(gòu)型呈入，其濃度分布的構(gòu)型呈“塞子塞子”狀。它隨著流動(dòng)相狀。它隨著流動(dòng)相向前推進(jìn)，由于存在濃度梯度，向前推進(jìn)，由于存在濃度梯度，“塞子塞子”必然自發(fā)的必然自發(fā)的向前和向后擴(kuò)散，向前和向后擴(kuò)散，造成譜帶展寬造成譜帶展寬。o 分子擴(kuò)散項(xiàng)系數(shù)為分子擴(kuò)散項(xiàng)系數(shù)為 b = 2b = 2 d dg g 是填充柱內(nèi)流動(dòng)相擴(kuò)

39、散路徑彎曲的因素，也稱彎曲因子，它反映了固定相顆粒的幾何形狀對(duì)自由分子擴(kuò)散的阻礙情況。 d dg g為組分在流動(dòng)相中擴(kuò)散系數(shù)擴(kuò)散系數(shù)（cm3s-1）,分子擴(kuò)散項(xiàng)與組分在流動(dòng)相中擴(kuò)散系數(shù)擴(kuò)散系數(shù)dg成正比. dg與流動(dòng)相及組分性質(zhì)有關(guān)： (a) 相對(duì)分子質(zhì)量大的組分dg小，dg反比于流動(dòng)相相對(duì)分子質(zhì)量的平方根，所以采用相對(duì)分子質(zhì)量較大的流動(dòng)相，可使b項(xiàng)降低； (b) dg隨柱溫增高而增加，但反比于柱壓。 另外縱向擴(kuò)散與組分在色譜柱內(nèi)停留時(shí)間有關(guān)，流動(dòng)相流速小，組分停留時(shí)間長，縱向擴(kuò)散就大。因此為降低縱向擴(kuò)散影響，要加大流動(dòng)相速度。對(duì)于液相色譜，組分在流動(dòng)相中縱向擴(kuò)散可以忽略。3. 傳質(zhì)阻力項(xiàng)傳質(zhì)

40、阻力項(xiàng) c cu u 由于氣相色譜以氣體為流動(dòng)相，液相色譜以液體為流動(dòng)相，它們的傳質(zhì)過程不完全相同。（1）氣液色譜 傳質(zhì)阻力系數(shù)c包括氣相傳質(zhì)阻力系數(shù)cg和液相傳質(zhì)阻力系數(shù)c1兩項(xiàng)，即 c = cg+ c1 氣相傳質(zhì)過程氣相傳質(zhì)過程是指試樣組分從氣相移動(dòng)到固定相表面的過程。這一過程中試樣組分將在兩相間進(jìn)行質(zhì)量交換，即進(jìn)行濃度分配。有的分子還來不及進(jìn)入兩相界面，就被氣相帶走；有的則進(jìn)入兩相界面又來不及返回氣相。這樣使得試樣在兩相界面上不能瞬間達(dá)到分配平衡，引起滯后現(xiàn)象，從而使色譜峰變寬。對(duì)于填充柱，氣相傳質(zhì)阻力系數(shù)cg為： cg= 0.01k2 / (1 + k)2 dp / dg 式中k為容量

41、因子。由上式看出，氣相傳質(zhì)阻力與填充物粒度dp的平方成正比，與組分在載氣流中的擴(kuò)散系數(shù)dg成反比。因此，采用粒度小的填充物和相對(duì)分子質(zhì)量小的氣體（如氫氣）做載氣，可使cg減小，提高柱效。 液相傳質(zhì)過程液相傳質(zhì)過程是指試樣組分從固定相的氣/液界面移動(dòng)到液相內(nèi)部，并發(fā)生質(zhì)量交換，達(dá)到分配平衡，然后又返回氣/液界面的傳質(zhì)過程。這個(gè)過程也需要一定的時(shí)間，此時(shí)，氣相中組分的其它分子仍隨載氣不斷向柱口運(yùn)動(dòng)，于是造成峰形擴(kuò)張。液相傳質(zhì)阻力系數(shù) c1為： c1 = 2 / 3 k / (1 + k)2 df2 / dl 由上式看出，固定相的液膜厚度df薄，組分在液相的擴(kuò)散系數(shù)d1大，則液相傳質(zhì)阻力就小。降低固

42、定液的含量，可以降低液膜厚度，但k值隨之變小，又會(huì)使c1增大。當(dāng)固定液含量一定時(shí)，液膜厚度隨載體的比表面積增加而降低，因此，一般采用比表面積較大的載體來降低液膜厚度。但比表面太大，由于吸附造成拖尾峰，也不利于分離。雖然提高柱溫可增大d1，但會(huì)使k值減小，為了保持適當(dāng)?shù)腸1值，應(yīng)控制適宜的柱溫。（ van deemter的氣相色譜板高方程展開式）(2) 液液分配色譜液液分配色譜 傳質(zhì)阻力系數(shù)（c）包含流動(dòng)相傳質(zhì)阻力系數(shù)（cm）和固定相傳質(zhì)阻力系數(shù)（cs），即 c = cm + cs其中cm又包含流動(dòng)的流動(dòng)相中的傳質(zhì)阻力和滯留的流動(dòng)相中的傳質(zhì)阻力，即： cm = mdp2 / dm + smdp2

43、 / dm式中右邊第一項(xiàng)為流動(dòng)的流動(dòng)相中的傳質(zhì)阻力。當(dāng)流動(dòng)相流過色譜柱內(nèi)的填充物時(shí)，靠近填充物顆粒的流動(dòng)相流速比在流路中間的稍慢一些，故柱內(nèi)流動(dòng)相的流速是不均勻的。 這種傳質(zhì)阻力對(duì)板高的影響與固定相粒度dp 的平方成正比，與試樣分子在流動(dòng)相中的擴(kuò)散系數(shù)dm成反比，m是由柱和填充的性質(zhì)決定的因子。 右邊第二項(xiàng)為滯留的流動(dòng)相中的傳質(zhì)阻力。這是由于固定相的多孔性，會(huì)造成某部分流動(dòng)相滯留在一個(gè)局部，滯留在固定相微孔內(nèi)的流動(dòng)相一般是停滯不動(dòng)的流動(dòng)相中的試樣分子要與固定相進(jìn)行質(zhì)量交換，必須首先擴(kuò)散到滯留區(qū)。如果固定相的微孔既小又深，傳質(zhì)速率就慢，對(duì)峰的擴(kuò)展影響就大（如教材p.302圖15.6所示）。式中m

44、是一常數(shù)，它與顆粒微孔中被流動(dòng)相所占據(jù)部分的分?jǐn)?shù)及容量因子有關(guān)。 顯然，固定相的粒度愈小，微孔孔徑愈大，傳質(zhì)速率就愈快，柱效就高。對(duì)高效液相色譜固定相的設(shè)計(jì)就是基于這一考慮。液液色譜中固定相傳質(zhì)阻力系數(shù)（cs）可用下式表示： cs= sdf2 / ds 公式說明試樣分子從流動(dòng)相進(jìn)入固定液內(nèi)進(jìn)行質(zhì)量交換的傳質(zhì)過程與液膜厚度df平方成正比，與試樣分子在固定液的擴(kuò)散系數(shù)ds成反比。式中s是與容量因子k有關(guān)的系數(shù)。（ van deemter的液相色譜板高方程展開式 ） 氣相色譜速率方程和液相色譜速率方程的形式基本一致，主要區(qū)別在液液色譜中縱向擴(kuò)散項(xiàng)可忽略不計(jì),影響柱效的主要因素是傳質(zhì)阻力項(xiàng)。4. 流動(dòng)

45、相線速度對(duì)板高的影響流動(dòng)相線速度對(duì)板高的影響（1） lc和和gc的的h-u圖圖 根據(jù)van deemter公式作lc和gc的h-u圖，lc和gc的h-u圖十分相似，對(duì)應(yīng)某一流速都有一個(gè)板高的極小值，這個(gè)極小值就是柱效最高點(diǎn)；lc板高極小值比gc的極小值小一個(gè)數(shù)量級(jí)以上，說明液相色譜的柱效比氣相色譜高得多；lc的板高最低點(diǎn)相應(yīng)流速比起gc的流速亦小一個(gè)數(shù)量級(jí)，說明對(duì)于lc，為了取得良好的柱效，流速不一定要很高。(2) 分子擴(kuò)散項(xiàng)和傳質(zhì)阻力項(xiàng)對(duì)板高的貢獻(xiàn)分子擴(kuò)散項(xiàng)和傳質(zhì)阻力項(xiàng)對(duì)板高的貢獻(xiàn) 較低線速時(shí)，分子擴(kuò)散項(xiàng)起主要作用；較高 線速時(shí)，傳質(zhì)阻力項(xiàng)起主要作用；其中流動(dòng)相傳質(zhì)阻力項(xiàng)對(duì)板高的貢獻(xiàn)幾乎是一

46、個(gè)定值。在高線速度時(shí)，固定相傳質(zhì)阻力項(xiàng)成為影響板高的主要因素，隨著速度增高，板高值越來越大，柱效急劇下降。5. 固定相粒度大小對(duì)板高的影響固定相粒度大小對(duì)板高的影響 粒度越細(xì)，板高越小，并且受線速度影響亦小。 這就是為什么在hplc中采用細(xì)顆粒作固定相的根據(jù)。當(dāng)然，固定相顆粒愈細(xì)，柱流速愈慢。只有采取高壓技術(shù)，流動(dòng)相流速才能符合實(shí)驗(yàn)要求。四、分離度 分離度r是一個(gè)綜合性指標(biāo)。 分離度是既能反映柱效率又能反映選擇性的指標(biāo)分離度是既能反映柱效率又能反映選擇性的指標(biāo)，稱總分離效能指標(biāo)。分離度又叫分辨率，它定義為相鄰兩組分色譜峰保留值之它定義為相鄰兩組分色譜峰保留值之差與兩組分色譜峰底寬總和之半的比值

47、，差與兩組分色譜峰底寬總和之半的比值，即 r = 2 (tr2 - tr1) / (w1 +w2) r值越大，表明相鄰兩組分分離越好。一般說，當(dāng)r10時(shí)，隨容量因子增大，分離度的增長是微乎其微的。一般取k為210最宜。對(duì)于gc，通過提高溫度，可選擇合適的k值，以改進(jìn)分離度。而對(duì)于lc，只要改變流動(dòng)相的組成，就能有效地控制k值。它對(duì)lc的分離能起到立竿見影的效果。r/q或tr / q 5.010.015.0r trk4. 分離度與分析時(shí)間的關(guān)系分離度與分析時(shí)間的關(guān)系 由上圖 tr /q對(duì)k的曲線可見，當(dāng)k在2 5時(shí)，可在較短的分析時(shí)間，取得良好的分離度。 分析時(shí)間與分離度及其他因素的關(guān)系六、六、

48、 色譜定性和定量分析色譜定性和定量分析o （一（一 ）、色譜的定性分析）、色譜的定性分析n色譜定性分析就是要確定各色譜峰所代表的化合物。由于各種物質(zhì)在一定的色譜條件下均有確定的保留值，因此保留值可作為一種定性指標(biāo)。n目前各種色譜定性方法都是基于保留值的目前各種色譜定性方法都是基于保留值的。但是不同物質(zhì)在同一色譜條件下，可能具有相似或相同的保留值，即保即保留值并非專屬的留值并非專屬的。n因此僅根據(jù)保留值對(duì)一個(gè)完全未知的樣品定性是困難的。如果在了解樣品的來源、性質(zhì)、分析目的的基礎(chǔ)上，對(duì)樣品組成作初步的判斷，再結(jié)合下列的方法則可確定色譜峰所代表的化合物。1. 利用純物質(zhì)對(duì)照定性利用純物質(zhì)對(duì)照定性 在

49、一定的色譜條件下，一個(gè)未知物只有一個(gè)確定的保留時(shí)間。因此將已知純物質(zhì)在相同的色譜條件下的保留時(shí)間與未知物的保留時(shí)間進(jìn)行比較，就可以定性鑒定未知物。若二者相同，則未知物可能是已知的純物質(zhì)；不同，則未知物就不是該純物質(zhì)。 純物質(zhì)對(duì)照法定性只適用于組分性質(zhì)已有所了解，組成比較簡單，且有純物質(zhì)的未知物。2. 相對(duì)保留值法相對(duì)保留值法 相對(duì)保留值is 是指組分i與基準(zhǔn)物質(zhì)s調(diào)整保留值的比值 is = tri / trs= vri / vrs 它僅隨固定液及柱溫變化而變化，與其它操作條件無關(guān)。 相對(duì)保留值測(cè)定方法：在某一固定相及柱溫下，分別測(cè)出組分i和基準(zhǔn)物質(zhì)s的調(diào)整保留值，再按上式計(jì)算即可。 用已求出的

50、相對(duì)保留值與文獻(xiàn)相應(yīng)值比較即可定性。 通常選容易得到純品的，而且與被分析組分相近的物質(zhì)作基準(zhǔn)物質(zhì)，如正丁烷、環(huán)己烷、正戊烷、苯、對(duì)二甲苯、環(huán)己醇、環(huán)己酮等。3. 加入已知物增加峰高法加入已知物增加峰高法 當(dāng)未知樣品中組分較多，所得色譜峰過密，用上述方法不易辨認(rèn)時(shí)，或僅作未知樣品指定項(xiàng)目分析時(shí)均可用此法。首先作出未知樣品的色譜圖，然后在未知樣品加入某已知物，又得到一個(gè)色譜圖。峰高增加的組分即可能為這種已知物。 4. 保留指數(shù)定性法保留指數(shù)定性法 保留指數(shù)又稱為柯瓦（kovts）指數(shù)，它表示物質(zhì)在固定液上的保留行為，是目前使用最廣泛并被國際上公認(rèn)的定性指標(biāo)。它具有重現(xiàn)性好、標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一及溫度系數(shù)小等優(yōu)

51、點(diǎn)。 保留指數(shù)也是一種相對(duì)保留值，它是把正構(gòu)烷烴中某兩個(gè)組分的調(diào)整保留值的對(duì)數(shù)作為相對(duì)的尺度，并假定正構(gòu)烷烴的保留指數(shù)為n100。被測(cè)物的保留指數(shù)值可用內(nèi)插法計(jì)算。 例如，若確定物質(zhì)i在某固定液x上的保留指數(shù)iix 的數(shù)值。先選取兩個(gè)正構(gòu)烷烴作為基準(zhǔn)物質(zhì)，其中一個(gè)的碳數(shù)為z，另一個(gè)為z+1，它們的調(diào)整保留時(shí)間分別為tr(z) 和 tr(z+1) ，使被測(cè)物質(zhì)i的調(diào)整保留時(shí)間tr(i)恰好于兩者之間，即tr(z) tr(i) tr(z+1) 。將含物質(zhì)i和所選的兩個(gè)正構(gòu)烷烴的混合物注入其固定液x的色譜柱，在一定溫度條件下繪制色譜圖。 內(nèi)插法求iix示意圖信號(hào) tr(z) tr(i) tr(z+1

52、) t進(jìn)樣 大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，化合物調(diào)整保留時(shí)間的對(duì)數(shù)值與其保留指數(shù)間的關(guān)系基本上是一條直線關(guān)系。據(jù)此，可用內(nèi)插法求算iix 。 iix = 100z +（lg tr(i) - lg tr(z)）/（lg tr(z+1) - lg tr(z)） 保留指數(shù)的物理意義在于：它是與被測(cè)物質(zhì)具有相同調(diào)整保留時(shí)間的假想的正構(gòu)烷烴的碳數(shù)乘以100。保留指數(shù)僅與固定相的性質(zhì)、柱溫有關(guān)，與其它實(shí)驗(yàn)條件無關(guān)。其準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性都很好。只要柱溫與固定相相同，就可應(yīng)用文獻(xiàn)值進(jìn)行鑒定，而不必用純物質(zhì)相對(duì)照。5. 其它方法其它方法（二）（二） 定量分析定量分析o 定量分析的任務(wù)是求出混合樣品中各組分的百分含量。o 色譜定

53、量的依據(jù)是，當(dāng)操作條件一致時(shí)，被測(cè)組分的質(zhì)量（或濃度）與檢測(cè)器給出的響應(yīng)信號(hào)成正比。o 即： mi = fi ai 式中mi為被測(cè)組分i的質(zhì)量； ai為被測(cè)組分i的峰面積； fi為被測(cè)組分i的校正因子。可見，進(jìn)行色譜定量分析時(shí)需要：（1）準(zhǔn)確測(cè)量檢測(cè)器的響應(yīng)信號(hào) 峰面積或峰高；（2）準(zhǔn)確求得比例常數(shù) 校正因子；（3）正確選擇合適的定量計(jì)算方法，將測(cè)得的峰面積或峰高換算為組分的百分含量。1. 峰面積測(cè)量方法峰面積測(cè)量方法 峰面積是色譜圖提供的基本定量數(shù)據(jù)，峰面積測(cè)量的準(zhǔn)確與否直接影響定量結(jié)果。對(duì)于不同峰形的色譜峰采用不同的測(cè)量方法。（1）對(duì)稱形峰面積的測(cè)量 峰高乘以半峰寬法 對(duì)稱峰的面積 a =

54、 1.065 h w1/2（2）不對(duì)稱形峰面積的測(cè)量 峰高乘平均峰寬法 對(duì)于不對(duì)稱峰的測(cè)量如仍用峰高乘以半峰寬，誤差就較大，因此采用峰高乘平均峰寬法。a = 1/2 h（w0.15 + w0.85）式中w0.15 和 w0.85分別為峰高0.15倍和0.85倍處的峰寬。 2. 定量校正因子定量校正因子 色譜定量分析的依據(jù)是被測(cè)組分的量與其峰面積成正比。但是峰面積的大小不僅取決于組分的質(zhì)量，而且還與它的性質(zhì)有關(guān)。即當(dāng)兩個(gè)質(zhì)量相同的不同組分在相同條件下使用同一檢測(cè)器進(jìn)行測(cè)定時(shí)，所得的峰面積卻不相同。因此，混合物中某一組分的百分含混合物中某一組分的百分含量并不等于該組分的峰面積在各組分峰面積總和中所

55、量并不等于該組分的峰面積在各組分峰面積總和中所占的百分率占的百分率。這樣，就不能直接利用峰面積計(jì)算物質(zhì)的含量。為了使峰面積能真實(shí)反映出物質(zhì)的質(zhì)量，就要對(duì)峰面積進(jìn)行校正，即在定量計(jì)算中引入校正因子。 校正因子分為絕對(duì)校正因子和相對(duì)校正因子。 fi = mi / ai 式中fi值與組分i質(zhì)量絕對(duì)值成正比，所以稱為絕對(duì)校正因子。在定量分析時(shí)要精確求出fi值是比較困難的。一方面由于精確測(cè)量絕對(duì)進(jìn)樣量困難；另一方面峰面積與色譜條件有關(guān)，要保持測(cè)定fi值時(shí)的色譜條件相同，既不可能又不方便。另外即便能夠得到準(zhǔn)確的fi值，也由于沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)而無法直接應(yīng)用。為此提出相對(duì)校正因子的概念來解決色譜定量分析中的計(jì)算

56、問題。（1 1） 相對(duì)校正因子相對(duì)校正因子 相對(duì)校正因子定義為 fi = fi / fs 即某組分i的相對(duì)校正因子fi為組分i與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)s的絕對(duì)校正因子之比。 fi =（mi /ai）/（ms/as）=（mi / ms）（as / ai ） 可見，相對(duì)校正因子fi就是當(dāng)組分i的質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)s相等時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的峰面積是組分i峰面積的倍數(shù)。若某組分質(zhì)量為mi ，峰面積ai ，則fi ai的數(shù)值與質(zhì)量為mi的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的峰面積相等。也就是說，通過相對(duì)校正因子，可以把各個(gè)組分的峰面積分別換算成與其質(zhì)量相等的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的峰面積，于是比較標(biāo)準(zhǔn)就統(tǒng)一了。這就是歸一法求算各組分百分含量的基礎(chǔ)。（2 2） 相對(duì)校

57、正因子的表示方法相對(duì)校正因子的表示方法 上面介紹的相對(duì)校正因子中組分和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)都是以質(zhì)量表示的，故又稱為相對(duì)質(zhì)量校正因子；若以摩爾為單位，相對(duì)摩爾校正因子；另外相對(duì)校正因子的倒數(shù)還可定義為相對(duì)響應(yīng)值s（分別為相對(duì)質(zhì)量響應(yīng)值sw、相對(duì)摩爾響應(yīng)值sn）。通常所通常所指的校正因子都是相對(duì)校正因子。指的校正因子都是相對(duì)校正因子。（3 3） 相對(duì)校正因子的測(cè)定方法相對(duì)校正因子的測(cè)定方法 相對(duì)校正因子值只與被測(cè)物和標(biāo)準(zhǔn)物以及檢測(cè)器的類型有關(guān)，而與操作條件無關(guān)。因此， fi 值可自文獻(xiàn)中查出引用。若文獻(xiàn)中查不到所需的fi 值，也可以自己測(cè)定。常用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，對(duì)熱導(dǎo)檢測(cè)器（tcd）是苯，對(duì)氫焰檢測(cè)器（fid）

58、是正庚烷。 測(cè)定相對(duì)校正因子最好是用色譜純?cè)噭?。若無純品，也要確知該物質(zhì)的百分含量。測(cè)定時(shí)首先準(zhǔn)確稱量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和待測(cè)物，然后將它們混合均勻進(jìn)樣，分別測(cè)出其峰面積，再進(jìn)行計(jì)算。3. 定量計(jì)算方法定量計(jì)算方法（1 1） 歸一化法歸一化法 把所有出峰組分的含量之和按把所有出峰組分的含量之和按100%100%計(jì)的定量方法稱為歸一化法。計(jì)的定量方法稱為歸一化法。 其計(jì)算公式如下： pi % = (mi / m) 100% = aifi / (a1f1 + a2f2 + +anfn) 100% 式中pi %為被測(cè)組分i的百分含量； a1、a2 an為組分1 n的峰面積；f1、f2 fn為組分1 n的相對(duì)校

59、正因子。o 當(dāng)當(dāng)f i 為質(zhì)量相對(duì)校正因子時(shí)，得到質(zhì)量百分?jǐn)?shù)；當(dāng)為質(zhì)量相對(duì)校正因子時(shí)，得到質(zhì)量百分?jǐn)?shù)；當(dāng)f i 為摩爾相對(duì)校正因子時(shí)，得到摩爾百分?jǐn)?shù)。為摩爾相對(duì)校正因子時(shí)，得到摩爾百分?jǐn)?shù)。o 歸一化法的優(yōu)點(diǎn)是簡單、準(zhǔn)確，操作條件變化時(shí)對(duì)定歸一化法的優(yōu)點(diǎn)是簡單、準(zhǔn)確，操作條件變化時(shí)對(duì)定量結(jié)果影響不大。量結(jié)果影響不大。o 但此法在實(shí)際工作中仍有一些限制但此法在實(shí)際工作中仍有一些限制，比如：，比如：n樣品的所有組分必須全部流出，且出峰。樣品的所有組分必須全部流出，且出峰。n某些不需要定量的組分也必須測(cè)出其峰面積及某些不需要定量的組分也必須測(cè)出其峰面積及f i 值。值。n此外，測(cè)量低含量尤其是微量雜質(zhì)

60、時(shí)，誤差較大。此外，測(cè)量低含量尤其是微量雜質(zhì)時(shí)，誤差較大。（2 2） 內(nèi)標(biāo)法內(nèi)標(biāo)法 當(dāng)樣品各組分不能全部從色譜柱流出，或有些組分在檢測(cè)器上無信號(hào)，或只需對(duì)樣品中某幾個(gè)出現(xiàn)色譜峰的組分進(jìn)行定量時(shí)可采用內(nèi)標(biāo)法。o 內(nèi)標(biāo)法內(nèi)標(biāo)法，是將一定量的純物質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)物加入，是將一定量的純物質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)物加入到準(zhǔn)確稱量的試樣到準(zhǔn)確稱量的試樣 中，根據(jù)試樣和內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量以中，根據(jù)試樣和內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量以及被測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)物的峰面積可求出被測(cè)組分的含及被測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)物的峰面積可求出被測(cè)組分的含量量。 由于被測(cè)組分與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量之比等于峰面積之比，即 mi / ms =aifi / asfs 所以 mi = ms aifi /