大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化

1、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化第一節(jié)概述在自然條件下，很多質(zhì)粒都可通過細(xì)菌接合作用轉(zhuǎn)移到新的宿主內(nèi)，但在人工構(gòu) 建的質(zhì)粒載體中，一般缺乏此種轉(zhuǎn)移所必需的 mob基因,因此不能自行完成從一個(gè)細(xì) 胞到另一個(gè)細(xì)胞的接合轉(zhuǎn)移。如需將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移進(jìn)受體細(xì)菌，需誘導(dǎo)受體細(xì)菌產(chǎn) 生一種短暫的感受態(tài)以攝取外源 DNA.轉(zhuǎn)化（Transformation是將外源DNA分子引入受體細(xì)胞，使之獲得新的遺傳性狀 的一種手段，它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。轉(zhuǎn)化過程所用的受體細(xì)胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變體（R川它可以容忍外源DNA分子進(jìn)入體內(nèi)并穩(wěn)定地

2、遺傳 給后代。受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法（如電擊法,CaCI2,RbCI（KCI等化學(xué)試劑法的處 理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了暫時(shí)性的改變，成為能允許外源DNA分子進(jìn)入的感受 態(tài)細(xì)胞（Compenent cells進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA分子通過復(fù)制,表達(dá)實(shí)現(xiàn)遺傳信息的 轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。將經(jīng)過轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)，即可篩選出轉(zhuǎn)化子（Transformant即帶有異源DNA分子的受體細(xì)胞。目前常用的感受 態(tài)細(xì)胞制備方法有CaCl2和RbCl（KCl法,RbCl（KCl法制備的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率 較高，但CaCl2法簡(jiǎn)便易行，且其轉(zhuǎn)化效率完全可以滿足一般實(shí)驗(yàn)的要求，制備出的感

3、受態(tài)細(xì)胞暫時(shí)不用時(shí)，可加入占總體積15%的無菌甘油于-70C保存（半年，因此 CaCl2法為使用更廣泛。為了提高轉(zhuǎn)化效率，實(shí)驗(yàn)中要考慮以下幾個(gè)重要因素：1. 細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和密度：不要用經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接或儲(chǔ)于4 C的培養(yǎng)菌，最好從-70 C 或-20C甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。細(xì)胞生長(zhǎng)密度以 剛進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)為好，可通過監(jiān)測(cè)培養(yǎng)液的0D600來控制。DHa菌株的 OD600為0.5時(shí)，細(xì)胞密度在5X107個(gè)/ml左右（不同的菌株情況有所不同，這時(shí)比較 合適。密度過高或不足均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率。2. 質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度：用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA應(yīng)主要是超螺旋態(tài)DNA （cccDNA。轉(zhuǎn)

4、化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比 但當(dāng)加入的外源DNA的量過多或體積過大時(shí)，轉(zhuǎn)化效率就會(huì)降低。1ng的cccDNA即可使50卩I 的感受態(tài)細(xì)胞達(dá)到飽和。一般情況下，DNA溶液的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞體積的 5%。3. 試劑的質(zhì)量：所用的試劑，如CaCI2等均需是最高純度的（GR或AR.,并用超純 水配制，最好分裝保存于干燥的冷暗處。4. 防止雜菌和雜DNA的污染:整個(gè)操作過程均應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行，所用器皿, 如離心管，tip頭等最好是新的，并經(jīng)高壓滅菌處理，所有的試劑都要滅菌，且注意防止 被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染，否則均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率或雜 DNA的轉(zhuǎn)入, 為以后的篩選、鑒

5、定帶來不必要的麻煩。本實(shí)驗(yàn)以E.coli DH5a菌株為受體細(xì)胞，并用CaCI2處理，使其處于感受態(tài)，然后 與pBS質(zhì)粒共保溫，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。由于pBS質(zhì)粒帶有氨芐青霉素抗性基因（Amp r,可通 過Amp抗性來篩選轉(zhuǎn)化子。如受體細(xì)胞沒有轉(zhuǎn)入pBS,則在含Amp的培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)。能在Amp培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的受體細(xì)胞（轉(zhuǎn)化子肯定已導(dǎo)入了 pBS。轉(zhuǎn)化子擴(kuò) 增后，可將轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒提取出，進(jìn)行電泳、酶切等進(jìn)一步鑒定。第二節(jié)材料、設(shè)備及試劑、材料E. coli DH5菌株:R - ,M - ,Amp ;質(zhì)粒DNA:購(gòu)買或?qū)嶒?yàn)室自制,eppe ndof設(shè)備恒溫?fù)u床，電熱恒溫培養(yǎng)箱，臺(tái)式高速離心機(jī)，無菌工作臺(tái)，低

6、溫冰箱，恒溫水浴鍋, 制冰機(jī)，分光光度計(jì)，微量移液槍、試劑1丄B固體和液體培養(yǎng)基。2. Amp母液。3. 含Amp的LB固體培養(yǎng)基：將配好的LB固體培養(yǎng)基高壓滅菌后冷卻至 60C 左右加入Amp儲(chǔ)存液，使終濃度為50ug/ml,搖勻后鋪板。4麥康凱培養(yǎng)基（Maconkey Agar:取52g麥康凱瓊脂，加蒸餾水1000ml,微火煮沸 至完全溶解，高壓滅菌,待冷至60E左右加入Amp儲(chǔ)存液使終濃度為50ug/ml，然后 搖勻后涂板。5.0.05mol/L CaCI2溶液:稱取0.28g CaCI2（無水，分析純，溶于50ml重蒸水中，定 容至100ml,高壓滅菌。6.含 15%甘油的0.05mo

7、l/L CaCl2:稱取0.28g CaCI2（無水，分析純，溶于50ml重 蒸水中，加入15ml甘油,定容至100ml,高壓滅菌。第三節(jié)操作步驟一、受體菌的培養(yǎng)從LB平板上挑取新活化的E. coli DH5單菌落，接種于3-5ml LB液體培養(yǎng)基 中,37C下振蕩培養(yǎng)12小時(shí)左右，直至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期。將該菌懸液以1:100-1:50的比 例接種于100ml LB液體培養(yǎng)基中,37T振蕩培養(yǎng)2-3小時(shí)至OD600 =0.5左右。二、感受態(tài)細(xì)胞的制備（CaCl2法1、 將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入離心管中，冰上放置10分鐘,然后于4C下3000g離心10分 鐘。2、棄去上清，用預(yù)冷的0.05mol/L的CaCl2

8、溶液10ml輕輕懸浮細(xì)胞，冰上放置15-30分鐘后4C下3000g離心10分鐘。3、棄去上清 加入4ml預(yù)冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCI2溶液，輕輕懸浮細(xì) 胞，冰上放置幾分鐘，即成感受態(tài)細(xì)胞懸液。4、感受態(tài)細(xì)胞分裝成200卩的小份，貯存于-70C可保存半年。三、轉(zhuǎn)化1、從-70E冰箱中取200卩感受態(tài)細(xì)胞懸液，室溫下使其解凍，解凍后立即置冰 上。2、加入pBS質(zhì)粒DNA溶液（含量不超過50ng,體積不超過10卩輕輕搖勻，冰上 放置30分鐘后。3、 42 E水浴中熱擊90秒或37 E水浴5分鐘，熱擊后迅速置于冰上冷卻3-5分 鐘。4、向管中加入800 pl LB液體培養(yǎng)基（不含Am

9、p,混勻后37C振蕩培養(yǎng)1小時(shí)， 使細(xì)菌恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài)，并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因（Amp r。離心4000g 1min。棄上清800，留 200 p菌液,混勻。5、將上述菌液搖勻后取200卩涂布于含Amp的篩選平板上，正面向上放置半小時(shí)，待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿，37°C培養(yǎng)16-24小時(shí)。注意:在一個(gè)事先制備好的含100g/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板上加40 p X- gal貯存液（20mg/ml和4 p IPTG（200mg/ml。用無菌玻璃涂棒把溶液涂抹于整個(gè)平 板的表面，至37C直至所有的液體消失。同時(shí)做兩個(gè)對(duì)照：對(duì)照組1:以同體積的無菌雙蒸水代替 DNA

10、溶液，其它操作與上面相同。此組正常情況下在含抗生素的LB平板上應(yīng)沒有菌落出現(xiàn)對(duì)照組2:以同體積的無菌雙蒸水代替 DNA溶液,但涂板時(shí)只取5卩I菌液涂布于 不含抗生素的LB平板上，此組正常情況下應(yīng)產(chǎn)生大量菌落。四、計(jì)算轉(zhuǎn)化率次日觀察統(tǒng)計(jì)每個(gè)培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)。轉(zhuǎn)化后在含抗生素的平板上長(zhǎng)出的菌落即為轉(zhuǎn)化子 ，根據(jù)此皿中的菌落數(shù)可計(jì) 算出轉(zhuǎn)化子總數(shù)和轉(zhuǎn)化頻率，公式如下：轉(zhuǎn)化子總數(shù)=菌落數(shù)埼稀釋倍數(shù)疥專化反應(yīng)原液總體積/涂板菌液體積轉(zhuǎn)化頻率（轉(zhuǎn)化子數(shù)/每mg質(zhì)粒DNA=轉(zhuǎn)化子總數(shù)/質(zhì)粒DNA加入量（mg感受 態(tài)細(xì)胞總數(shù)=對(duì)照組2菌落數(shù)痂釋倍數(shù)菌液總體積/涂板菌液體積感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化 效率二轉(zhuǎn)化子總數(shù)/感受態(tài)細(xì)胞總數(shù)注意本實(shí)驗(yàn)方法也適用于其它E.coli受體菌株的不同的質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化。 但它們的轉(zhuǎn)化效率并不一定一樣。有的轉(zhuǎn)化效率高，需將轉(zhuǎn)化液進(jìn)行多梯度稀釋涂 板才能得到單菌落平板，而有的轉(zhuǎn)化效率低，涂板時(shí)必須將菌液濃縮（如離心,才能較 準(zhǔn)確的計(jì)算轉(zhuǎn)化率。轉(zhuǎn)化的一般步驟：1將感受態(tài)細(xì)胞加入要轉(zhuǎn)化的東東（一般原則是轉(zhuǎn)化物體積不超過感受態(tài)細(xì)胞 體積的十分之一