農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

1、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 了解低溫離心機(jī)、恒溫振蕩培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)等儀器的使用。2 學(xué)習(xí)真核生物的轉(zhuǎn)基因技術(shù)及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化原理； 掌握農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化植 物的實(shí)驗(yàn)方法，了解轉(zhuǎn)基因技術(shù)的操作流程。二、實(shí)驗(yàn)原理農(nóng)桿菌是普遍存在于土壤中的一種革蘭氏陰性細(xì)菌， 它能在自然條件下趨化 性地感染大多數(shù)雙子葉植物的受傷部位， 并誘導(dǎo)產(chǎn)生冠癭瘤。 農(nóng)桿菌通過侵染植 物傷口進(jìn)入細(xì)胞后，可將 T-DNA 插入到植物基因組中。因此，農(nóng)桿菌是一種天 然的植物遺傳轉(zhuǎn)化體系。人們將目的基因插入到經(jīng)過改造的 T-DNA 區(qū)，借助農(nóng) 桿菌的感染實(shí)現(xiàn)外源基因向植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與整合， 然后通過細(xì)胞和組織培養(yǎng)技

2、 術(shù)，再生出轉(zhuǎn)基因植株。實(shí)驗(yàn)一 培養(yǎng)基配制一、儀器和試劑1、儀器：高壓滅菌鍋，超凈工作臺(tái)2、藥品：Beef extract （牛肉浸膏）5g/L , Yeast extract 酵母提取物）1g/L , Peptone （蛋白胨） 5g/L ， Sucrose （蔗糖） 5g/L ， MgSO4.7H2O 0.4g/100ml ， Agar （瓊脂） 1.5g/100ml, MS粉，有機(jī)溶液，肌醇，F(xiàn)e鹽，NAA （萘乙酸）,6-BA （6-芐氨 基腺嘌呤），卡那霉素（kan），利福平（rif），鏈霉素（str）。二、實(shí)驗(yàn)方法第一組配制 YEB 固體培養(yǎng)基1、配制 250mlYEB 固體培養(yǎng)基

3、： 先稱取 1.25g Beef extract （牛肉浸膏）；1 .25gPeptone 蛋白胨）；0.25g Yeast extract 酵母提取物）；1.25g Sucrose 蔗糖）；1g MgSO4.7H2O;瓊脂粉3.75g；將上述藥品置于250ml三角瓶中，用量筒稱取200ml 蒸餾水將其溶解混勻，然后再定容至 250ml，用NaOH調(diào)pH=7.4。2、滅菌：將盛有 250ml 培養(yǎng)基的三角瓶封口，在三角瓶表面寫清培養(yǎng)基名 稱，用高壓滅菌鍋進(jìn)行滅菌。3、 抗生素的加入：高壓滅菌后，待培養(yǎng)基溫度降到 50-60C時(shí)（手可觸摸） 加入已經(jīng)過濾好的抗生素（100卩g/mlkan+50卩

4、g/ml St葉50卩g/ml rif），以免溫度過高 導(dǎo)致抗生素失效。4、倒板：將抗生素與培養(yǎng)基混勻，每個(gè)平皿倒 15ml 培養(yǎng)基，可以倒 16個(gè)平皿，倒完后打開平皿蓋，在紫外燈下照 10mi n,等待培養(yǎng)基凝固，蓋上平 皿蓋，封口備用。第二組配制 YEB 液體培養(yǎng)基1、配制 500mlYEB 液體培養(yǎng)基：先稱取 2.5g Beef extract （牛肉浸膏） ；2.5gPeptone （蛋白胨）； 0.5g Yeast extract 酵（ 母提取物 ）；2.5g Sucrose （蔗糖）； 2gMgSO4.7H2O;將上述藥品置于500ml三角瓶中，用量筒稱取450ml蒸餾水將其 溶解

5、混勻，然后再定容至500ml，用NaOH調(diào)pH=7.4。2、滅菌：將盛有 500ml 培養(yǎng)基的三角瓶封口，在三角瓶表面寫清培養(yǎng)基名 稱，用高壓滅菌鍋進(jìn)行滅菌。3、 抗生素的加入：高壓滅菌后，待培養(yǎng)基溫度降到 50-60C時(shí)（手可觸摸） 加入已經(jīng)過濾好的抗生素（100卩g/mlkan+50卩g/ml St葉50卩g/ml rif），以免溫度過高 導(dǎo)致抗生素失效。4、分裝：將培養(yǎng)基分別分裝到試管和三角瓶中，每個(gè)試管中分裝5ml，分裝12個(gè)試管。每個(gè)三角瓶中倒入35ml，共12個(gè)三角瓶。5、分裝好后，封口備用。第三組配制 MS 液體培養(yǎng)基1、配制 500mlMS 液體培養(yǎng)基：先在 500ml 三角瓶

6、中加入 400ml 蒸餾水， 稱取2.15gMS粉置于蒸餾水中，攪拌均勻；再向其中加入 5ml 100倍Fe鹽濃縮 液；5ml100倍肌醇濃縮液；5ml有機(jī)溶液的混合液，然后混勻定容至 500ml，用 NaOH 調(diào) pH=5.8。2、滅菌：將盛有 500ml 培養(yǎng)基的三角瓶封口， 在三角瓶表面寫清培養(yǎng)基名稱， 用高壓滅菌鍋進(jìn)行滅菌。3、 乙酰丁香酮的加入：高壓滅菌后，待培養(yǎng)基溫度降到50-60C時(shí)（手可觸 摸）加入已經(jīng)過濾好的乙酰丁香酮。4、分裝：將培養(yǎng)基分別分裝到三角瓶中，每個(gè)三角瓶中倒入40ml，共12個(gè)三角瓶。5、分裝好后，封口備用。第四組配制 MS 共培養(yǎng)基1、配制500mlMS固體共

7、培養(yǎng)基：先在500ml三角瓶中加入400ml蒸餾水， 稱取2.15gMS粉置于蒸餾水中，攪拌均勻；再向其中加入 5ml 100倍Fe鹽濃縮 液；5ml100倍肌醇濃縮液；5ml有機(jī)溶液的混合液，然后加入激素NAA和6-BA（按照實(shí)際需要，根據(jù)母液濃度計(jì)算用量），混勻定容至500ml，用NaOH調(diào) pH=5.8，然后再加入7%的瓊脂粉3.5g。2、滅菌：將盛有 500ml 培養(yǎng)基的三角瓶封口， 在三角瓶表面寫清培養(yǎng)基名稱， 用高壓滅菌鍋進(jìn)行滅菌。3、分裝：將培養(yǎng)基分別分裝到平皿中，每個(gè)平皿中倒入25ml，共20個(gè)平皿。4、分裝好后，封口備用。第五組配制 MS 分化篩選培養(yǎng)基1、配制1000mlM

8、S固體共培養(yǎng)基：用2個(gè)500ml三角瓶進(jìn)行盛取，先在500ml 三角瓶中加入400ml蒸餾水，稱取2.15gMS粉置于蒸餾水中，攪拌均勻；再向其中加入5ml 100倍Fe鹽濃縮液；5ml100倍肌醇濃縮液；5ml有機(jī)溶液的混合 液，然后加入激素 NAA 和 6-BA （按照實(shí)際需要，根據(jù)母液濃度計(jì)算用量） ，混 勻定容至500ml，用NaOH調(diào)pH=5.8，然后再加入7%的瓊脂粉3.5g。2、滅菌：將盛有 500ml 培養(yǎng)基的三角瓶封口， 在三角瓶表面寫清培養(yǎng)基名稱， 用高壓滅菌鍋進(jìn)行滅菌3、分裝：將培養(yǎng)基分別分裝到平皿中，每個(gè)平皿中倒入25ml,共40個(gè)平皿4、分裝好后，封口備用。第六組配制

9、MS生根培養(yǎng)基1、配制500mlMS固體共培養(yǎng)基：先在500ml三角瓶中加入400ml蒸餾水，稱取2.15gMS粉置于蒸餾水中，攪拌均勻；再向其中加入 5ml 100倍Fe鹽濃縮 液；5ml100倍肌醇濃縮液；5ml有機(jī)溶液的混合液，然后加入激素NAA和6-BA（根據(jù)母液濃度計(jì)算用量），混勻定容至500ml，用NaOH調(diào)pH=5.8,然后再加入7%的瓊脂粉3.5g。2、滅菌：將盛有500ml培養(yǎng)基的三角瓶封口，在三角瓶表面寫清培養(yǎng)基名稱， 用高壓滅菌鍋進(jìn)行滅菌。3、分裝：將培養(yǎng)基分別分裝到100ml三角瓶中，每個(gè)三角瓶中倒入 35ml， 共14個(gè)三角瓶。4、分裝好后，封口備用。實(shí)驗(yàn)二植物轉(zhuǎn)化工

10、程菌的制備一、儀器和試劑1儀器：低溫離心機(jī)（德國 EPPENDORF公司）；恒溫培養(yǎng)箱（哈東聯(lián)）；超凈 工作臺(tái)（蘇州凈化），恒溫?fù)u床。2 試劑：根瘤農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）菌種 EHA105，YEB 培養(yǎng)基，接種環(huán)，牙簽。二、實(shí)驗(yàn)方法1、將農(nóng)桿菌接種于附加50mg/L卡那霉素、50mg/L鏈霉素、50mg/L利福 平的YEB固體培養(yǎng)基上，28C暗培養(yǎng)48h，至長出單菌落。2、用接菌環(huán)挑取單菌落，接種在含相應(yīng)抗生素的 YEB液體培養(yǎng)基中，于 28 °C，180rp m，培養(yǎng)過夜。3、待菌液長至OD600為0.4 0.6時(shí)，將其按1 : 10的比例接種

11、到新鮮的上 述培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，進(jìn)行二次活化。實(shí)驗(yàn)三農(nóng)桿菌侵染轉(zhuǎn)化一、儀器和試劑1儀器：超凈工作臺(tái)(蘇州凈化)，植物組織培養(yǎng)箱 2試劑：根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌種EHA105，紅花無菌苗，MS液體培養(yǎng)基，共培養(yǎng)基(MS+6-BA+NAA)，手術(shù)刀，鑷子，剪刀，濾 紙，培養(yǎng)皿。二、實(shí)驗(yàn)方法1、當(dāng)農(nóng)桿菌0D600為0.5 0.6時(shí)，吸取菌液于無菌50ml離心管中，2000rpm，離心10min,棄上清，收集菌體，用等體積的 MS液體培養(yǎng)基將菌體重懸， 備用。2、侵染 取紅花無菌苗，在超凈工作臺(tái)中將子葉上下邊緣切掉，置于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，加入適量重懸好的菌液，侵

12、染 825 min (第一組侵染8min，第二組 侵染10min，第三組侵染12min，第四組侵染15min，第五組侵染20min，第六 組侵染25min)，此間要不時(shí)的搖動(dòng)。3、 除菌侵染完成后，棄去菌液，用無菌濾紙吸干多余的菌液。4、 共培養(yǎng) 侵染過的紅花子葉接種于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，28C暗培養(yǎng)3d，觀 察是否有農(nóng)桿菌過量生長。實(shí)驗(yàn)四農(nóng)桿菌侵染轉(zhuǎn)化一、儀器和試劑1儀器：超凈工作臺(tái)(蘇州凈化)，植物組織培養(yǎng)箱。2試劑：根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌種EHA105，紅花無菌苗，無菌水，分化培 養(yǎng)基 (MS+6-BA )，濾紙，鑷子，培養(yǎng)皿。二、實(shí)驗(yàn)方法1、除菌 取共培養(yǎng)后染菌的植物材料，放于無菌三角瓶?jī)?nèi)，先用無菌水（可 以添加抗生素）沖洗至溶液澄清為止。（如果沒有農(nóng)桿菌滋生的，