微生物實驗思考題參考答案及知識要點.doc

1、微生物實驗思考題參考答案及知識要點（可能在整理時部分問題能#慮全面，若有異議，請同學(xué)們自行從網(wǎng)絡(luò)或課本e?查找）微生物實驗思考題參考答案一 .酵母菌形態(tài)觀察及死活細(xì)胞鑒別1 .呂氏堿性美藍(lán)染液濃度和作用時間的不同對酵母菌死細(xì)胞數(shù)量有何影響？是分析其原因。美藍(lán)是一種無毒性的染料，它的氧化型呈藍(lán)色， 還原型無色。用美藍(lán)對酵母的活細(xì)胞進(jìn)行染色時，由于細(xì)胞的新陳代謝作用， 細(xì)胞內(nèi)具有較強的還原能力，能使美藍(lán)由藍(lán)色的氧化型變成為無色的還原型。因此，具有還原能力的酵母活細(xì)胞是無色的，而死細(xì)胞或代謝作用微弱的衰老細(xì)胞則呈藍(lán)色或淡藍(lán)色，借此即可對酵母菌的死細(xì)胞和活細(xì)胞進(jìn)行鑒別。美藍(lán)濃度高了，代謝不太活躍的活細(xì)

2、胞也會被染色，從而使觀察到的死細(xì)胞較多，活細(xì)胞較少；反之，則代謝微弱的細(xì)胞也能還原美藍(lán)，不被染色，從而使觀察到的死細(xì)胞較少， 活細(xì)胞較多。二.細(xì)菌的簡單染色和革蘭氏染色2 .革蘭氏染色中那一步是關(guān)鍵 ？為什么？你是如何操作的？革蘭氏染色的關(guān)鍵步驟是：乙醇脫色（是脫色時間）。如果脫色過度，革蘭氏陽性菌也可被脫色而被誤認(rèn)為是革蘭氏陰性菌； 如脫色時間過短，革蘭氏陰性菌也可被脫色而被誤認(rèn) 為是革蘭氏陽性菌。 脫色時間的長短還受涂片的厚薄， 脫色是玻片晃動的快慢及乙醇用量的 多少等因素的影響，難以嚴(yán)格規(guī)定（脫色是應(yīng)當(dāng)控制速度，脫色時間一般為20 30s）。3 .固定的目的之一是殺死菌體，這與自然死亡的

3、菌體有何不同？自然死亡的菌體本身已經(jīng)部分自溶，結(jié)構(gòu)已經(jīng)改變。固定殺死細(xì)菌時細(xì)菌結(jié)構(gòu)是保持死亡時的狀態(tài)的。4 .不經(jīng)復(fù)染這一步能否區(qū)分革蘭氏陽性菌和陰性菌？能。在酒精脫色后，不被酒精脫色而保留紫色者為革蘭氏陽性菌（G + ）,被酒精脫色為革蘭氏陰性菌。最后一步用番紅染液復(fù)染，是為了讓結(jié)果更清楚。5 .涂片為什么要固定，固定適應(yīng)注意什么問題？a殺死細(xì)菌并使菌體黏附與玻片上；b增加其對染料的親和力。固定時應(yīng)注意：手持玻片，菌膜朝上，在微火過3次（手指觸摸玻片反面， 不燙手為宜）， 固定時應(yīng)盡可能維持細(xì)胞原有形態(tài)，防止細(xì)胞膨脹或收縮。三.霉菌放線菌的形態(tài)觀察1 .鏡檢時，如何區(qū)分基內(nèi)菌絲與氣生菌絲？一

4、般氣生菌絲顏色較深，直生或分枝絲狀，比基內(nèi)菌絲粗；而基內(nèi)菌絲色淺、發(fā)亮，可看到橫隔膜，繼而斷裂成球狀或桿狀小體。2 .顯微鏡下細(xì)菌放線菌酵母菌和霉菌的主要區(qū)別是什么？放線菌與細(xì)菌需要在油鏡下才能觀察清楚，而霉菌和酵母菌在低倍鏡下即可看到。細(xì)菌：為細(xì)而短的單細(xì)胞微生物（個體微?。?，主要形態(tài)有：球、桿、螺旋狀等。（部分桿菌還可形成芽抱）放線菌：存在分枝絲狀體和菌絲體，革蘭氏陽性菌，有抱子絲和抱子（球形、橢圓形、桿狀、 柱狀）。酵母菌：單細(xì)胞，菌體呈圓球、卵形或橢圓形，少數(shù)呈檸檬形、尖形等。菌體比細(xì)菌大幾倍到幾十倍，部分處于出芽繁殖過程中菌體還可觀察到芽體，大多數(shù)菌體上還有芽痕。霉菌：菌絲和抱子的寬

5、度通常比細(xì)菌和放線菌粗得多，常是細(xì)菌菌體寬度的幾倍到幾十倍， 在低倍鏡下即可看到，并還可看到抱子囊梗、囊軸、抱子囊、包囊抱子等。4 .玻璃器皿的洗滌包扎與滅菌1 .高壓蒸汽滅菌開始時為什么要將鍋內(nèi)排盡？滅菌后為什么要待壓力降低到“0”時，才能打開排氣閥，開蓋取物？因為空氣的膨脹壓大于水蒸汽的膨脹壓，所以，當(dāng)水蒸汽中含有空氣時， 在同一壓力下，含空氣蒸汽的溫度低于飽和蒸汽的溫度。如果壓力未降到0時，打開排氣閥，就會因鍋內(nèi)壓力突然下降，使容器內(nèi)的培養(yǎng)基由于內(nèi)外壓力不平衡（壓力突然下降而發(fā)生復(fù)沸騰）而沖出燒瓶口或試管口，造成培養(yǎng)基等液體沾濕棉塞或溢出等事故。2 .設(shè)計實驗方案，比較干熱滅菌和濕熱滅菌

6、的效果。以下試驗方案有關(guān)操作均遵循無菌操作條件和等量原則。（一） 實驗材料試管鐐子酒精燈嗜熱脂肪芽抱桿菌 ATCC 7053菌片紙片（與菌片同大小 同材料）澳 甲酚紫蛋白凍水培養(yǎng)基（已滅菌）等實驗材料（材料有余）。（二）對照組取9支潔凈試管，分為 A1 B1 C1三組（每3支一組），將A1組中放入菌片，B1組中放入紙片，C1組中什么也不加；不經(jīng)滅菌，直接加入澳甲酚紫蛋白凍水培養(yǎng)基（等量）。（三）實驗組取18支潔凈試管，分為A21A22 B21B22 C21 C22六組（每3支一組），將A21 A22組中加入菌片，B21B22中加入紙片，C21 C22中什么也不加； 其中A21B21 C21進(jìn)行

7、160c 2小時干熱滅菌；其中A22B22 C22進(jìn)彳T 121 C 20分鐘濕熱滅菌，滅菌完畢，冷卻后加入澳甲酚紫蛋白凍水培養(yǎng)基（等量）。（四）恒為培養(yǎng)將上述所有試管按分組在 56c恒溫條件下培養(yǎng) 48小時。（五）結(jié)果處理將培養(yǎng)后的結(jié)果進(jìn)行記錄，制表進(jìn)行比較，得出滅菌效果。（六）重復(fù)試驗多次（10幾次）重復(fù)以上實驗步驟，得出普遍結(jié)果。3 .為什么干熱滅菌比濕熱滅菌所需溫度高時間長？在濕熱條件下，有水蒸汽的作用：a高溫水蒸汽導(dǎo)熱比干空氣要快；b高溫水蒸汽冷凝變水時有放熱過程；c高溫水蒸汽能穿透細(xì)菌的細(xì)胞膜，直接進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)破壞細(xì)胞；c高溫水蒸汽能水解一部分細(xì)胞結(jié)構(gòu)，加速導(dǎo)熱。（濕熱中細(xì)菌菌體吸收

8、水分，蛋白質(zhì)較易凝固，因蛋白質(zhì)含水量增加，所需凝固溫度降低；濕熱的穿透力比干熱大；濕熱的蒸汽有潛熱存在，每 1克水在100c時，由氣態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)時可放出2. 26kJ （千焦）的熱量。這種潛熱，能迅速提高被滅菌物體的溫度，從而增加滅菌效力。）5 .培養(yǎng)基的配置1 .配制牛肉膏蛋白月東培養(yǎng)基，有哪些操作步驟？那幾步易出錯，如何防止？稱取藥品一加熱溶化一分裝一加棉塞一包扎一滅菌一擱置斜面易出錯的步驟有：a稱取藥品稱取時鑰匙專用，瓶蓋不要錯蓋，易吸水的藥品要快速稱??；b加熱溶化加入藥品后要用玻璃棒不停攪拌，以免糊底（在瓊脂熔化過程中，應(yīng)控制火力，以免培養(yǎng)基因沸騰而溢出容器，同時，需不斷攪拌，以防瓊脂糊

9、底燒焦。）；c分裝分裝時培養(yǎng)基不能粘在三角瓶（或試管）口，以免接種時染菌；d擱置斜面斜面長度約試管長度一半為宜。2 .配制培養(yǎng)基的一般原則是什么？a目的明確b營養(yǎng)協(xié)調(diào)c理化適宜d經(jīng)濟(jì)節(jié)約6 .平板菌落計數(shù)法1 .平板菌落計數(shù)法的原理是什么 ？它適用于那些微生物的計數(shù)？平板菌落計數(shù)法是將等測樣品經(jīng)適當(dāng)稀釋后，其中的微生物充分分散為單個細(xì)胞，取一定量的稀釋液接種到平板上，經(jīng)過培養(yǎng)，由每個單細(xì)胞生長繁殖而形成的肉眼可見的菌落， 即一個單菌落應(yīng)代表原樣品中的一個單細(xì)胞。統(tǒng)計菌落數(shù)，根據(jù)其稀釋倍數(shù)和取樣接種量即可換算出樣品中的含菌數(shù)。（但是，由于待測樣品往往不易完全分散成單個細(xì)胞，所以，長成的一個單菌落

10、也可能來自樣品中的23或更多個細(xì)胞。因此平板菌落計數(shù)的結(jié)果往往偏低?，F(xiàn)在常使用菌落形成單位）。平板計數(shù)法是根據(jù)微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的一個菌落是由一個微生物繁殖而形成的現(xiàn)象進(jìn)行的，也就是一個菌落可代表一種微生物（并不絕對）。通常用來測定樣品中所含細(xì)菌、抱子、酵母菌等單細(xì)胞微生物的數(shù)量。2 .菌落樣液移入培養(yǎng)皿后，若不盡快地倒入培養(yǎng)基并充分搖勻，將會出現(xiàn)什么結(jié)果？為什 么？出現(xiàn)的結(jié)果是：形成菌落過于集中，不能形成均勻分布的單菌落，導(dǎo)致無法計數(shù)。因為：若不立即搖勻，菌體常會吸附在皿底上，不易形成均勻分布的單菌落，從而影響 計數(shù)的準(zhǔn)確性。3 .要獲得本次試驗的成功，那幾步最為關(guān)鍵？為什么？a稀釋

11、菌液 若在稀釋時移液管混用可使稀釋梯度不準(zhǔn)確， 從而導(dǎo)致計數(shù)誤差（放菌液時 吸管尖不要碰到液面，即每一支吸管只能接觸一個稀釋度的菌懸液， 否則稀釋不精確，結(jié)果誤差大。）;b稀釋倒平板1若再加入菌液不立即倒入培養(yǎng)基，可使菌體黏附于皿底；2若不注意培養(yǎng)基溫度， 溫度過高會將菌體燒死， 溫度過低會使培養(yǎng)基一倒入立即凝固，從而菌體不能均勻分布；3倒入培養(yǎng)基需立即搖勻， 否則菌體常會吸附在皿底上，不易形成均勻分布的單菌落，從而影響計數(shù)的準(zhǔn)確性；4選擇倒平板的稀釋梯度也是很重要的，一般以三個連續(xù)稀釋度中的第二個稀釋度倒平板后所出現(xiàn)的平均菌落數(shù)在50個左右為宜，否則要適當(dāng)增加（或減少）稀釋度加以調(diào)整。4 .

12、平板菌落計數(shù)法與顯微鏡直接計數(shù)法相比有何優(yōu)缺點？微生物顯微鏡直接計數(shù)法隨機性大 ，所以對菌體數(shù)量不能做出較為宏觀，全面的反應(yīng).顯微鏡直接計數(shù)法一般與血球計數(shù)板配套使用.但顯微鏡直接計數(shù)法的優(yōu)點是快速，觀察到馬上可以計數(shù)，而計的是相應(yīng)微生物總數(shù)。平板菌落計數(shù)法最大的缺點是速度慢，需要平板上長出菌落一段時間后才能計數(shù).但是由于平板菌落計數(shù)法通常做梯度稀釋，所以計數(shù)的線性范圍大.由于是菌懸液涂布，所以比較均勻，能較好的反應(yīng)菌落的疏密程度 .重復(fù)性，平行性很好，而計的是活菌數(shù)。是經(jīng)典的計數(shù)方 法.七.顯微鏡直接計數(shù)法1 .為何用血細(xì)胞計數(shù)板可計得樣品總菌值？敘述其適用范圍。a計數(shù)室體積一定；b在顯微鏡

13、下，不經(jīng)染色不能分辨菌體的死活，使計數(shù)所得的數(shù)目為一定體積內(nèi)的總菌數(shù)，從而計得樣品中總菌值。適用范圍：可單細(xì)胞存在的細(xì)菌酵母菌或顯絲狀生長的真菌，放線菌所生的抱子等。2 .為什么計數(shù)室內(nèi)不能有氣泡？試分析產(chǎn)生氣泡的可能原因。a氣泡會占據(jù)計數(shù)室的空間，導(dǎo)致計數(shù)室中的菌體個數(shù)計數(shù)偏小，最后導(dǎo)致計數(shù)結(jié)果偏小。b計數(shù)室內(nèi)的氣泡，可影響菌液的隨機分布，使計數(shù)產(chǎn)生誤差。產(chǎn)生氣泡原因：a操作不當(dāng)，先放菌?再蓋蓋玻片；b計數(shù)室洗滌不干凈；c蓋玻片移動，造成空氣進(jìn)入而產(chǎn)生氣泡。3 .試分析影響本實驗結(jié)果的誤差來源及提出改進(jìn)措施？1、儀器誤差：所用器材均應(yīng)清潔干凈，并且計數(shù)板計數(shù)區(qū)不應(yīng)該有擦痕。2、計數(shù)室內(nèi)可能有

14、氣泡。因為酵母細(xì)胞并沒有染色，看起來是透明的，有氣泡很容易被計入，使數(shù)值偏高；并且，氣泡會影響菌懸液的隨機分布。改進(jìn)：若產(chǎn)生氣泡，則用吸水紙吸出。3、菌體在計數(shù)板上分布不均，當(dāng)用選取5格計數(shù)時，會造成很大誤差。改進(jìn)：應(yīng)使菌液自然流入并混勻，進(jìn)行觀察時盡可能多數(shù)幾個格子。4、配制稀釋液時吸取的濃度過高或過低，導(dǎo)致稀釋液濃度和原液不成正確比例，計算時產(chǎn) 生誤差。應(yīng)將原液搖晃均勻后取中部的液體進(jìn)行稀釋。5、由于數(shù)菌體數(shù)目時視覺疲勞而導(dǎo)致的視覺誤差。應(yīng)多人觀察，取記錄平均數(shù)。6、計數(shù)時可能將格四周的菌都計算在內(nèi)了，使數(shù)值偏高。改進(jìn)：謹(jǐn)遵一個規(guī)則，計上不計下，計左不計右，不可以重復(fù)計數(shù)。7、可能出現(xiàn)有出

15、芽的酵母菌，將出芽的酵母菌按兩個計數(shù)了，使數(shù)值偏高。改進(jìn)：計數(shù)時，只有當(dāng)芽體于母細(xì)胞一樣大的時候，才能計為兩個。8、微量移液器的最小量程太大，在加樣時，容易加多，使蓋玻片鼓起，血球計數(shù)板所技術(shù)的體積變大，最終結(jié)果偏大。改進(jìn)：用量程的小的微量移液器并少加一些。八.微生物的純培養(yǎng)技術(shù)1.如果一項科學(xué)研究內(nèi)容需從自然界中篩選到能產(chǎn)生高溫蛋白酶的菌株，你將如何完成？寫出實驗方案（產(chǎn)蛋白酶菌株在酪素平板上能形成降解酪素透明圈）。以下試驗方案有關(guān)操作均遵循無菌操作條件一材料準(zhǔn)備1 土壤【有機質(zhì)（特別是蛋白質(zhì)）含量豐富的土壤】2滅菌生理鹽水（0.85%NaCl）3滅菌移液管4添加酪素的B4 （牛肉膏蛋白月東完全培養(yǎng)基）經(jīng)滅菌5 B 4斜面（經(jīng)滅菌）6其他材料：接種環(huán)酒精燈等二操作方法1在盛有10ml滅菌生理鹽水的燒杯中添加 1g 土壤，配成懸浮液；2稍靜止后，用滅菌移液管移取部分上清液，將其制成10A410人6倍的稀釋液；3用滅菌移液管吸取各稀釋液用稀釋倒平板法（或涂布平板法）將其接入添加酪素的B-4平板上；4在5565c下培養(yǎng) 1 2天；5挑取形成降解酪素透明圈的菌落（透明圈直徑 D與菌落直徑d之比較大者），轉(zhuǎn)接入B4斜面上培養(yǎng)；（若無特定菌落形成，則需另取土樣從開始重復(fù)試驗）6將B4斜面上的菌落再用平板純培養(yǎng)，依次重復(fù)2 3次后即可得