外科學專業(yè)畢業(yè)論文RNA干擾技術特異性抑制腎癌survivin表達的體外實驗研究

1、外科學專業(yè)畢業(yè)論文 精品論文 RNA干擾技術特異性抑制腎癌survivin表達的體外實驗研究關鍵詞：腎癌 RNA干擾 survivin基因 基因表達 基因治療摘要：RNA干擾（RNA interfering，RNAi）是近年發(fā)展起來的一種基因沉默技術，已成為對目的基因的功能、抗病毒和抗腫瘤基因治療方面研究的熱點；與其他腫瘤基因治療技術一樣，RNAi在應用過程中同樣存在靶向性的問題。凋亡抑制基因Survivin是IAP家族的一個新成員，廣泛表達于多種腫瘤組織，而在正常組織及癌旁組織中無表達或低表達。Survivin除具有抑制細胞凋亡、調節(jié)細胞有絲分裂的功能外，還參與腫瘤血管生成、引起腫瘤細胞對放

2、療及化療的耐藥性等。發(fā)現(xiàn)至今，Survivin已成為腫瘤基因治療理想的靶點和熱點。 腎癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率及惡性程度高。其早期無癥狀，出現(xiàn)癥狀后約30患者已到晚期，就診時已發(fā)生轉移，手術效果差或喪失了手術機會；對放射治療、化學治療和激素治療不敏感，其5年生存率不足10，所以迫切需要尋求新的治療手段提高療效。近年來有研究表明Survivin在腎癌中高表達。 本實驗在證實人腎癌786-O高表達Survivin的基礎上，利用RNAi技術，使用載體pGenesil-1構建的重組質粒shRNA-Survivin，以脂質體轉染入高表達Survivin的人腎癌786-0細胞株，顯著抑制了S

3、urvivinSurvivin mRNA的轉錄和蛋白表達，并抑制了細胞的活性，從體外細胞水平為以Survivin為靶基因的RNAi治療腎癌提供可靠的實驗室依據(jù)。 目的： 第一部分：檢測人腎癌786-O細胞株中的Survivin基因表達水平，探討Survivin基因在人腎癌786-O細胞株中表達的意義。第二部分：設計針對survivin基因的siRNA并與質粒載體連接，轉化大腸桿菌，挑選抗性菌落擴增培養(yǎng)重組質粒。第三部分：根據(jù)Survivin基因高表達于腎癌以及shRNA-Survivin抑制786-O細胞內Survlvm基因表達的特點，將shRNA-Survivin及對照質粒pGenesil-

4、1轉染至786-O后，了解RNA干擾Survivin基因后對786-O活性的影響，并檢測轉染后786-O細胞中的Survivin mRNA及蛋白表達水平。 方法： 第一部分：1.培養(yǎng)人腎癌786-O細胞株并用MTT法繪制生長曲線；2.RT-PCR檢測Survivin mRNA在786-O細胞內的轉錄水平；3.Western-blot檢測Survivin基因蛋白質的表達水平。第二部分：1.根據(jù)survlvin基因在GeneBank中序列設計相應的三組陽性siRNA和一組陰性對照，其轉錄模板與pGenesil-1連接并轉化入大腸桿菌DH5菌株；2.挑選卡那霉素抗性菌落并擴增培養(yǎng)；3.提取各組卡那抗

5、性菌落的質粒。第三部分：1.重組質粒pGenesil-1-survivinl、pGenesil-1-survivin2、pGenesil-3、陰性對照質粒HK以脂質體轉染至786-O；2.觀察轉染后各組細胞形態(tài)及轉染率，采用MTT法繪制轉染后各組及脂質體組細胞生長曲線；3.RT-PCR檢測Survivin mRNA在各組的轉錄水平；4.Western-blot檢測Survivin蛋白在各組的表達水平。 結果： 第一部分：1.腎癌786-O細胞株經(jīng)培養(yǎng)其倍增時間為52.22h，與文獻報道相符；2.RT-PCR顯示786-O中有Survivin mRNA的表達；3.Western-blot顯示78

6、6-O中有Survivin基因蛋白質的表達。第二部分：成功得到三組陽性siRNA（survivin1 GGACCACCGCATCTCTACA166；survivin2 GCATTCGTCCGGTTGCGCT358：survivin3GGCTGGCTTCATCCACTGC241）和一組陰性對照（GACTTCATAAGGCGCATGC）。Survivin基因有三個亞型，其中除了survivin2不能與variant2（NM001012270）匹配，只能與variant1（NM001168）、variant3（NM001012271）匹配外，survivin1和survivin3均可與survivi

7、n的3個亞型匹配。第三部分：1.轉染24h后，各組細胞形態(tài)相似，熒光顯微鏡下ABCD組可見少量綠色熒光。54h，各組部分細胞變圓，折光性降低，有較多壞死細胞，尤以A、C嚴重，熒光下A、B、C、D組綠色熒光較前明顯增多。轉染率的計算，轉染各組約為35，單純脂質體組為0；2.RT-PCR顯示S1組和S3組中SUrvivin mRNA的表達下調；3.Western-blot顯示S1組和S3組中Survivin蛋白的表達下調。 結論： 第一部分：在腎癌786-O細胞中Survivin基因在mRNA和蛋白質水平均有表達，提示Survivin基因與腎癌的發(fā)生發(fā)展密切相關。為Survivin為靶點的人腎癌基

8、因治療奠定了理論和實驗室基礎。第二部分：RNA干擾主要利用雙鏈RNA在細胞內經(jīng)Dicer酶的識別、結合、酶切產(chǎn)生有活性的長度為21-23nt小干擾RNA，與目的基因mRNA結合并使之降解，從而抑制目的基因的表達。我們在體外合成的針對Survivin的siRNA為下一步干擾786-O細胞中Survivin的表達提供了有力的武器。第三部分：體外轉錄合成特異性survivin siRNA能有效抑制腎癌786-O細胞株中survivin的表達，抑制細胞的活性，為腎癌的基因治療提供了一種新策略。正文內容 RNA干擾（RNA interfering，RNAi）是近年發(fā)展起來的一種基因沉默技術，已成為對目的

9、基因的功能、抗病毒和抗腫瘤基因治療方面研究的熱點；與其他腫瘤基因治療技術一樣，RNAi在應用過程中同樣存在靶向性的問題。凋亡抑制基因Survivin是IAP家族的一個新成員，廣泛表達于多種腫瘤組織，而在正常組織及癌旁組織中無表達或低表達。Survivin除具有抑制細胞凋亡、調節(jié)細胞有絲分裂的功能外，還參與腫瘤血管生成、引起腫瘤細胞對放療及化療的耐藥性等。發(fā)現(xiàn)至今，Survivin已成為腫瘤基因治療理想的靶點和熱點。 腎癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率及惡性程度高。其早期無癥狀，出現(xiàn)癥狀后約30患者已到晚期，就診時已發(fā)生轉移，手術效果差或喪失了手術機會；對放射治療、化學治療和激素治療不敏感

10、，其5年生存率不足10，所以迫切需要尋求新的治療手段提高療效。近年來有研究表明Survivin在腎癌中高表達。 本實驗在證實人腎癌786-O高表達Survivin的基礎上，利用RNAi技術，使用載體pGenesil-1構建的重組質粒shRNA-Survivin，以脂質體轉染入高表達Survivin的人腎癌786-0細胞株，顯著抑制了SurvivinSurvivin mRNA的轉錄和蛋白表達，并抑制了細胞的活性，從體外細胞水平為以Survivin為靶基因的RNAi治療腎癌提供可靠的實驗室依據(jù)。 目的： 第一部分：檢測人腎癌786-O細胞株中的Survivin基因表達水平，探討Survivin基因

11、在人腎癌786-O細胞株中表達的意義。第二部分：設計針對survivin基因的siRNA并與質粒載體連接，轉化大腸桿菌，挑選抗性菌落擴增培養(yǎng)重組質粒。第三部分：根據(jù)Survivin基因高表達于腎癌以及shRNA-Survivin抑制786-O細胞內Survlvm基因表達的特點，將shRNA-Survivin及對照質粒pGenesil-1轉染至786-O后，了解RNA干擾Survivin基因后對786-O活性的影響，并檢測轉染后786-O細胞中的Survivin mRNA及蛋白表達水平。 方法： 第一部分：1.培養(yǎng)人腎癌786-O細胞株并用MTT法繪制生長曲線；2.RT-PCR檢測Survivi

12、n mRNA在786-O細胞內的轉錄水平；3.Western-blot檢測Survivin基因蛋白質的表達水平。第二部分：1.根據(jù)survlvin基因在GeneBank中序列設計相應的三組陽性siRNA和一組陰性對照，其轉錄模板與pGenesil-1連接并轉化入大腸桿菌DH5菌株；2.挑選卡那霉素抗性菌落并擴增培養(yǎng)；3.提取各組卡那抗性菌落的質粒。第三部分：1.重組質粒pGenesil-1-survivinl、pGenesil-1-survivin2、pGenesil-3、陰性對照質粒HK以脂質體轉染至786-O；2.觀察轉染后各組細胞形態(tài)及轉染率，采用MTT法繪制轉染后各組及脂質體組細胞生長

13、曲線；3.RT-PCR檢測Survivin mRNA在各組的轉錄水平；4.Western-blot檢測Survivin蛋白在各組的表達水平。 結果： 第一部分：1.腎癌786-O細胞株經(jīng)培養(yǎng)其倍增時間為52.22h，與文獻報道相符；2.RT-PCR顯示786-O中有Survivin mRNA的表達；3.Western-blot顯示786-O中有Survivin基因蛋白質的表達。第二部分：成功得到三組陽性siRNA（survivin1 GGACCACCGCATCTCTACA166；survivin2 GCATTCGTCCGGTTGCGCT358：survivin3GGCTGGCTTCATCCAC

14、TGC241）和一組陰性對照（GACTTCATAAGGCGCATGC）。Survivin基因有三個亞型，其中除了survivin2不能與variant2（NM001012270）匹配，只能與variant1（NM001168）、variant3（NM001012271）匹配外，survivin1和survivin3均可與survivin的3個亞型匹配。第三部分：1.轉染24h后，各組細胞形態(tài)相似，熒光顯微鏡下ABCD組可見少量綠色熒光。54h，各組部分細胞變圓，折光性降低，有較多壞死細胞，尤以A、C嚴重，熒光下A、B、C、D組綠色熒光較前明顯增多。轉染率的計算，轉染各組約為35，單純脂質體組為

15、0；2.RT-PCR顯示S1組和S3組中SUrvivin mRNA的表達下調；3.Western-blot顯示S1組和S3組中Survivin蛋白的表達下調。 結論： 第一部分：在腎癌786-O細胞中Survivin基因在mRNA和蛋白質水平均有表達，提示Survivin基因與腎癌的發(fā)生發(fā)展密切相關。為Survivin為靶點的人腎癌基因治療奠定了理論和實驗室基礎。第二部分：RNA干擾主要利用雙鏈RNA在細胞內經(jīng)Dicer酶的識別、結合、酶切產(chǎn)生有活性的長度為21-23nt小干擾RNA，與目的基因mRNA結合并使之降解，從而抑制目的基因的表達。我們在體外合成的針對Survivin的siRNA為下

16、一步干擾786-O細胞中Survivin的表達提供了有力的武器。第三部分：體外轉錄合成特異性survivin siRNA能有效抑制腎癌786-O細胞株中survivin的表達，抑制細胞的活性，為腎癌的基因治療提供了一種新策略。RNA干擾（RNA interfering，RNAi）是近年發(fā)展起來的一種基因沉默技術，已成為對目的基因的功能、抗病毒和抗腫瘤基因治療方面研究的熱點；與其他腫瘤基因治療技術一樣，RNAi在應用過程中同樣存在靶向性的問題。凋亡抑制基因Survivin是IAP家族的一個新成員，廣泛表達于多種腫瘤組織，而在正常組織及癌旁組織中無表達或低表達。Survivin除具有抑制細胞凋亡、

17、調節(jié)細胞有絲分裂的功能外，還參與腫瘤血管生成、引起腫瘤細胞對放療及化療的耐藥性等。發(fā)現(xiàn)至今，Survivin已成為腫瘤基因治療理想的靶點和熱點。 腎癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率及惡性程度高。其早期無癥狀，出現(xiàn)癥狀后約30患者已到晚期，就診時已發(fā)生轉移，手術效果差或喪失了手術機會；對放射治療、化學治療和激素治療不敏感，其5年生存率不足10，所以迫切需要尋求新的治療手段提高療效。近年來有研究表明Survivin在腎癌中高表達。 本實驗在證實人腎癌786-O高表達Survivin的基礎上，利用RNAi技術，使用載體pGenesil-1構建的重組質粒shRNA-Survivin，以脂質體轉染

18、入高表達Survivin的人腎癌786-0細胞株，顯著抑制了SurvivinSurvivin mRNA的轉錄和蛋白表達，并抑制了細胞的活性，從體外細胞水平為以Survivin為靶基因的RNAi治療腎癌提供可靠的實驗室依據(jù)。 目的： 第一部分：檢測人腎癌786-O細胞株中的Survivin基因表達水平，探討Survivin基因在人腎癌786-O細胞株中表達的意義。第二部分：設計針對survivin基因的siRNA并與質粒載體連接，轉化大腸桿菌，挑選抗性菌落擴增培養(yǎng)重組質粒。第三部分：根據(jù)Survivin基因高表達于腎癌以及shRNA-Survivin抑制786-O細胞內Survlvm基因表達的特

19、點，將shRNA-Survivin及對照質粒pGenesil-1轉染至786-O后，了解RNA干擾Survivin基因后對786-O活性的影響，并檢測轉染后786-O細胞中的Survivin mRNA及蛋白表達水平。 方法： 第一部分：1.培養(yǎng)人腎癌786-O細胞株并用MTT法繪制生長曲線；2.RT-PCR檢測Survivin mRNA在786-O細胞內的轉錄水平；3.Western-blot檢測Survivin基因蛋白質的表達水平。第二部分：1.根據(jù)survlvin基因在GeneBank中序列設計相應的三組陽性siRNA和一組陰性對照，其轉錄模板與pGenesil-1連接并轉化入大腸桿菌DH

20、5菌株；2.挑選卡那霉素抗性菌落并擴增培養(yǎng)；3.提取各組卡那抗性菌落的質粒。第三部分：1.重組質粒pGenesil-1-survivinl、pGenesil-1-survivin2、pGenesil-3、陰性對照質粒HK以脂質體轉染至786-O；2.觀察轉染后各組細胞形態(tài)及轉染率，采用MTT法繪制轉染后各組及脂質體組細胞生長曲線；3.RT-PCR檢測Survivin mRNA在各組的轉錄水平；4.Western-blot檢測Survivin蛋白在各組的表達水平。 結果： 第一部分：1.腎癌786-O細胞株經(jīng)培養(yǎng)其倍增時間為52.22h，與文獻報道相符；2.RT-PCR顯示786-O中有Surv

21、ivin mRNA的表達；3.Western-blot顯示786-O中有Survivin基因蛋白質的表達。第二部分：成功得到三組陽性siRNA（survivin1 GGACCACCGCATCTCTACA166；survivin2 GCATTCGTCCGGTTGCGCT358：survivin3GGCTGGCTTCATCCACTGC241）和一組陰性對照（GACTTCATAAGGCGCATGC）。Survivin基因有三個亞型，其中除了survivin2不能與variant2（NM001012270）匹配，只能與variant1（NM001168）、variant3（NM001012271）匹配

22、外，survivin1和survivin3均可與survivin的3個亞型匹配。第三部分：1.轉染24h后，各組細胞形態(tài)相似，熒光顯微鏡下ABCD組可見少量綠色熒光。54h，各組部分細胞變圓，折光性降低，有較多壞死細胞，尤以A、C嚴重，熒光下A、B、C、D組綠色熒光較前明顯增多。轉染率的計算，轉染各組約為35，單純脂質體組為0；2.RT-PCR顯示S1組和S3組中SUrvivin mRNA的表達下調；3.Western-blot顯示S1組和S3組中Survivin蛋白的表達下調。 結論： 第一部分：在腎癌786-O細胞中Survivin基因在mRNA和蛋白質水平均有表達，提示Survivin基

23、因與腎癌的發(fā)生發(fā)展密切相關。為Survivin為靶點的人腎癌基因治療奠定了理論和實驗室基礎。第二部分：RNA干擾主要利用雙鏈RNA在細胞內經(jīng)Dicer酶的識別、結合、酶切產(chǎn)生有活性的長度為21-23nt小干擾RNA，與目的基因mRNA結合并使之降解，從而抑制目的基因的表達。我們在體外合成的針對Survivin的siRNA為下一步干擾786-O細胞中Survivin的表達提供了有力的武器。第三部分：體外轉錄合成特異性survivin siRNA能有效抑制腎癌786-O細胞株中survivin的表達，抑制細胞的活性，為腎癌的基因治療提供了一種新策略。RNA干擾（RNA interfering，RN

24、Ai）是近年發(fā)展起來的一種基因沉默技術，已成為對目的基因的功能、抗病毒和抗腫瘤基因治療方面研究的熱點；與其他腫瘤基因治療技術一樣，RNAi在應用過程中同樣存在靶向性的問題。凋亡抑制基因Survivin是IAP家族的一個新成員，廣泛表達于多種腫瘤組織，而在正常組織及癌旁組織中無表達或低表達。Survivin除具有抑制細胞凋亡、調節(jié)細胞有絲分裂的功能外，還參與腫瘤血管生成、引起腫瘤細胞對放療及化療的耐藥性等。發(fā)現(xiàn)至今，Survivin已成為腫瘤基因治療理想的靶點和熱點。 腎癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率及惡性程度高。其早期無癥狀，出現(xiàn)癥狀后約30患者已到晚期，就診時已發(fā)生轉移，手術效果差或

25、喪失了手術機會；對放射治療、化學治療和激素治療不敏感，其5年生存率不足10，所以迫切需要尋求新的治療手段提高療效。近年來有研究表明Survivin在腎癌中高表達。 本實驗在證實人腎癌786-O高表達Survivin的基礎上，利用RNAi技術，使用載體pGenesil-1構建的重組質粒shRNA-Survivin，以脂質體轉染入高表達Survivin的人腎癌786-0細胞株，顯著抑制了SurvivinSurvivin mRNA的轉錄和蛋白表達，并抑制了細胞的活性，從體外細胞水平為以Survivin為靶基因的RNAi治療腎癌提供可靠的實驗室依據(jù)。 目的： 第一部分：檢測人腎癌786-O細胞株中的S

26、urvivin基因表達水平，探討Survivin基因在人腎癌786-O細胞株中表達的意義。第二部分：設計針對survivin基因的siRNA并與質粒載體連接，轉化大腸桿菌，挑選抗性菌落擴增培養(yǎng)重組質粒。第三部分：根據(jù)Survivin基因高表達于腎癌以及shRNA-Survivin抑制786-O細胞內Survlvm基因表達的特點，將shRNA-Survivin及對照質粒pGenesil-1轉染至786-O后，了解RNA干擾Survivin基因后對786-O活性的影響，并檢測轉染后786-O細胞中的Survivin mRNA及蛋白表達水平。 方法： 第一部分：1.培養(yǎng)人腎癌786-O細胞株并用MT

27、T法繪制生長曲線；2.RT-PCR檢測Survivin mRNA在786-O細胞內的轉錄水平；3.Western-blot檢測Survivin基因蛋白質的表達水平。第二部分：1.根據(jù)survlvin基因在GeneBank中序列設計相應的三組陽性siRNA和一組陰性對照，其轉錄模板與pGenesil-1連接并轉化入大腸桿菌DH5菌株；2.挑選卡那霉素抗性菌落并擴增培養(yǎng)；3.提取各組卡那抗性菌落的質粒。第三部分：1.重組質粒pGenesil-1-survivinl、pGenesil-1-survivin2、pGenesil-3、陰性對照質粒HK以脂質體轉染至786-O；2.觀察轉染后各組細胞形態(tài)及

28、轉染率，采用MTT法繪制轉染后各組及脂質體組細胞生長曲線；3.RT-PCR檢測Survivin mRNA在各組的轉錄水平；4.Western-blot檢測Survivin蛋白在各組的表達水平。 結果： 第一部分：1.腎癌786-O細胞株經(jīng)培養(yǎng)其倍增時間為52.22h，與文獻報道相符；2.RT-PCR顯示786-O中有Survivin mRNA的表達；3.Western-blot顯示786-O中有Survivin基因蛋白質的表達。第二部分：成功得到三組陽性siRNA（survivin1 GGACCACCGCATCTCTACA166；survivin2 GCATTCGTCCGGTTGCGCT358

29、：survivin3GGCTGGCTTCATCCACTGC241）和一組陰性對照（GACTTCATAAGGCGCATGC）。Survivin基因有三個亞型，其中除了survivin2不能與variant2（NM001012270）匹配，只能與variant1（NM001168）、variant3（NM001012271）匹配外，survivin1和survivin3均可與survivin的3個亞型匹配。第三部分：1.轉染24h后，各組細胞形態(tài)相似，熒光顯微鏡下ABCD組可見少量綠色熒光。54h，各組部分細胞變圓，折光性降低，有較多壞死細胞，尤以A、C嚴重，熒光下A、B、C、D組綠色熒光較前明顯

30、增多。轉染率的計算，轉染各組約為35，單純脂質體組為0；2.RT-PCR顯示S1組和S3組中SUrvivin mRNA的表達下調；3.Western-blot顯示S1組和S3組中Survivin蛋白的表達下調。 結論： 第一部分：在腎癌786-O細胞中Survivin基因在mRNA和蛋白質水平均有表達，提示Survivin基因與腎癌的發(fā)生發(fā)展密切相關。為Survivin為靶點的人腎癌基因治療奠定了理論和實驗室基礎。第二部分：RNA干擾主要利用雙鏈RNA在細胞內經(jīng)Dicer酶的識別、結合、酶切產(chǎn)生有活性的長度為21-23nt小干擾RNA，與目的基因mRNA結合并使之降解，從而抑制目的基因的表達。

31、我們在體外合成的針對Survivin的siRNA為下一步干擾786-O細胞中Survivin的表達提供了有力的武器。第三部分：體外轉錄合成特異性survivin siRNA能有效抑制腎癌786-O細胞株中survivin的表達，抑制細胞的活性，為腎癌的基因治療提供了一種新策略。RNA干擾（RNA interfering，RNAi）是近年發(fā)展起來的一種基因沉默技術，已成為對目的基因的功能、抗病毒和抗腫瘤基因治療方面研究的熱點；與其他腫瘤基因治療技術一樣，RNAi在應用過程中同樣存在靶向性的問題。凋亡抑制基因Survivin是IAP家族的一個新成員，廣泛表達于多種腫瘤組織，而在正常組織及癌旁組織中

32、無表達或低表達。Survivin除具有抑制細胞凋亡、調節(jié)細胞有絲分裂的功能外，還參與腫瘤血管生成、引起腫瘤細胞對放療及化療的耐藥性等。發(fā)現(xiàn)至今，Survivin已成為腫瘤基因治療理想的靶點和熱點。 腎癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率及惡性程度高。其早期無癥狀，出現(xiàn)癥狀后約30患者已到晚期，就診時已發(fā)生轉移，手術效果差或喪失了手術機會；對放射治療、化學治療和激素治療不敏感，其5年生存率不足10，所以迫切需要尋求新的治療手段提高療效。近年來有研究表明Survivin在腎癌中高表達。 本實驗在證實人腎癌786-O高表達Survivin的基礎上，利用RNAi技術，使用載體pGenesil-1構建

33、的重組質粒shRNA-Survivin，以脂質體轉染入高表達Survivin的人腎癌786-0細胞株，顯著抑制了SurvivinSurvivin mRNA的轉錄和蛋白表達，并抑制了細胞的活性，從體外細胞水平為以Survivin為靶基因的RNAi治療腎癌提供可靠的實驗室依據(jù)。 目的： 第一部分：檢測人腎癌786-O細胞株中的Survivin基因表達水平，探討Survivin基因在人腎癌786-O細胞株中表達的意義。第二部分：設計針對survivin基因的siRNA并與質粒載體連接，轉化大腸桿菌，挑選抗性菌落擴增培養(yǎng)重組質粒。第三部分：根據(jù)Survivin基因高表達于腎癌以及shRNA-Survi

34、vin抑制786-O細胞內Survlvm基因表達的特點，將shRNA-Survivin及對照質粒pGenesil-1轉染至786-O后，了解RNA干擾Survivin基因后對786-O活性的影響，并檢測轉染后786-O細胞中的Survivin mRNA及蛋白表達水平。 方法： 第一部分：1.培養(yǎng)人腎癌786-O細胞株并用MTT法繪制生長曲線；2.RT-PCR檢測Survivin mRNA在786-O細胞內的轉錄水平；3.Western-blot檢測Survivin基因蛋白質的表達水平。第二部分：1.根據(jù)survlvin基因在GeneBank中序列設計相應的三組陽性siRNA和一組陰性對照，其轉

35、錄模板與pGenesil-1連接并轉化入大腸桿菌DH5菌株；2.挑選卡那霉素抗性菌落并擴增培養(yǎng)；3.提取各組卡那抗性菌落的質粒。第三部分：1.重組質粒pGenesil-1-survivinl、pGenesil-1-survivin2、pGenesil-3、陰性對照質粒HK以脂質體轉染至786-O；2.觀察轉染后各組細胞形態(tài)及轉染率，采用MTT法繪制轉染后各組及脂質體組細胞生長曲線；3.RT-PCR檢測Survivin mRNA在各組的轉錄水平；4.Western-blot檢測Survivin蛋白在各組的表達水平。 結果： 第一部分：1.腎癌786-O細胞株經(jīng)培養(yǎng)其倍增時間為52.22h，與文獻

36、報道相符；2.RT-PCR顯示786-O中有Survivin mRNA的表達；3.Western-blot顯示786-O中有Survivin基因蛋白質的表達。第二部分：成功得到三組陽性siRNA（survivin1 GGACCACCGCATCTCTACA166；survivin2 GCATTCGTCCGGTTGCGCT358：survivin3GGCTGGCTTCATCCACTGC241）和一組陰性對照（GACTTCATAAGGCGCATGC）。Survivin基因有三個亞型，其中除了survivin2不能與variant2（NM001012270）匹配，只能與variant1（NM00116

37、8）、variant3（NM001012271）匹配外，survivin1和survivin3均可與survivin的3個亞型匹配。第三部分：1.轉染24h后，各組細胞形態(tài)相似，熒光顯微鏡下ABCD組可見少量綠色熒光。54h，各組部分細胞變圓，折光性降低，有較多壞死細胞，尤以A、C嚴重，熒光下A、B、C、D組綠色熒光較前明顯增多。轉染率的計算，轉染各組約為35，單純脂質體組為0；2.RT-PCR顯示S1組和S3組中SUrvivin mRNA的表達下調；3.Western-blot顯示S1組和S3組中Survivin蛋白的表達下調。 結論： 第一部分：在腎癌786-O細胞中Survivin基因在

38、mRNA和蛋白質水平均有表達，提示Survivin基因與腎癌的發(fā)生發(fā)展密切相關。為Survivin為靶點的人腎癌基因治療奠定了理論和實驗室基礎。第二部分：RNA干擾主要利用雙鏈RNA在細胞內經(jīng)Dicer酶的識別、結合、酶切產(chǎn)生有活性的長度為21-23nt小干擾RNA，與目的基因mRNA結合并使之降解，從而抑制目的基因的表達。我們在體外合成的針對Survivin的siRNA為下一步干擾786-O細胞中Survivin的表達提供了有力的武器。第三部分：體外轉錄合成特異性survivin siRNA能有效抑制腎癌786-O細胞株中survivin的表達，抑制細胞的活性，為腎癌的基因治療提供了一種新策

39、略。RNA干擾（RNA interfering，RNAi）是近年發(fā)展起來的一種基因沉默技術，已成為對目的基因的功能、抗病毒和抗腫瘤基因治療方面研究的熱點；與其他腫瘤基因治療技術一樣，RNAi在應用過程中同樣存在靶向性的問題。凋亡抑制基因Survivin是IAP家族的一個新成員，廣泛表達于多種腫瘤組織，而在正常組織及癌旁組織中無表達或低表達。Survivin除具有抑制細胞凋亡、調節(jié)細胞有絲分裂的功能外，還參與腫瘤血管生成、引起腫瘤細胞對放療及化療的耐藥性等。發(fā)現(xiàn)至今，Survivin已成為腫瘤基因治療理想的靶點和熱點。 腎癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率及惡性程度高。其早期無癥狀，出現(xiàn)癥狀

40、后約30患者已到晚期，就診時已發(fā)生轉移，手術效果差或喪失了手術機會；對放射治療、化學治療和激素治療不敏感，其5年生存率不足10，所以迫切需要尋求新的治療手段提高療效。近年來有研究表明Survivin在腎癌中高表達。 本實驗在證實人腎癌786-O高表達Survivin的基礎上，利用RNAi技術，使用載體pGenesil-1構建的重組質粒shRNA-Survivin，以脂質體轉染入高表達Survivin的人腎癌786-0細胞株，顯著抑制了SurvivinSurvivin mRNA的轉錄和蛋白表達，并抑制了細胞的活性，從體外細胞水平為以Survivin為靶基因的RNAi治療腎癌提供可靠的實驗室依據(jù)。

41、 目的： 第一部分：檢測人腎癌786-O細胞株中的Survivin基因表達水平，探討Survivin基因在人腎癌786-O細胞株中表達的意義。第二部分：設計針對survivin基因的siRNA并與質粒載體連接，轉化大腸桿菌，挑選抗性菌落擴增培養(yǎng)重組質粒。第三部分：根據(jù)Survivin基因高表達于腎癌以及shRNA-Survivin抑制786-O細胞內Survlvm基因表達的特點，將shRNA-Survivin及對照質粒pGenesil-1轉染至786-O后，了解RNA干擾Survivin基因后對786-O活性的影響，并檢測轉染后786-O細胞中的Survivin mRNA及蛋白表達水平。 方法

42、： 第一部分：1.培養(yǎng)人腎癌786-O細胞株并用MTT法繪制生長曲線；2.RT-PCR檢測Survivin mRNA在786-O細胞內的轉錄水平；3.Western-blot檢測Survivin基因蛋白質的表達水平。第二部分：1.根據(jù)survlvin基因在GeneBank中序列設計相應的三組陽性siRNA和一組陰性對照，其轉錄模板與pGenesil-1連接并轉化入大腸桿菌DH5菌株；2.挑選卡那霉素抗性菌落并擴增培養(yǎng)；3.提取各組卡那抗性菌落的質粒。第三部分：1.重組質粒pGenesil-1-survivinl、pGenesil-1-survivin2、pGenesil-3、陰性對照質粒HK以

43、脂質體轉染至786-O；2.觀察轉染后各組細胞形態(tài)及轉染率，采用MTT法繪制轉染后各組及脂質體組細胞生長曲線；3.RT-PCR檢測Survivin mRNA在各組的轉錄水平；4.Western-blot檢測Survivin蛋白在各組的表達水平。 結果： 第一部分：1.腎癌786-O細胞株經(jīng)培養(yǎng)其倍增時間為52.22h，與文獻報道相符；2.RT-PCR顯示786-O中有Survivin mRNA的表達；3.Western-blot顯示786-O中有Survivin基因蛋白質的表達。第二部分：成功得到三組陽性siRNA（survivin1 GGACCACCGCATCTCTACA166；surviv

44、in2 GCATTCGTCCGGTTGCGCT358：survivin3GGCTGGCTTCATCCACTGC241）和一組陰性對照（GACTTCATAAGGCGCATGC）。Survivin基因有三個亞型，其中除了survivin2不能與variant2（NM001012270）匹配，只能與variant1（NM001168）、variant3（NM001012271）匹配外，survivin1和survivin3均可與survivin的3個亞型匹配。第三部分：1.轉染24h后，各組細胞形態(tài)相似，熒光顯微鏡下ABCD組可見少量綠色熒光。54h，各組部分細胞變圓，折光性降低，有較多壞死細胞，尤

45、以A、C嚴重，熒光下A、B、C、D組綠色熒光較前明顯增多。轉染率的計算，轉染各組約為35，單純脂質體組為0；2.RT-PCR顯示S1組和S3組中SUrvivin mRNA的表達下調；3.Western-blot顯示S1組和S3組中Survivin蛋白的表達下調。 結論： 第一部分：在腎癌786-O細胞中Survivin基因在mRNA和蛋白質水平均有表達，提示Survivin基因與腎癌的發(fā)生發(fā)展密切相關。為Survivin為靶點的人腎癌基因治療奠定了理論和實驗室基礎。第二部分：RNA干擾主要利用雙鏈RNA在細胞內經(jīng)Dicer酶的識別、結合、酶切產(chǎn)生有活性的長度為21-23nt小干擾RNA，與目的

46、基因mRNA結合并使之降解，從而抑制目的基因的表達。我們在體外合成的針對Survivin的siRNA為下一步干擾786-O細胞中Survivin的表達提供了有力的武器。第三部分：體外轉錄合成特異性survivin siRNA能有效抑制腎癌786-O細胞株中survivin的表達，抑制細胞的活性，為腎癌的基因治療提供了一種新策略。RNA干擾（RNA interfering，RNAi）是近年發(fā)展起來的一種基因沉默技術，已成為對目的基因的功能、抗病毒和抗腫瘤基因治療方面研究的熱點；與其他腫瘤基因治療技術一樣，RNAi在應用過程中同樣存在靶向性的問題。凋亡抑制基因Survivin是IAP家族的一個新成

47、員，廣泛表達于多種腫瘤組織，而在正常組織及癌旁組織中無表達或低表達。Survivin除具有抑制細胞凋亡、調節(jié)細胞有絲分裂的功能外，還參與腫瘤血管生成、引起腫瘤細胞對放療及化療的耐藥性等。發(fā)現(xiàn)至今，Survivin已成為腫瘤基因治療理想的靶點和熱點。 腎癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率及惡性程度高。其早期無癥狀，出現(xiàn)癥狀后約30患者已到晚期，就診時已發(fā)生轉移，手術效果差或喪失了手術機會；對放射治療、化學治療和激素治療不敏感，其5年生存率不足10，所以迫切需要尋求新的治療手段提高療效。近年來有研究表明Survivin在腎癌中高表達。 本實驗在證實人腎癌786-O高表達Survivin的基礎上

48、，利用RNAi技術，使用載體pGenesil-1構建的重組質粒shRNA-Survivin，以脂質體轉染入高表達Survivin的人腎癌786-0細胞株，顯著抑制了SurvivinSurvivin mRNA的轉錄和蛋白表達，并抑制了細胞的活性，從體外細胞水平為以Survivin為靶基因的RNAi治療腎癌提供可靠的實驗室依據(jù)。 目的： 第一部分：檢測人腎癌786-O細胞株中的Survivin基因表達水平，探討Survivin基因在人腎癌786-O細胞株中表達的意義。第二部分：設計針對survivin基因的siRNA并與質粒載體連接，轉化大腸桿菌，挑選抗性菌落擴增培養(yǎng)重組質粒。第三部分：根據(jù)Sur

49、vivin基因高表達于腎癌以及shRNA-Survivin抑制786-O細胞內Survlvm基因表達的特點，將shRNA-Survivin及對照質粒pGenesil-1轉染至786-O后，了解RNA干擾Survivin基因后對786-O活性的影響，并檢測轉染后786-O細胞中的Survivin mRNA及蛋白表達水平。 方法： 第一部分：1.培養(yǎng)人腎癌786-O細胞株并用MTT法繪制生長曲線；2.RT-PCR檢測Survivin mRNA在786-O細胞內的轉錄水平；3.Western-blot檢測Survivin基因蛋白質的表達水平。第二部分：1.根據(jù)survlvin基因在GeneBank中

50、序列設計相應的三組陽性siRNA和一組陰性對照，其轉錄模板與pGenesil-1連接并轉化入大腸桿菌DH5菌株；2.挑選卡那霉素抗性菌落并擴增培養(yǎng)；3.提取各組卡那抗性菌落的質粒。第三部分：1.重組質粒pGenesil-1-survivinl、pGenesil-1-survivin2、pGenesil-3、陰性對照質粒HK以脂質體轉染至786-O；2.觀察轉染后各組細胞形態(tài)及轉染率，采用MTT法繪制轉染后各組及脂質體組細胞生長曲線；3.RT-PCR檢測Survivin mRNA在各組的轉錄水平；4.Western-blot檢測Survivin蛋白在各組的表達水平。 結果： 第一部分：1.腎癌7

51、86-O細胞株經(jīng)培養(yǎng)其倍增時間為52.22h，與文獻報道相符；2.RT-PCR顯示786-O中有Survivin mRNA的表達；3.Western-blot顯示786-O中有Survivin基因蛋白質的表達。第二部分：成功得到三組陽性siRNA（survivin1 GGACCACCGCATCTCTACA166；survivin2 GCATTCGTCCGGTTGCGCT358：survivin3GGCTGGCTTCATCCACTGC241）和一組陰性對照（GACTTCATAAGGCGCATGC）。Survivin基因有三個亞型，其中除了survivin2不能與variant2（NM001012

52、270）匹配，只能與variant1（NM001168）、variant3（NM001012271）匹配外，survivin1和survivin3均可與survivin的3個亞型匹配。第三部分：1.轉染24h后，各組細胞形態(tài)相似，熒光顯微鏡下ABCD組可見少量綠色熒光。54h，各組部分細胞變圓，折光性降低，有較多壞死細胞，尤以A、C嚴重，熒光下A、B、C、D組綠色熒光較前明顯增多。轉染率的計算，轉染各組約為35，單純脂質體組為0；2.RT-PCR顯示S1組和S3組中SUrvivin mRNA的表達下調；3.Western-blot顯示S1組和S3組中Survivin蛋白的表達下調。 結論： 第

53、一部分：在腎癌786-O細胞中Survivin基因在mRNA和蛋白質水平均有表達，提示Survivin基因與腎癌的發(fā)生發(fā)展密切相關。為Survivin為靶點的人腎癌基因治療奠定了理論和實驗室基礎。第二部分：RNA干擾主要利用雙鏈RNA在細胞內經(jīng)Dicer酶的識別、結合、酶切產(chǎn)生有活性的長度為21-23nt小干擾RNA，與目的基因mRNA結合并使之降解，從而抑制目的基因的表達。我們在體外合成的針對Survivin的siRNA為下一步干擾786-O細胞中Survivin的表達提供了有力的武器。第三部分：體外轉錄合成特異性survivin siRNA能有效抑制腎癌786-O細胞株中survivin的

54、表達，抑制細胞的活性，為腎癌的基因治療提供了一種新策略。RNA干擾（RNA interfering，RNAi）是近年發(fā)展起來的一種基因沉默技術，已成為對目的基因的功能、抗病毒和抗腫瘤基因治療方面研究的熱點；與其他腫瘤基因治療技術一樣，RNAi在應用過程中同樣存在靶向性的問題。凋亡抑制基因Survivin是IAP家族的一個新成員，廣泛表達于多種腫瘤組織，而在正常組織及癌旁組織中無表達或低表達。Survivin除具有抑制細胞凋亡、調節(jié)細胞有絲分裂的功能外，還參與腫瘤血管生成、引起腫瘤細胞對放療及化療的耐藥性等。發(fā)現(xiàn)至今，Survivin已成為腫瘤基因治療理想的靶點和熱點。 腎癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性

55、腫瘤之一，發(fā)病率及惡性程度高。其早期無癥狀，出現(xiàn)癥狀后約30患者已到晚期，就診時已發(fā)生轉移，手術效果差或喪失了手術機會；對放射治療、化學治療和激素治療不敏感，其5年生存率不足10，所以迫切需要尋求新的治療手段提高療效。近年來有研究表明Survivin在腎癌中高表達。 本實驗在證實人腎癌786-O高表達Survivin的基礎上，利用RNAi技術，使用載體pGenesil-1構建的重組質粒shRNA-Survivin，以脂質體轉染入高表達Survivin的人腎癌786-0細胞株，顯著抑制了SurvivinSurvivin mRNA的轉錄和蛋白表達，并抑制了細胞的活性，從體外細胞水平為以Surviv

56、in為靶基因的RNAi治療腎癌提供可靠的實驗室依據(jù)。 目的： 第一部分：檢測人腎癌786-O細胞株中的Survivin基因表達水平，探討Survivin基因在人腎癌786-O細胞株中表達的意義。第二部分：設計針對survivin基因的siRNA并與質粒載體連接，轉化大腸桿菌，挑選抗性菌落擴增培養(yǎng)重組質粒。第三部分：根據(jù)Survivin基因高表達于腎癌以及shRNA-Survivin抑制786-O細胞內Survlvm基因表達的特點，將shRNA-Survivin及對照質粒pGenesil-1轉染至786-O后，了解RNA干擾Survivin基因后對786-O活性的影響，并檢測轉染后786-O細胞

57、中的Survivin mRNA及蛋白表達水平。 方法： 第一部分：1.培養(yǎng)人腎癌786-O細胞株并用MTT法繪制生長曲線；2.RT-PCR檢測Survivin mRNA在786-O細胞內的轉錄水平；3.Western-blot檢測Survivin基因蛋白質的表達水平。第二部分：1.根據(jù)survlvin基因在GeneBank中序列設計相應的三組陽性siRNA和一組陰性對照，其轉錄模板與pGenesil-1連接并轉化入大腸桿菌DH5菌株；2.挑選卡那霉素抗性菌落并擴增培養(yǎng)；3.提取各組卡那抗性菌落的質粒。第三部分：1.重組質粒pGenesil-1-survivinl、pGenesil-1-surv

58、ivin2、pGenesil-3、陰性對照質粒HK以脂質體轉染至786-O；2.觀察轉染后各組細胞形態(tài)及轉染率，采用MTT法繪制轉染后各組及脂質體組細胞生長曲線；3.RT-PCR檢測Survivin mRNA在各組的轉錄水平；4.Western-blot檢測Survivin蛋白在各組的表達水平。 結果： 第一部分：1.腎癌786-O細胞株經(jīng)培養(yǎng)其倍增時間為52.22h，與文獻報道相符；2.RT-PCR顯示786-O中有Survivin mRNA的表達；3.Western-blot顯示786-O中有Survivin基因蛋白質的表達。第二部分：成功得到三組陽性siRNA（survivin1 GGA

59、CCACCGCATCTCTACA166；survivin2 GCATTCGTCCGGTTGCGCT358：survivin3GGCTGGCTTCATCCACTGC241）和一組陰性對照（GACTTCATAAGGCGCATGC）。Survivin基因有三個亞型，其中除了survivin2不能與variant2（NM001012270）匹配，只能與variant1（NM001168）、variant3（NM001012271）匹配外，survivin1和survivin3均可與survivin的3個亞型匹配。第三部分：1.轉染24h后，各組細胞形態(tài)相似，熒光顯微鏡下ABCD組可見少量綠色熒光。54h，各組部分細胞變圓，折光性降低，有較多壞死細胞，尤以A、C嚴重，熒光下A、B、C、D組綠色熒光較前明顯增多。轉染率的計算，轉染各組約為35，單純脂質體組為0；2.R