肺耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌血管生成的相關(guān)性

1、肺耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌血管生成的相關(guān)性 作者：衛(wèi)小紅，馬愛(ài)群，邵杰，楊嵐，陳明偉，王軍輝【摘要】 目的 探討肺耐藥相關(guān)蛋白(LRP)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)及微血管密度(MVD)在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中的變化、相互關(guān)系及可能的機(jī)制。方法 應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測(cè)56例NSCLC癌組織和27例正常對(duì)照肺組織中LRP、VEGF表達(dá)及MVD情況。結(jié)果 LRP陽(yáng)性表達(dá)分布于癌細(xì)胞胞漿內(nèi)，表達(dá)率66.1%，顯著高于對(duì)照肺組織(P<0.01)，其顯著性與病理類型無(wú)關(guān)；NSCLC組LRP的表達(dá)在不同性別、TNM分期、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及兩年生存率的比較上均無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P&a

2、mp;gt;0.05)。與對(duì)照組比較，NSCLC組VEGF表達(dá)明顯升高(P<0.01)，其顯著性與病理類型無(wú)關(guān)。NSCLC組VEGF表達(dá)與TNM分期、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)。NSCLC組MVD明顯高于對(duì)照組(P<0.01)，其顯著性不受病理類型、病理分級(jí)的影響。MVD在+期肺癌中為18.5±5.8，明顯高于期的13.8±5.1(P<0.05)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P<0.05)，兩年存活的MVD低于兩年死亡的MVD(P<0.01)。NSCLC組VEGF、LRP高表達(dá)

3、和MVD增高具有一致性(P<0.05)。結(jié)論 非小細(xì)胞肺癌血管生成與肺耐藥相關(guān)基因具有一定的相關(guān)性。LRP的高表達(dá)可能與VEGF上調(diào)其基因及VEGF促進(jìn)腫瘤MVD增加有關(guān)。抑制腫瘤新生血管的生成有望降低甚或遏制對(duì)非小細(xì)胞肺癌化療的耐藥性。 2 / 21【關(guān)鍵詞】 非小細(xì)胞肺癌；肺耐藥相關(guān)蛋白；血管生成；免疫組化 ChinaABSTRACT: Objective To investigate the changes in lung resistance-related protein (LRP) and vascular endothelial growth factor (VEG

4、F) expressions and micro-vessel density (MVD) in non-small cell lung cancer (NSCLC), and to elucidate their possible relationship and mechanism. Methods Immunohistochemistry was used to detect changes in LRP and VEGF expressions, and MVD level in lung tissues of 56 NSCLC cases and 27 normal controls

5、. Results LRP expression (66.1%) was concentrated in the cytoplasm of cancer cells, which was significantly higher than that in lung tissues of control group (P<0.01); the significance was not related to the pathological type. There was no significant difference in LRP expression among gender

6、, TNM stage, lymph node metastasis, and two-year survival in NSCLC (P>0.05). In comparison to the control group, NSCLC group had significantly increased VEGF expression (P<0.01), which was not related to the pathological type. VEGF expression in NSCLC group had a significant associatio

7、n with TNM stage and lymph node metastasis (P<0.05). The NSCLC group had a significantly higher MVD than the control group (P<0.01), which was not affected by the pathological type or degree. MVD value (18.5±5.8) of stage and in NSCLC group was significantly higher than that (13.8

8、±5.1) of stage (P<0.05); MVD value for patients with lymph node metastasis was higher than that without lymph node metastasis (P<0.05); MVD value for patients with two-year survival was less than those who died within two years (P<0.01). NSCLC group with high VEGF and LRP e

9、xpressions had a consistently increased MVD value (P<0.05). Conclusion There is a certain relationship between tumor angiogenesis and LRP expression in NSCLC. VEGF is responsible for the high expression of LRP through up-regulating LRP gene and augmenting tumor MVD. Inhibition of angiogenesis

10、 in tumor is expected to reduce or inhibit drug resistance to NSCLC.KEY WORDS: non-small cell lung cancer (NSCLC); lung resistance-related protein (LRP); angiogenesis; immunohistochemistry腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生原發(fā)或繼發(fā)耐藥是化療失敗的主要原因之一。非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)耐藥是多因素、多基因參與的過(guò)程，不僅與耐藥相關(guān)基因及其編碼蛋白過(guò)度表達(dá)有關(guān)，亦可

11、能涉及腫瘤的血管生成1。因此，探討耐藥相關(guān)蛋白和血管生成的關(guān)系將有助于了解其耐藥機(jī)制并為進(jìn)一步研究逆轉(zhuǎn)耐藥提供理論基礎(chǔ)。本研究采用免疫組化技術(shù)檢測(cè)NSCLC組織中肺耐藥相關(guān)蛋白(lung resistance-related protein, LRP)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的表達(dá)及微血管密度(micro-vascular density, MVD)，并探討它們之間的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)告如下。1 材料與方法1.1 標(biāo)本來(lái)源及分組本院2004年12月2006年6月經(jīng)手術(shù)切除的NSCLC患者(男39，女17)標(biāo)本56例作為NSC

12、LC組，年齡3669(56.5±11.5)歲。其中鱗癌30例，腺癌26例(包括肺泡細(xì)胞癌4例)。TNM 期20例，期12例，期21例，期3例。有肺門(mén)、縱隔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移22例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移34例。另隨機(jī)選取同期因外傷或其他良性病變行肺葉切除術(shù)患者的正常肺組織標(biāo)本27例(男20，女7)作為對(duì)照組，其中取自支氣管斷裂肺挫裂傷5例，肺炎性假瘤6例，慢性肺膿腫3例，肺結(jié)核6例，肺良性腫瘤4例，氣胸3例。年齡2564(50±16.85)歲。術(shù)后常規(guī)隨訪。兩組性別、年齡構(gòu)成差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。1.2 主要試劑兔抗人多克隆抗因子抗體、兔抗人單克隆抗LR

13、P抗體、兔抗人多克隆抗VEGF抗體、DAB顯色試劑盒等均購(gòu)自福州邁新公司。1.3 方法按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行SP免疫組織化學(xué)染色：每組實(shí)驗(yàn)均設(shè)有陽(yáng)性和陰性對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)照為福州邁新公司提供的含已知待檢抗原的切片；陰性對(duì)照在上述操作過(guò)程中以PBS緩沖液代替一抗。1.4 結(jié)果判定1.4.1 MVD用抗因子抗體標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞，可見(jiàn)呈棕色或棕黃色染色的血管內(nèi)皮細(xì)胞，先在低倍鏡(4×15)下觀察確定微血管數(shù)量最多的部位，再在高倍鏡(10×15)下以與周圍細(xì)胞和結(jié)締組織成分有明顯區(qū)別的任何一個(gè)陽(yáng)性染色的內(nèi)皮細(xì)胞或細(xì)胞叢為一個(gè)血管，只要結(jié)構(gòu)不相連，其分支結(jié)構(gòu)也計(jì)作一個(gè)血管。腫瘤內(nèi)硬化區(qū)及與腫

14、瘤交界處軟組織內(nèi)的微血管、有厚的平滑肌及管腔直徑大于8個(gè)紅細(xì)胞的血管除外。高倍鏡下分別計(jì)數(shù)3個(gè)視野，取其平均值即為平均MVD。1.4.2 VEGF表達(dá)細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)棕黃色顆粒狀染色，且著色明顯高于背景或背景不著色而細(xì)胞著色者為陽(yáng)性。按染色強(qiáng)度(未著色、弱、中、強(qiáng))及陽(yáng)性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)(0%，125%，2650%，>50%，)分別積分為0、1、2、3，兩項(xiàng)分?jǐn)?shù)之和為02分者計(jì)為VEGF表達(dá)陰性，36分者計(jì)為VEGF表達(dá)陽(yáng)性。1.4.3 LRP表達(dá)結(jié)果判定同VEGF。1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組間均數(shù)比較采用方差分析，兩兩比較采用最小顯著差異t檢驗(yàn)，

15、方差不齊時(shí)采用非參數(shù)檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用2檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)=0.05。2 結(jié) 果2.1 LRP、VEGF蛋白和MVD的表達(dá)情況LRP和VEGF的陽(yáng)性表達(dá)主要分布于細(xì)胞漿內(nèi)，細(xì)胞核未見(jiàn)表達(dá)。在對(duì)照組的表達(dá)主要分布于間質(zhì)細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，偶見(jiàn)吞噬細(xì)胞內(nèi)的陽(yáng)性表達(dá)(圖1)。2.2 LRP、VEGF表達(dá)和MVD與病理特征的關(guān)系與對(duì)照組比較，LRP在NSCLC組織的表達(dá)明顯升高(P<0.01)，G1+G2、G3與對(duì)照比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。VEGF在NSCLC表達(dá)高于對(duì)照(P<0.01)，G1+G2、G3與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)

16、意義(P<0.01，P<0.05)。在MVD的比較上，NSCLC組明顯高于對(duì)照組(P<0.01)；G1+G2、G3與對(duì)照比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。 LRP、VEGF、MVD各自在不同病理類型、病理分級(jí)之間的比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05，表1)。表1 LRP、VEGF表達(dá)和MVD與臨床病理的關(guān)系（略）注：P均為與對(duì)照組比較結(jié)果。2.3 LRP、VEGF表達(dá)和MVD與臨床特征之間的關(guān)系VEGF表達(dá)在不同TNM分期中有非常顯著性差異(P<0.01)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的VEGF表達(dá)陽(yáng)性率高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P

17、<0.05)。MVD在+期明顯高于期(P<0.05)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的MVD高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.05)；兩年存活的MVD低于兩年死亡的MVD(P<0.01)。LRP的表達(dá)在不同性別、TNM分期、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及兩年生存率的比較上均無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；VEGF表達(dá)在不同性別、兩年生存的比較上無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；MVD與不同性別無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05，表2)。表2 LRP、VEGF表達(dá)和MVD與臨床特征的關(guān)系（略）注：TNM分期中LRP和VEGF的P值為、+期的比較；M

18、VD的P值為與+期的比較。2.4 LRP、VEGF蛋白表達(dá)和MVD之間的關(guān)系LRP表達(dá)的肺癌組織中MVD為17.8±5.1，與不表達(dá)肺癌組織中MVD13.7±4.3比較，兩者差異性顯著(P<0.01)。MVD在VEGF表達(dá)陽(yáng)性的肺癌組織中為16.8±4.7，在VEGF陰性的肺癌組織中MVD為13.0±4.1，兩者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。在非小細(xì)胞肺癌組織標(biāo)本中LRP與VEGF表達(dá)相關(guān)(P<0.05)。3 討 論 NSCLC對(duì)常用化療藥物耐藥是影響化療效果和患者生存率的重要原因之一，也是困擾人們的一大難

19、題。多種因素、多個(gè)基因及蛋白參與了NSCLC的耐藥，包括LRP和VEGF等1-2。 LRP是一種僅表達(dá)于細(xì)胞胞質(zhì)3且在肺癌組織中有較高陽(yáng)性率的耐藥蛋白4。LRP的主要作用是清除外源性毒性物質(zhì)，保護(hù)機(jī)體免受損害，其作用機(jī)制為：阻止以細(xì)胞核為靶點(diǎn)的藥物進(jìn)入細(xì)胞核，并將藥物轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)的囊泡中，以胞吐的方式排出細(xì)胞5。在NSCLC組織中LRP陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤耐藥1和預(yù)后不良密切相關(guān)2。國(guó)內(nèi)學(xué)者6采用免疫組化法檢測(cè)NSCLC組織，發(fā)現(xiàn)LRP表達(dá)率為67.1%。本研究證實(shí)LRP僅在NSCLC的胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)，陽(yáng)性率為66.1%，細(xì)胞核未見(jiàn)表達(dá)。與對(duì)照肺組織比較，LRP在NSCLC組織的表達(dá)明顯升高(P&

20、;lt;0.01)，在腺癌、鱗癌的表達(dá)均增高(P<0.01，P<0.05)。有學(xué)者7證實(shí)LRP在肺鱗癌中的表達(dá)強(qiáng)度低于腺癌，并認(rèn)為其可能是臨床上鱗癌較腺癌對(duì)化療敏感、療效較好的原因。本研究未能證實(shí)LRP高表達(dá)與NSCLC不同病理類型相關(guān)。有研究6發(fā)現(xiàn)LRP表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)有關(guān)，即低分化者高表達(dá)，高分化者低表達(dá)；也有研究7提示LRP在中高分化癌組織中明顯高于低分化者。本研究結(jié)果提示LRP在NSCLC不同病理分級(jí)間的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，因此推測(cè)腫瘤耐藥與腫瘤分化程度無(wú)明顯相關(guān)性。本研究還發(fā)現(xiàn)LRP的表達(dá)與性別、TNM分期、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及兩年

21、生存率均無(wú)關(guān)(P>0.05)，提示臨床分期、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、患者性別等與NSCLC耐藥無(wú)密切關(guān)系，與已有報(bào)道7一致。 腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴于相關(guān)血管的生成。VEGF是最重要的血管生成因子，可刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂、遷移而促進(jìn)血管新生，也可增加血管通透性，刺激淋巴內(nèi)皮細(xì)胞增生，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移8。本研究發(fā)現(xiàn)在NSCLC中VEGF表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.01)，在腺癌、鱗癌內(nèi)的表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P<0.01)；TNM分期越晚VEGF陽(yáng)性率越高(P<0.01)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的VEGF陽(yáng)性率高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P<0.05)。但NSC

22、LC中VEGF表達(dá)與病理類型、病理分級(jí)、性別及兩年生存率等因素?zé)o關(guān)(P>0.05)。其中兩年生存率的結(jié)果與MINEO等9的報(bào)道不同，可能與研究對(duì)象術(shù)后進(jìn)一步干預(yù)以及樣本量大小等因素有關(guān)。MVD是反映腫瘤血管的一個(gè)重要指標(biāo)，是預(yù)測(cè)腫瘤轉(zhuǎn)移和患者無(wú)病生存的重要因素10。本研究顯示NSCLC包括鱗癌、腺癌組織的MVD明顯高于對(duì)照(P<0.01)；MVD與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及兩年存活狀態(tài)有關(guān)，而與病理類型、病理分級(jí)、性別等因素?zé)o關(guān)(P>0.05)。結(jié)果證實(shí)VEGF表達(dá)與MVD一致，與已有研究結(jié)果11-12相同。 有研究發(fā)現(xiàn)VEGF表達(dá)與多藥耐藥蛋白(mul

23、ti-drug resistance protein, MDR1)、LRP等表達(dá)相關(guān)13。血管生成抑制劑不但可抑制腫瘤血管的生成，還可在其誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡增加、耐藥基因表達(dá)減少14，而LRP的過(guò)度表達(dá)與多種腫瘤耐藥相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)在NSCLC組織中LRP與VEGF表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.05)，提示抑制NSCLC的VEGF可能會(huì)降低LRP的表達(dá)。本研究還證實(shí)NSCLC組織LRP、VEGF的表達(dá)增高與MVD增加相一致，據(jù)此我們推測(cè)LRP的高表達(dá)與VEGF上調(diào)其基因及VEGF促進(jìn)腫瘤MVD增加有關(guān)。LRP、VEGF的高表達(dá)與MVD增加促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的耐藥、侵襲和遷移

24、，導(dǎo)致病情進(jìn)展，化療失敗。 綜上所述，NSCLC血管生成與肺癌耐藥具有一定的相關(guān)性。LRP的高表達(dá)可能與VEGF上調(diào)其基因及促進(jìn)腫瘤MVD生成有關(guān)，因此VEGF不僅能誘導(dǎo)腫瘤血管生成促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，還可能參與腫瘤耐藥的形成。抑制腫瘤新生血管的生成將有望降低甚或遏制NSCLC的耐藥性。LRP和腫瘤血管生成的機(jī)制將有待于進(jìn)一步的深入研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1VOLM M, RITTGEN W. Cellular predictive factors for the drug response of lung cancer J. Anticancer Res, 2000, 20(5B):3449-3458

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