賴氨酰氧化酶基因在動脈粥樣硬化血管壁中的表達

1、賴氨酰氧化酶基因在動脈粥樣硬化血管壁中的表達 作者： 金春延，宋京郁 ，任香善，劉雙萍 【關(guān)鍵詞】 蛋白賴氨酶6-氧化酶;動脈粥樣硬化;細胞外基質(zhì) 摘要 目的 觀察賴氨酰氧化酶基因（LOX）在動脈粥樣硬化血管壁中的表達情況. 方法 選取動脈粥樣硬化（ATS）尸檢標本，采用LOX抗體免疫組織化學(xué)染色方法觀察LOX在ATS血管壁平滑肌細胞、膠原和彈性纖維等有形成分中的表達、分布及生物學(xué)行為與ATS的關(guān)系. 結(jié)果 LOX在動脈粥樣硬化組織內(nèi)呈陽性表達，其陽性例數(shù)為24例（68.6%），陰性為11例（31.4%）. 結(jié)論 LOX在保持細胞外基質(zhì)（ECM）的完整性中起重要作用，在ATS病變血管壁中有一定

2、程度的表達，LOX活性的異?？蓪?dǎo)致ECM重建，從而可能促進ATS的形成. 關(guān)鍵詞 蛋白賴氨酶6-氧化酶;動脈粥樣硬化;細胞外基質(zhì) ABSTRACT:OBJECTIVE To study the expression of lysyl oxidase gene（LOX）in atherosclerotic artery.METHODS Using autopsy specimen of atherosclerosis（ATS）and LOX antibody.It was observed and studied that the expression，distribution and biol

3、ogical activities of LOX in smooth muscle cells，collagen and elastin of atheromatous vascular wall and the relationship between LOX and pathological changes of ATS by immunohisto-chemistry.RESULTS The LOX was expressed in atherosclerotic artery，and total positive cases of LOX were24（68.6%），in which1

4、1（31.4%）were negative，respectively.CONCLUSION LOX plays a important role in maintaining the structural integrity of ECM，expresses in the arterial wall of ATS，and abnormal LOX activities may contribute to the pathogenesis of ATS by remodeling the ECM.Key words:protein lysine6-oxidase;atherosclerosis;

5、extracellular matrix2 / 12 動脈粥樣硬化（atherosclerosis，ATS）是危害人類生命健康的疾病之一，而細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）在ATS的形成和發(fā)展過程中起重要作用 1 .賴氨酰氧化酶基因（lysyl oxidase gene，LOX）位于第5號染色體，原位雜交顯示在5q23.331.2 2 .在人類胎盤、皮膚和主動脈ECM中，LOX與彈性蛋白和膠原纖維締合.在發(fā)生ATS的動脈中，賴氨酰氧化酶（lysyl oxidase，LO）可調(diào)節(jié)動脈中纖維成分的積聚 3 .本文探討了LOX在發(fā)生ATS血管的平滑肌細胞（vascula

6、r smooth muscle cell，VSMC）、膠原和彈性纖維等有形成分上的表達、分布及生物學(xué)行為與ATS發(fā)生、發(fā)展過程中形態(tài)學(xué)之間的關(guān)系，為臨床預(yù)防與治療ATS提供理論依據(jù). 1 材料與方法 1.1 材料 1.1.1 標本 選取45例延邊地區(qū)不同年齡（2566歲）病理尸檢標本，其中35例為ATS標本，10例為陰性對照標本，均從主動脈和冠狀動脈不同病變特點的粥樣病灶中取材，用100g/L中性甲醛固定.1.1.2 試劑 LOX抗體由美國Hawaii大學(xué)Matrix 病理生物學(xué)科Charles D.Boyd及Katalin Csiszar教授惠贈.ABC試劑盒及DAB（3-3-二氨基聯(lián)苯二胺

7、鹽酸鹽）分別購自美國Vector公司及北京中山試劑公司. 1.2 方法 1.2.1 HE染色 按常規(guī)進行. 1.2.2 Van Gieson染色（膠原纖維染色） 常規(guī)脫蠟移至蒸餾水，用Wigert鐵蘇木素液染色20min，流水沖洗，5g/L鹽酸酒精迅速分化（短于30s），流水沖洗1520min直至變?yōu)樗{色，蒸餾水沖洗3次，用Van Gieson液染色5min，950mL/L酒精分化2030s，脫水，透明，封固（中性樹膠）. 1.2.3 Verhoeff鐵蘇木素染色（彈性纖維染色） 常規(guī)脫蠟移至蒸餾水，用Verhoeff鐵蘇木素液染色2030min，顏色呈黑色為止，流水沖洗5min，蒸餾水涮洗3

8、次，以20g/L三氯化鐵水溶液分色至彈性纖維清晰（1020s），流水沖洗5min，蒸餾水涮洗3次，用950mL/L酒精洗去碘色，使彈性纖維更加清晰，水洗，用Van Gieson液作對比染色（短于20s），500mL/L酒精迅速分色（2030s），無水乙醇脫水，透明，封固（中性樹膠）. 1.2.4 免疫組織化學(xué)染色 實驗操作按Vector ABC試劑盒說明書進行.因無已知陽性對照標本，故每次設(shè)陰性對照，以PBS代替一抗作陰性對照.免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判定根據(jù)染色反應(yīng)強度，并按其陽性細胞的數(shù)量及染色深度分別記分為03分，再根據(jù)這兩項指標的積分數(shù)分為4級，具體如下:陰性（-）得0分，弱陽性（+）得2

9、分，陽性（）得3分，強陽性（）得4分;陽性細胞數(shù)少于50%得1分，50%80%得2分，高于80%得3分;染色的深度以多數(shù)細胞的呈色反應(yīng)判定 4 . 2 結(jié)果 2.1 ATS病變 所有標本HE染色觀察結(jié)果表明，動脈壁均可見不同程度ATS病變的形成，即內(nèi)皮下見大量泡沫細胞排列為層狀，形成脂質(zhì)斑塊，VSMC增生顯著，內(nèi)彈力板斷裂，粥樣斑塊丘狀隆起凸向內(nèi) 腔，丘狀隆起的表層形成纖維帽，其下為脂質(zhì)及組織 壞死崩解物質(zhì)（圖1），并可見中膜SMC向泡沫細胞移行;Van Gieson染色觀察結(jié)果表明，ATS病灶內(nèi)可見大量泡沫細胞和呈紅色染色的膠原纖維的形成（圖2）;Verhoeff鐵蘇木素染色觀察結(jié)果表明，在

10、ATS病灶內(nèi)可見呈黑色的彈力纖維增多，彈力板分離、斷裂甚至消失（圖3）. 2.2 LOX在動脈壁中的表達與分布 LOX抗體免疫組織化學(xué)染色呈棕褐色的陽性顆粒主要分布在SMC和內(nèi)皮細胞胞漿內(nèi)（圖4）.本組35例ATS標本中LOX陽性表達例數(shù)為24例（68.6%），其中強陽性為6例，顯色為強棕褐色，陽性為7例，顯色為次強棕褐色，弱陽性為11例，顯色為棕褐色;陰性為11例（31.4%），不顯色.3 討論 LO是銅依賴性胺氧化酶，可通過在某些賴氨酸和羥基賴氨酸中-氨基組的催化氧化去氨基作用使膠原蛋白和彈性蛋白交叉連接 5 .LO作為膠原和彈性蛋白交聯(lián)的關(guān)鍵酶與動脈粥樣硬化性疾病及動脈瘤的形成有關(guān)聯(lián).L

11、OX產(chǎn)生和活性的調(diào)節(jié)在保持ECM結(jié)構(gòu)的完整性中起重要作用，而LOX活性的改變引起的細胞外基質(zhì)重構(gòu)可引起人類動脈疾病 6 .體內(nèi)無處不在的ECM不但可將各種細胞連接在一起，保持各種組織及器官基本形狀，而且可維持力學(xué)性質(zhì).膠原在ECM中含量最高，剛性及抗張強度亦最大，是構(gòu)成ECM的骨架結(jié)構(gòu).膠原通過對VSMC增殖的調(diào)節(jié)，與ATS的形成相關(guān)，特別是型及型膠原的增生在ATS病變進展過程中作用尤為突出 7 .彈性蛋白與脂質(zhì)沉積有密切關(guān)系，脂質(zhì)飽和的彈性蛋白對彈性蛋白酶降解的敏感性增加.本實驗中觀察到，ATS標本血管壁ECM中LO的表達較少見，但在內(nèi)皮細胞及SMC內(nèi)LO的表達率較高.LO活性特異性位點的改

12、變與疾病模型血管的分布和嚴密性相關(guān)，在ATS模型中LO活性的明顯增加表明這種ECM酶活性是ATS中纖維化易感性接近的指標.總之，LOX在保持ECM的完整性中起重要作用，在ATS病變血管中有一定程度的表達，它的活性異常可導(dǎo)致ECM重建，從而促進ATS的形成.參 考 文 獻 1 宋京郁，孫東植，尹正日.Carneu白鴿血管壁細胞外基 質(zhì)的改變伴有自發(fā)性動脈粥樣硬化的發(fā)生M. 中華醫(yī)學(xué)研究精覽文庫內(nèi)科卷（上冊） .北京:軍事醫(yī)學(xué)出版 社，2000.740. 2 Hamalainen ER，Jones TA.Molecular cloning of human lysyl oxidase and as

13、signment of the gene tochromosome5q23.331.2J.Genomics，1991，11（3）:508. 3 Katya R，Lynda I，Mungo S.Upregulation of lysyl oxi- dase in vascular smooth muscle cells by cAMP:role for adenosine receptor activationJ.Journal of Cellular Biochemistry，1999，75:177. 4 王江，倪燦榮.P53、ras、c-erbB-2癌基因產(chǎn)物在大腸癌和大腸息肉中的表達J.

14、中華病理學(xué)雜志 ，1994，4: 97. 5 Hamalainen ER，Kemppainen R，Kuivaniemi H.Quanti- tative polymerase chain reaction of LO mRNA in malig-nantly transformed human cell lines demonstrate that their low LO activity is due to low quantities of its mRNA and low levels of transcription of the respective geneJ.J Biol Chem，1995，270:21590. 6 Song YL，F(xiàn)ord JW，Gordon D.Regulation of lysyl oxi-dase by interferonr in rat aortic