重組人白介素18在畢赤酵母中的高效分泌表達

1、重組人白介素18在畢赤酵母中的高效分泌表達 作者：楊莉莉, 魏 楓, 劉 虹, 李 慧, 于津浦, 任秀寶【摘要】 目的: 構(gòu)建人白介素18（hIL18）真核表達載體, 在畢赤酵母中高效分泌表達hIL18。方法: 通過PCR法擴增得到hIL18基因, 構(gòu)建其真核表達載體pPICZaC/hIL18, 電轉(zhuǎn)化畢氏酵母X33, PCR、 SDSPAGE、 Western blot等方法篩選獲得高效表達rhIL18的工程菌株, 疏水層析和陰離子交換層析純化表達產(chǎn)物, 并初步測定其生物學活性。結(jié)果: rhIL18經(jīng)甲醇誘導后其表達產(chǎn)量約為202 mg/L。Western blot檢測了rhIL18的特異

2、性結(jié)合活性; rhIl18純化后純度達95%左右, 并證明rhIL18能夠協(xié)同IL2誘導PBMC分泌IFN。結(jié)論: 構(gòu)建了重組hIL18的基因工程菌, 并在畢赤酵母中實現(xiàn)了高效分泌表達, 為進一步研究其活性和功能奠定了基礎。 【關(guān)鍵詞】 人白細胞介素18; 畢赤酵母; 表達; 純化 白細胞介素18 (IL18)/又稱IFN誘導因子 (IGIF), 主要由巨噬細胞產(chǎn)生的細胞因子1。人IL18前體蛋白由193個氨基酸組成, 天然IL18的活化依賴于IL1轉(zhuǎn)化酶（Interleukin1 conversing enzyme, ICE）的特異裂解作用, 從前體IL18的N端切除36個氨基酸殘基而使之活

3、化2 。IL2 / 1618的生物學活性與IL12相似, 能促進T細胞增殖, 誘導T細胞分泌IFN、 GMCSF, 抑制IL4和IL10產(chǎn)生, 增強NK及Th1細胞的細胞毒活性等; IL18的表達還與自身免疫病、 腫瘤及感染有關(guān)3, 4, IL18在抗腫瘤及抗病毒等方面具有潛在的應用前景5, 6。目前關(guān)于IL18制備的報道主要集中在原核表達體系2, 7, 但由于原核表達體系產(chǎn)量較低, 且存在復性得率低等一些問題, 使得其生產(chǎn)成本較高。為了更好的研究hIL18特性, 探索新的生物學活性, 我們在真核表達體系畢赤酵母中表達hIL18, 試圖得到大量hIL18蛋白, 更好的開展hIL18體內(nèi)或體外活

4、性研究。本研究從胎兒肝臟組織克隆了人IL18成熟肽（即從第37位氨基酸到193位氨基酸）基因, 構(gòu)建了真核重組表達質(zhì)粒, 利用畢赤酵母交配因子信號肽引導重組hIL18（rhIL18）成熟肽的分泌表達, 探索了純化方法, 并對其活性進行了初步研究。 1 材料和方法 1.1 材料 pPICZaC質(zhì)粒和畢赤酵母菌株X33購自Invitrogen公司; E.coli DH5購自北京鼎國生物公司; PCR引物由上海生物工程公司合成; 限制性內(nèi)切酶及T4 DNA連接酶購自大連寶生物公司; Phenly Sepharose 6 FF, Q Sepharose HP購于美國GE公司。淋巴細胞分離液購自中國醫(yī)學

5、科學院血液學研究所; 山羊抗人IL18抗體和辣根過氧化物酶（HRP）標記的兔抗山羊IgG抗體購自Santa Cruz公司。自動玻璃發(fā)酵罐（KLF2000型）為瑞士比歐（Bioengineer）公司產(chǎn)品; 蛋白純化儀（型號AKTA explorer 10）為美國GE公司產(chǎn)品。 1.2 方法 1.2.1 hIL18基因的克隆及載體構(gòu)建 提取胎兒肝臟組織RNA, 以其為模板, 根據(jù)GenBank公布序列(Accession No. BC007007.)設計引物, 上游引物為5CCG CTC GAG AAG AGA TAC TTT GGC AAG3, 下游引物為5GCC GCT CTA GAT TAG

6、 TCT TCG TTT TGA ACA G3(Xho I和Xba I劃線所示), PCR擴增得到含hIL18成熟肽基因片段。為了終止C端Histag 的表達, 下游引物中Xba I的前面加入終止密碼子。PCR擴增產(chǎn)物用Xho I和Xba I酶切后, 連于用同樣酶切的載體pPICZaC得到質(zhì)粒pPICZaC/hIL18。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5, 涂于含25 mg/L Zeocin LB平板上, 酶切鑒定轉(zhuǎn)化產(chǎn)物并測序, 提取鑒定正確的陽性克隆質(zhì)粒用于表達。 1.2.2 質(zhì)粒pPICZaC/IL18的轉(zhuǎn)化及鑒定 將重組表達質(zhì)粒pPICZaC/hIL18以Pme I線性化, 純化回收。將15

7、g線性pPICZaC/hIL18電轉(zhuǎn)化至新鮮制備的酵母感受態(tài)細胞X33中, 并同時轉(zhuǎn)化空質(zhì)粒pPICZaC和空酵母菌作對照, 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于YPD平板（Zeocin的濃度為100 mg/L）。28培養(yǎng)23 d至長出菌落。在YPD平板（Zeocin抗性）上挑取20個克隆, 提取轉(zhuǎn)化的畢赤酵母菌基因組DNA, 以其為模板, 以上面提到的特異引物進行PCR鑒定, 并以未轉(zhuǎn)化的酵母菌基因組DNA和空質(zhì)粒pPICZaC轉(zhuǎn)化的酵母菌基因組DNA作對照, PCR鑒定質(zhì)粒pPICZaC/hIL18是否穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。 1.2.3 搖瓶環(huán)境rhIL18的表達 經(jīng)鑒定的重組陽性克隆pPICZaC/IL18/X33接種于

8、10 mL BMGY中, 28、 250 r/min空氣搖床培養(yǎng)至對數(shù)生長期（A600=26）, 3 000 r/min 離心5 min, 棄上清, 用10 mL BMMY培養(yǎng)基懸浮細胞, 28、 250 r/min誘導rhIL18表達, 培養(yǎng)過程中保持良好的通氣。每24 h 補加100%甲醇誘導重組蛋白表達, 至甲醇終濃度為5 mL/L。分別在誘導24、 48、 72、 96、 120 h 取1 mL 培養(yǎng)物離心分離上清, SDSPAGE分析目的蛋白表達。 1.2.4 重組hIL18的大規(guī)模表達 在篩選出高表達菌株后, 重組hIL18 在3.7 L發(fā)酵罐進一步表達。挑取篩選出的陽性轉(zhuǎn)化子于1

9、0 mL BMGY培養(yǎng)基, 28、 250 r/min振搖培養(yǎng)24 h, 然后接種到200 mL的BMGY培養(yǎng)中, 28、 250 r/min振搖培養(yǎng)24 h至A600到 6左右。2 L 發(fā)酵基礎鹽培養(yǎng)基（BSM）添加8.7 mL PTM1微量元素和6 mL 0.2 g/L 生物素。28 mL/L氨水調(diào)整培養(yǎng)基的pH至6.0。首先擴增菌體, 培養(yǎng)至菌體濕重達到220 g/L, 待碳源完全消耗盡, 開始補加100%甲醇誘導rhIL18的表達, 甲醇補加速度6 mL/h 2 h, 10 mL/h 2 h, 最后18 mL/h 維持至發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵過程中, 調(diào)節(jié)通氣量和轉(zhuǎn)速維持溶解氧高于30, 通過

10、NH4OH 或 H3PO4的泵入維持pH的穩(wěn)定, 通過循環(huán)冷凝水維持溫度的穩(wěn)定, 發(fā)酵每隔6 h取樣進行分析A600和細胞濕重, 留上清用于蛋白分析。 1.2.5 rhIL18的純化 表達完成后, 疏水層析和陰離子交換層析分離純化rhIL18。收集上清, 確定最佳的疏水層析(NH4)2SO4飽和度, 然后用Phenyl Sepharose 6 FF疏水層析樹脂分離純化, 將上述疏水層析洗脫的蛋白溶液調(diào)節(jié)pH至8.0, 繼續(xù)用Q Sepharose HP陰離子層析柱分離純化。 1.2.6 rhIL18的鑒定 利用150 g/L SDSPAGE 和Western blot 分析蛋白的表達及純化結(jié)果

11、。將rhIL18轉(zhuǎn)移到PVDF膜上, 用山羊抗人IL18抗體為一抗, 以HRP標記的兔抗山羊IgG抗體為二抗進行分析。Lowry法檢測 rhIL18培養(yǎng)上清中總蛋白含量。采用SDSPAGE電泳凝膠掃描半定量分析目的蛋白表達量。 1.2.7 rhIL18刺激PBMC產(chǎn)生IFN 用RPMI1640（含100 mL/L FCS）培養(yǎng)液稀釋標準品rhIL18和純化的rhIL18各2組, 濃度分別為0.4、 4、 40 mol/L分別加到96孔板, 100 L/孔, 每個稀釋度3個平行孔。常規(guī)Ficoll法分離健康志愿者PBMC, 調(diào)整細胞密度為1×109/L, 分成2份, 其中一份加入IL2

12、（100 U/mL）, 分別接種96孔板, 100 L/孔, 對應稀釋好的標準品rhIL18和純化的rhIL18, 37、 50 mL/L CO2孵箱培養(yǎng)48 h。收集細胞上清, 用ELISA試劑盒測IFN含量。 2 結(jié)果 2.1 hIL18表達載體的構(gòu)建 PCR產(chǎn)物行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定, 在500 bp左右見到特異擴增條帶（圖1）, 與預測片段大小相同, 初步確定為編碼hIL18的片段。重組質(zhì)粒pPICZaC/hIL18經(jīng)Xho I和Xba I雙酶切得到約3 600 bp和500 bp左右2條帶（圖1）, 初步確定重組質(zhì)粒中有目的基因片段的正向插入。重組質(zhì)粒pPICZaC/hIL

13、18序列測定結(jié)果證實目的基因堿基序列按照預期方向定向插入表達載體, 且接口處序列正確, 未改變讀碼框架。 2.2 rhIL18的表達及鑒定 重組質(zhì)粒pPICZaC/hIL18轉(zhuǎn)化酵母菌X33后, 在YPD平板（Zeocin抗性）上挑取20個克隆, PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳分析, 對照組未見電泳條帶, 18個轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)預期500 bp左右特異性擴增條帶, 說明hIL18基因已經(jīng)整合至酵母基因組中。不同時間表達上清行SDSPAGE (圖2)和Western blot (圖3), 結(jié)果表明, 重組工程菌pPICZaC/hIL18/X33在相對分子質(zhì)量（Mr）約18 000處出現(xiàn)考馬斯染色條帶, 與預期hIL

14、18的Mr一致。 2.3 rhIL18的純化 利用Phenyl Sepharose 6 FF疏水層析純化rhIL18（圖4）, 分析確定rhIL18疏水層析最佳(NH4)2SO4飽和度為40%, 經(jīng)疏水層析分離樣品再次經(jīng)Q Sepharose HP陰離子交換層析分離, 得到一個活性洗脫主峰, NaCl的洗脫濃度為0.3 mol/L。 2.4 rhIL18刺激PBMC分泌IFN 分離PBMC, 分析純化的rIL18協(xié)同IL2對淋巴細胞刺激IFN的能力。結(jié)果顯示, 單獨加入 rhIL18或標準品rhIL18刺激的細胞上清中檢測不到IFN, 而同時加入亞適劑量IL2后, 細胞培養(yǎng)上清中IFN含量升高

15、, 并且隨 rhIL18及標準品rhIL18濃度增加而提高(圖5), 說明畢赤酵母制備的rhIL18具有同標準品rhIL18一樣的協(xié)同IL2對PBMC誘導IFN的能力。圖5 rIL18協(xié)同Il2誘導PBMCs分泌IFN 3 討論 選擇適合真核表達體系巴斯德畢赤酵母來表達hIL18。此表達體系既具備易于操作, 遺傳背景清楚, 生產(chǎn)成本低等原核生物的特點, 又具有真核生物的折疊、 分泌機制, 可以完成真核生物特異的蛋白酶解、 折疊、 糖基化等翻譯后修飾過程, 且生長速度快, 培養(yǎng)成分簡單, 適應工業(yè)化生產(chǎn)的需要8。畢赤酵母乙醇氧化酶基因（aoxI）是一個甲醇誘導表達的嚴格調(diào)控基因, 啟動活性高,

16、加入甲醇后可以迅速啟動轉(zhuǎn)錄, 而且N糖基化方式更接近高等真核生物9。交配因子信號肽部分已被廣泛用于酵母中合成和分泌異源蛋白質(zhì)。本研究把hIL18成熟肽連在交配因子信號肽的C端, AOXI啟動子控制下交配因子信號肽引導hIL18成熟肽在畢赤酵母中分泌表達。設計時, 為了得到不帶有Histag的蛋白, 在擴增hIL18片段時在其下游引物引入終止密碼子, 這使得純化相對困難, 但得到的hIL18由于沒有多余的氨基酸便于以后的動物實驗研究。 rhIL18在3.7 L發(fā)酵罐進行了初步的表達, 表達產(chǎn)物經(jīng)Lowry法定量和SDSPAGE半定量分析初步確定表達產(chǎn)量約為202 mg/L。首先確定rhIL18疏

17、水層析最佳(NH4)2SO4飽和度為40%, 然后用Phenyl Sepharose 6 FF疏水層析純化rhIL18。hIL18等電點為4.9左右2, 經(jīng)疏水層析純化的樣品再次經(jīng)Q Sepharose HP陰離子交換層析純化, pH選擇8.0, 純度達95%左右。對純化的rhIL18進行了刺激PBMC分泌IFN的實驗, 結(jié)果表明, rhIL18能夠協(xié)同IL2誘導PBMC分泌IFN, 作用效果同標準品rhIL18相當。 總之, 我們利用畢赤酵母表達體系制備了rhIL18, 產(chǎn)量約為202 mg/L。蛋白以分泌形式表達便于后期的純化, 建立了簡單快速rhIL18純化方法, 初步驗證了其協(xié)同IL2

18、誘導PBMCs分泌IFN的能力, 為以后開展體內(nèi)或體外生物學活性奠定了良好的基礎?！緟⒖嘉墨I】 1 Okamura H, Tsutsui H, Komatsu T, et al. Cloning of a new cytokine that induces IFN production by T cellsJ. Nature, 1995(2), 378: 88-91. 2 Ushio S, Namba M, Okura T, et al. Cloning of the cD NA for human IFNinducing factor, expression in Escherichia c

19、oli, and studies on the biologic activities of the proteinJ. J Immunol, 1996, 156(11): 4274-4279.3 Nakanishi K, Yoshimoto T, Tsutsui H, et al. Interleukin18 is a unique cytokine that stimulates both Th1 and Th2 responses depending on its cytokine milieuJ. Cytokine Growth Factor Re, 2001, 12(1): 53-72.4 Dao T, Mehal WZ, Crispe IN. IL18 augments perforindependent cytotoxicity of liver NKT cellsJ. J Immunol, 1998, 161(5): 2217-2222.5 Eberl M, Beck E, Coulson PS, et al. IL18 potentiates the adjuvant properties of IL12 in the induction of a s