Freeβ-HCG綜述

1、游離B人絨毛膜促性腺激素定量檢測(cè)試劑盒（化學(xué)發(fā)光法）第三部分綜述資料產(chǎn)品預(yù)期用途1. Free B-HCG及其臨床診斷絨毛膜促性腺激素（hCG）是由胎盤絨毛膜滋養(yǎng)層合體細(xì)胞分泌的糖蛋白激素， 分子量約為39KD,含有a和B兩個(gè)亞基?？煞忠?guī)則 HCG、缺口 HCG、規(guī)則游離a 亞基、規(guī)則游離B亞基和缺口游離B亞基多種形式，hCG在懷孕后6-8天內(nèi)出現(xiàn)在血清中，并在最后一次月經(jīng)之后50-80天內(nèi)達(dá)到最大值。B亞基是成簇的6個(gè)基因編碼， 但其中僅有兩個(gè)在胎盤中得到轉(zhuǎn)錄與表達(dá)1,2。大多數(shù)染色體非整倍體胎兒能引起母體血HCG水平的改變，因而可用檢測(cè)母體血清HCG濃度來篩查染色體數(shù)目異常的遺傳疾病，如D

2、own綜合征或21-三體綜合征, 以減少先天性缺陷患兒出生。這已成為產(chǎn)前篩查的一項(xiàng)重要指標(biāo)。Free B -HCG比HCG更具有分辨性，且游離B-HCG在產(chǎn)前血清篩查中具有穩(wěn)定性好，靈敏度高的優(yōu) 點(diǎn)，可同時(shí)用于母體孕早期和孕中期唐氏綜合癥的篩查。調(diào)查數(shù)據(jù)表明唐氏綜合癥在新生兒中的發(fā)病率約為1/6001/800,占小兒染色體病的70%80%。據(jù)估計(jì)我國(guó)目 前大約有60萬以上的唐氏綜合征患兒，每年出生的唐氏綜合征患兒可多達(dá) 27萬例左 右，平均每20分鐘就有1例唐氏綜合征患兒出生。而游離B -HCG在產(chǎn)前血清篩查 中具有穩(wěn)定性好，靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，可同時(shí)用于母體孕早期和孕中期篩查。因此，母 體血清中

3、人絨毛膜促性腺激素游離B亞單位的檢測(cè)對(duì)產(chǎn)前Down氏綜合征患兒篩查有非常重要的意義，且產(chǎn)前及時(shí)診斷染色體異常兒并終止妊娠，對(duì)降低出生缺陷、提高人口素質(zhì)將發(fā)揮十分重要的作用。B -HCG可用于異位妊娠。在異位妊娠診斷中， Free B -HCG有100%的靈敏度 和79%特異度，在有癥狀的患者中血清 Free B-HCG測(cè)定可識(shí)別異位妊娠，有利于密 切隨訪和減少輸卵管妊娠破裂的危險(xiǎn)性。滋養(yǎng)細(xì)胞疾病患者血清中Free B -HCG大幅度升高。Free B -HCG還可用來區(qū) 分部分性葡萄胎和完全性葡萄胎，以及葡萄胎和侵蝕性葡萄胎。羊水穿刺是診斷唐氏綜合癥的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于羊水穿刺是種侵入性的操作，

4、給患者帶來痛苦，在實(shí)際臨床工作中往往由于多種原因而難于實(shí)施。而血清學(xué)檢測(cè)具有無創(chuàng)傷性及敏感性的臨床診斷指標(biāo)取代羊水穿刺檢查評(píng)價(jià)進(jìn)行孕早期和孕中期的胎兒神經(jīng)管缺陷或唐氏綜合癥的初步篩查，具有重要實(shí)用價(jià)值。我們選題的目的就是研制高質(zhì)量的唐氏篩查的血清學(xué)指標(biāo)化學(xué)發(fā)光定量測(cè)定試劑 盒，建立一種科學(xué)、方便、經(jīng)濟(jì)的血清學(xué)FreeB -HCG檢測(cè)方法，為臨床診斷提供重要依據(jù)。2. Free B-HCG 的特性2.1 Free 0-HCG的分子結(jié)構(gòu)絨毛膜促性腺激素（hCG）是由胎盤絨毛膜滋養(yǎng)層合體細(xì)胞分泌的糖蛋白激素， 分子量約為39KD,含有a和B兩個(gè)亞基?？煞忠?guī)則 HCG、缺DHCG、規(guī)則游離a亞 基、規(guī)

5、則游離B亞基和缺口游離B亞基多種形式 1。hCG的a -亞基的分子量約為 13000,是92個(gè)氨基酸的糖肽，在52和78位大冬酰胺殘基N-連接寡糖側(cè)鏈，鏈中含有 10個(gè)Cys殘基，形成5個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵（7-31、1O6O、2882、3284、5987）維持結(jié) 構(gòu)穩(wěn)定。hCG的a -亞基的生物特性和其他垂體糖蛋白激素，如卵泡刺激素（ FSH）、 黃體生成激素（LH）、促甲狀腺激素（TSH）的a -亞基相同。B-亞基的分子量約15000, 是145個(gè)氨基酸組成，鏈中含有12個(gè)Cys殘基，形成6個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵（931 OO、26110、 2372、9-57、34 88、3890）,這些二硫鍵的存在決定了

6、 hCG的二級(jí)結(jié)構(gòu)，N端連接 的寡糖附在13和30位大冬酰胺殘基上，121, 127, 132, 138位4個(gè)絲氨酸連接（O端連 接）寡糖鍵結(jié)合在C端肽上2。O-連寡糖主要有兩種形式，三糖和六糖。B -亞基為HCG 特異性鏈，可被單克隆抗體檢測(cè)，是一個(gè)較好的標(biāo)志物。2.2 Free B-HCG的生物學(xué)功能Free B -HCG是現(xiàn)在唯一知道的可以同時(shí)用于一期和二期篩查的標(biāo)記物。 懷有唐 氏綜合癥胎兒的母血中Free B-HCG水平高于健康孕婦，而在懷18染色體單體異常 胎兒母血中戲劇性的降低。唐氏綜合癥母血Free B-HCG平均水平為1.9MoM ,健康 母血為1.0MoM。由于完整的hCG

7、水平在DS患者母血中只有1.3MoM,不能明顯鑒 別出DS患者。2.3 產(chǎn)品預(yù)期用途大多數(shù)染色體非整倍體胎兒能引起母體血Free B-HCG水平的改變，因而可用檢測(cè)母體血清Free B -HCG濃度來篩查染色體數(shù)目異常的遺傳疾病，如Down綜合征 或21-三體綜合征，以減少先天性缺陷患兒出生。如果胎兒患有唐氏綜合癥，則孕中 期母體血清中HCG的游離B亞基水平會(huì)在懷孕中期增長(zhǎng)超過100%2,3。這已成為產(chǎn)前篩查的一項(xiàng)重要指標(biāo)。Free B-HCG具有分辨性強(qiáng)，且Free B -HCG在產(chǎn)前血清篩查中具有穩(wěn)定性好，靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，可同時(shí)用于母體孕早 期和孕中期唐氏綜合癥的篩查。Free B-HCG

8、也可用于異位妊娠的診斷，異位妊娠的患者血清Free B-HCG濃度大概為28-180IU/L, B -HCG倍增時(shí)間延長(zhǎng)，可達(dá)38d。滋養(yǎng)細(xì)胞疾病患者血清中Free B -HCG大幅度升高。當(dāng)血中可測(cè)到高濃度的 Free B -HCG時(shí)高度提示滋養(yǎng)細(xì)胞疾病。Free B -HCG還可用來區(qū)分部分性葡萄 胎和完全性葡萄胎，以及葡萄胎和侵蝕性葡萄胎。本產(chǎn)品的預(yù)期用途為診斷唐氏綜合癥患兒，異位妊娠和滋養(yǎng)細(xì)胞疾病等疾病。 二、產(chǎn)品描述1 .化學(xué)發(fā)光免疫分析20世紀(jì)70年代中期Arakawe首次報(bào)道用發(fā)光信號(hào)進(jìn)行分析檢測(cè)，即利用發(fā)光的 化學(xué)反應(yīng)(chemiluminescence, CL)和生物反應(yīng)(b

9、ioluminescence, BL)分析超微 量物質(zhì)，特別是用于臨床免疫分析中檢驗(yàn)超微量活性物質(zhì)。這一方法，從實(shí)驗(yàn)室的稀有技術(shù)過渡到臨床醫(yī)學(xué)的常規(guī)檢測(cè)手段，近十年來獲得了很大的發(fā)展。化學(xué)發(fā)光免疫 分析(chemiluminescence immunoassayCLIA )以其靈敏度高 (attomole 即 10-18mol), 快速(幾秒鐘內(nèi)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號(hào)，有的情況下信號(hào)可持續(xù)幾小時(shí))，簡(jiǎn)便，測(cè)試中不使用有害的試劑，因此成為非放射性免疫分析法中最有前途的方法之一。我公司采用的化學(xué)發(fā)光免疫分析方法，是利用酶催化發(fā)光底物，則發(fā)光底物發(fā)生 化學(xué)反應(yīng)并釋放出大量的能量，產(chǎn)生激發(fā)態(tài)中間體。這種激發(fā)

10、態(tài)中間體，當(dāng)其回到穩(wěn) 定的基態(tài)時(shí)，可同時(shí)發(fā)射出光子，利用發(fā)光信號(hào)測(cè)量?jī)x器即可測(cè)量光量子產(chǎn)額，該光量子產(chǎn)額與樣品中的待測(cè)物質(zhì)的量成正比。由此可以建立標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算樣品中待測(cè) 物質(zhì)的含量。與幾種傳統(tǒng)的免疫學(xué)檢測(cè)方法對(duì)比而言，無論從靈敏度、檢測(cè)時(shí)間、線性范圍、 試劑的穩(wěn)定性、有無環(huán)境污染等方面對(duì)比，化學(xué)發(fā)光法的優(yōu)勢(shì)都顯得極為突出?；瘜W(xué)發(fā)光法作為一種20世紀(jì)90年代才迅速興起的一種新型檢測(cè)技術(shù)， 除具有檢 測(cè)方法簡(jiǎn)單快速的優(yōu)點(diǎn)之外，還具有靈敏度高，檢測(cè)范圍寬等優(yōu)點(diǎn)，因此越來越多的 受到臨床診斷實(shí)驗(yàn)室的關(guān)注，是近年來該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。而我公司經(jīng)過多年來的深 入研究，已經(jīng)開發(fā)建立了化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)平臺(tái)，

11、這就為下一步各種檢測(cè)試劑盒的建 立打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。2 .檢測(cè)原理游離B人絨毛膜促性腺激素定量檢測(cè)試劑盒（化學(xué)發(fā)光法）是基于酶聯(lián)免疫分析技術(shù)和化學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)建立的檢測(cè)體系。 試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法原理，將B -HCG 單克隆抗體包被微孔反應(yīng)板作為固相載體， 辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記游離B -HCG 單克隆抗體作為酶結(jié)合物，采用一步法反應(yīng)模式。在微孔板各孔中分別加入標(biāo)準(zhǔn)品、 樣本后，然后加入酶結(jié)合物，則標(biāo)準(zhǔn)品、樣品中所含的 Free B-HCG將會(huì)與之形成 抗體-抗原-抗體-酶復(fù)合物。洗去未結(jié)合的酶結(jié)合物后，加入化學(xué)發(fā)光底物，其發(fā)光強(qiáng) 度與Free B-HCG含量成正比。利用標(biāo)準(zhǔn)品所建立的

12、標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以計(jì)算出樣本中 FreeB -HCG 的含量。雙抗體夾心法原理如下圖所示：3 .主要原材料來源本試劑盒涉及到的主要原材料均為外購(gòu)產(chǎn)品，來源如下：Free B-HCG抗原：純化高值尿樣，經(jīng)DELFIA時(shí)間分辨熒光法甲胎蛋白/游離hCG B亞基雙標(biāo)試劑盒測(cè)定其靶值為13421ng/ml0B-HCG包被抗體：購(gòu)自依美諾生物HRP-Free-B -HCG單抗：購(gòu)自依美諾生物4 .主要生產(chǎn)工藝過程4.1包被板的生產(chǎn)4.2酶結(jié)合物的配制與分裝4.3標(biāo)準(zhǔn)品的配制與分裝4.4 發(fā)光底物的配制與分裝4.5 試劑盒組裝流程圖5 .標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品的制備方法及量值的溯源標(biāo)準(zhǔn)品是經(jīng)標(biāo)定的在試劑盒中配備的校準(zhǔn)

13、物質(zhì)。標(biāo)準(zhǔn)品內(nèi)含有一定量的抗原物質(zhì)，根據(jù)不同的抗原含量以及這些抗原在測(cè)定中不同的發(fā)光值，即可建立校準(zhǔn)曲線， 用于計(jì)算待測(cè)樣本中該物質(zhì)的含量。標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法是在選定的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液中添加一定量的抗原，用DELFIA時(shí)間分辨熒光法甲胎蛋白/游離hCGB亞基雙標(biāo)試劑盒測(cè)定的臨床進(jìn)行賦值。定值后 的標(biāo)準(zhǔn)品采用逐級(jí)稀釋法即將高濃度的抗原通過適當(dāng)?shù)南♂?，配制成系列濃度的?biāo)準(zhǔn)品。質(zhì)控品主要是用于試劑盒的內(nèi)部質(zhì)量控制，因此質(zhì)控品不需要進(jìn)行賦值，而是用其相應(yīng)的試劑盒對(duì)其進(jìn)行多次測(cè)量， 給出允許范圍。質(zhì)控品的制備方法同標(biāo)準(zhǔn)品的配 制，也采用逐級(jí)稀釋法將高濃度的抗原通過適當(dāng)?shù)南♂專渲瞥傻?、高兩個(gè)梯度的質(zhì)控品，再用

14、試劑盒標(biāo)定其濃度，通過 20-30次的測(cè)定，結(jié)果刪除大于i2SD的數(shù)據(jù)， 計(jì)算其平均值及標(biāo)準(zhǔn)差，得出質(zhì)控品的允許測(cè)量范圍。 三、有關(guān)生物安全性方面的說明試劑盒中所用的主要原材料有B -HCG單克隆抗體、酶標(biāo)Free B-HCG單克隆抗 體、Free B-HCG抗原、牛血清白蛋白，F(xiàn)ree B-HCG抗原經(jīng)測(cè)定抗-HCV、抗-HIV、 HBSAg、TRUST(anti-TP)均為陰性，在一定程度上保證了使用的安全性。其他原料不含有任何病原體和任何人源性的組織和體液。所使用的抗體是經(jīng)過供貨商純化處理的，牛血清白蛋白在從牛血清提取過程中已經(jīng)過多道工藝處理。因此， 本產(chǎn)品雖涉及到以上的動(dòng)物源性生物材料

15、的使用，但在其運(yùn)輸、使用過程中產(chǎn)品本身 對(duì)使用者和環(huán)境均是安全的。在產(chǎn)品使用過程中的所檢測(cè)的血清樣本具有潛在的污染性，血清樣本及其所接觸過的物品均應(yīng)作為潛在的傳染性物質(zhì)，廢棄時(shí)必須按照國(guó)家規(guī)定的醫(yī)療垃圾處理方法 進(jìn)行處理。四、產(chǎn)品主要研究結(jié)果的總結(jié)和評(píng)價(jià)1 .主要研究結(jié)果的總結(jié)試劑盒的研究過程，主要包括生物活性原材料的篩選，包被板、酶結(jié)合物和標(biāo)準(zhǔn) 品的生產(chǎn)工藝研究、反應(yīng)體系研究、正常參考值的確定和穩(wěn)定性研究。現(xiàn)將主要研究 結(jié)果總結(jié)如下：1.1 生物活性原材料的篩選篩選了高特異性的B -HCG單克隆抗體用于包被板的制備，F(xiàn)ree B -HCG純化的 純品用于配制標(biāo)準(zhǔn)品，HRP標(biāo)記的Free B-

16、HCG單克隆抗體用于配制酶結(jié)合物，應(yīng)用這三種主要原材料建立起了 Free B-HCG測(cè)定的方法和模式，為試劑盒的研制打 下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。1.2 包被板的制備：包被液采用Tris-HCl緩沖液（pH=7.4）作為包被緩沖液，包被濃度為1/5000,于28C過夜進(jìn)行吸附包被。采用含1%BSA的（pH7.4）溶液，37c放置3hr,進(jìn)行 封閉，2.5%蔗糖的（pH7.4）溶液，37c放置3hr,進(jìn)行保護(hù)。然后進(jìn)行干燥，封袋。 1.3酶結(jié)合物的制備酶結(jié)合物采用0.05M pH7.4 Tris-HCl緩沖液+BSA +Casein+IPBC溶液作為稀釋液， 首批原酶配制酶結(jié)合物的工作濃度為1/3000。

17、1.5 標(biāo)準(zhǔn)品的制備標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液選用含BSA的0.05M pH7.4的Tris-NaCl溶液作為稀釋液，配制的標(biāo) 準(zhǔn)品濃度依次為：0ng/ml, 2 ng/ml, 5 ng/ml, 20 ng/ml, 100ng/ml, 200ng/ml。1.6 反應(yīng)體系研究結(jié)果1.6.1 反應(yīng)模式：20卜標(biāo)本，加100ul酶結(jié)合物，37c反應(yīng)60分鐘，純化水洗板5次，加 入100仙等比混合的發(fā)光底物，室溫避光5分鐘檢測(cè)結(jié)果。標(biāo)準(zhǔn)品防腐劑選用NaN3,酶 結(jié)合物則選用Proclin-300作為系統(tǒng)中的生物防腐劑。1.6.2 正常參考值的確定：測(cè)定 840份正常人（含健康男性、非妊娠女性以及絕經(jīng)后 女性）標(biāo)本，

18、97.5%的正常人低于0.30ng/mL.1.7 穩(wěn)定性研究我們所做的穩(wěn)定性試驗(yàn)，主要采用半成品加速破壞（37c放置）穩(wěn)定性試驗(yàn)和整 盒正常保存條件下（28C）實(shí)際放置至保質(zhì)期后2個(gè)月的穩(wěn)定性試驗(yàn)。由該試驗(yàn)結(jié) 果可知，加速破壞試驗(yàn)的37c放置7天試驗(yàn)（相當(dāng)于4c放置12個(gè)月）試劑盒均能達(dá)到 各項(xiàng)質(zhì)控要求。因此，初步將該試劑盒的有效期定為12個(gè)月。2 .試劑盒性能評(píng)價(jià)總結(jié)：2.1 分析靈敏度：0.05 ng/ml2.2 分析特異性：測(cè)定含量為1400 U/L的整分子hCG,測(cè)定結(jié)果不高于0.05ng/ml; 測(cè)定含量為324 U/ml的hTSH,測(cè)定結(jié)果應(yīng)不高于 0.05 ng/ml; 256

19、U/L的hFSH, 測(cè)定結(jié)果應(yīng)不高于 0.05 ng/ml; 250 U/L的hLH ,測(cè)定結(jié)果應(yīng)不高于 0.05 ng/ml。2.3 干擾物質(zhì)分析：膽紅素、血紅蛋白、甘油三脂不影響檢測(cè)。2.4 精密性：分析內(nèi)變異小于15%,分析間變異小于20%;2.5 穩(wěn)定性：試劑盒37c貯存7天和2-8C儲(chǔ)存12個(gè)月都能達(dá)到各項(xiàng)性能指標(biāo)。2.6 臨床性能：臨床研究結(jié)果顯示，與北京源德生物醫(yī)學(xué)工程有限公司的游離絨毛膜 促性腺激素B亞單位（Free B-HCG）定量檢測(cè)試劑盒（化學(xué)發(fā)光法）對(duì)比測(cè)定，有 較高的符合率和相關(guān)性。五、其他1國(guó)內(nèi)外同類產(chǎn)品的批準(zhǔn)上市情況目前國(guó)內(nèi)已批準(zhǔn)上市的游離B人絨毛膜促性腺激素定量

20、檢測(cè)試劑盒及其方法和特點(diǎn) 如下表所?。涸噭┖忻Q生產(chǎn)商注冊(cè)號(hào)批準(zhǔn)日期有效日期DELFIA時(shí)間分辨熒光 法游離hCGB業(yè)基試劑 盒芬蘭PE公司國(guó)食藥監(jiān)械 （進(jìn)）字2006第3401080號(hào)2006.06.182010.06.17DELFIA時(shí)間分辨熒光 法甲胎蛋白/游離hCG B業(yè)基雙標(biāo)試劑盒芬蘭PE公司國(guó)食藥監(jiān)械 （進(jìn)）字2006第 3401221號(hào)2006.07.202010.07.19游離人絨毛膜促性腺激素B亞單位（F-hCG B ） 診斷試劑盒化學(xué)發(fā)光 法北京倍愛康 生物國(guó)食藥監(jiān)械 （準(zhǔn)）字2006第 3400903號(hào)2006.10.192010.10.18游離人絨毛膜促性腺激素B亞單位

21、（F-hCG B ） 診斷試劑盒（磁微粒分離酶聯(lián)免疫法）北京倍愛康 生物國(guó)食藥監(jiān)械 （準(zhǔn)）字2005第 3401226號(hào)（更）人絨毛促性腺激素游離B亞單位（Free- 0-HCG）定量檢測(cè)試劑盒（化學(xué)發(fā)光法）康華生物魯食藥械（準(zhǔn)） 字 2008 第24002472相關(guān)產(chǎn)品所采用的技術(shù)方法比較以上所有產(chǎn)品的反應(yīng)原理均是基于抗原抗體反應(yīng)的免疫學(xué)檢測(cè)原理，所不同的是在組成整個(gè)反應(yīng)體系的某些方面采用了某種特別的技術(shù)。以上國(guó)內(nèi)的試劑盒無論是酶聯(lián)免疫法、 化學(xué)發(fā)光法還是時(shí)間分辨熒光分析法， 除 檢測(cè)信號(hào)有不同外，其技術(shù)原理包括夾心法和競(jìng)爭(zhēng)法，這主要與所選用的抗原抗體有 關(guān)。在產(chǎn)品的使用方面，都為手工操作，

22、半自動(dòng)檢測(cè)儀器進(jìn)行檢測(cè)，儀器及試劑成本 相對(duì)較低，適合中小醫(yī)院使用。我公司研制開發(fā)的游離B人絨毛膜促性腺激素定量檢測(cè)試劑盒（化學(xué)發(fā)光法）， 采用雙抗體夾心測(cè)抗原的方法，選用了高特異性的單克隆抗體進(jìn)行包被， 其基本原理 與多數(shù)廠家一致。同時(shí)我公司開發(fā)的試劑操作簡(jiǎn)便， 結(jié)果快速準(zhǔn)確，適合廣大臨床醫(yī) 院使用。3臨床應(yīng)用情況大多數(shù)染色體非整倍體胎兒能引起母體血 HCG水平的改變，因而可用檢測(cè)母體 血清HCG濃度來篩查染色體數(shù)目異常的遺傳疾病，如Down綜合征或21-三體綜合征, 以減少先天性缺陷患兒出生。這已成為產(chǎn)前篩查的一項(xiàng)重要指標(biāo)。Free-p -HCG比HCG更具有分辨性，且游離B-HCG在產(chǎn)前血清篩查中具有穩(wěn)定性好，靈敏度高的優(yōu) 點(diǎn)，可同時(shí)用于母體孕早期和孕中期唐氏綜合癥的篩查。B -HCG可用于異位妊娠。在異位妊娠診斷中， Free B -HCG有100%的靈敏度 和79%特異度，在有癥狀的患者中血清 Free B-HCG測(cè)