院感細(xì)菌培養(yǎng)操作

1、1. 目的: 醫(yī)院是病原微生物較集中,抵抗力低的人群密集的地方,加之化療、放療等手段的采用，影響病人免疫機能下降，大量使用抗生素，引起耐藥菌株增多，菌群失調(diào)，以及先進醫(yī)療儀器廣泛應(yīng)用等原因，增加消毒滅菌的難度，致使院內(nèi)感染已成為當(dāng)前醫(yī)療實踐的嚴(yán)重障礙，直接影響醫(yī)療效果。進一步規(guī)范院內(nèi)感染監(jiān)測標(biāo)本的程序，更好、更快檢測病原微生物的生長情況，預(yù)防醫(yī)院感染的發(fā)生。2. 設(shè)備、試劑與材料2.1 VITEK 2 compact鑒定藥敏分析系統(tǒng)2.2 VITEK 32鑒定藥敏分析系統(tǒng)2.3美國FORMA級生物安全柜2.4顯微鏡2.5酒精燈2.6接種環(huán)2.7恒溫培養(yǎng)箱2.8各種培養(yǎng)基 2.9 革蘭氏染色液2

2、.10觸酶試劑2.11氧化酶試劑2.12移液器2.13無菌吸嘴3. 院感標(biāo)本采集31空氣的采樣311采樣時間 選擇消毒處理后與進行醫(yī)療活動之前期間采樣。312采樣高度 與地面垂直高度80-150CM。313布點方法 室內(nèi)面積30m2，設(shè)一條對角線上取三點，即中心一點，兩端各距墻1m處各取一點；室內(nèi)面積30m2，設(shè)東、西、南、北、中5點，其中東、西、南、北點均距墻1m。314采樣方法 用9cm直徑普通營養(yǎng)瓊脂平板在采樣點暴露5min后送檢。32物體表面采樣321采樣時間 選擇消毒處理后4小時內(nèi)進行采樣。322采樣面積 被采表面100cm2，取全部表面；被采表面100cm2，則取100cm2。32

3、3采樣方法 用5×5 cm2的標(biāo)準(zhǔn)來滅菌規(guī)格板，放在被檢物體表面，用無菌規(guī)格板，放在被檢物體表面，用浸有無菌生理鹽水采樣液的棉拭子1支，在規(guī)格板內(nèi)橫豎往返各涂抹5次，并隨之轉(zhuǎn)動棉拭子，連續(xù)采樣1-4個規(guī)格板面積，剪支手接觸部位，將棉拭子放入裝10ml采樣液的試管中送檢。門把手等小型物體則采用棉拭子直接涂抹物體的方法采樣。33醫(yī)護人員手采樣331采樣時間 在接觸病人、從事醫(yī)療活動前進行采樣。332采樣面積及方法 被檢人五指并攏，將浸有無菌生理鹽水采樣液的棉拭子一枝在雙手指曲面從指跟到指端來回涂擦各兩次（一只手涂擦面積30 cm2），并隨之轉(zhuǎn)動采樣棉拭子，剪去手接觸部位，將棉拭子放入裝有

4、10ml采樣液的試管內(nèi)送檢。采樣面積按平方厘米（cm2）計算。34醫(yī)療用品采樣341采樣時間 在消毒或滅菌處理后，存放有效期內(nèi)采樣。342采樣方法 右用破壞性方法取樣的醫(yī)療用品，如輸液（血）器、注射器和注射針等，取其中的一部分放培養(yǎng)液中培養(yǎng)。對不能用破壞性方法取樣的特殊醫(yī)療用品，可用浸有無菌生理鹽水采樣液的棉拭子在被檢物體表面涂抹采樣，被采表面100cm2，取全部表面；被采表面100cm2，取100cm2。35使用中消毒劑的采集351采樣時間 采取使用中的消毒劑。352采樣方法 在無菌條件下，用無菌注射器抽取1ml被檢樣品，加入10ml稀釋液混勻。（對于醇類與酚類消毒劑稀釋液用滅菌生長鹽水；對

5、于含氯消毒劑、含碘消毒劑、過氧化物消毒劑，需在滅菌生理鹽水中加入0.1%硫代硫酸鈉；對于洗必泰、季銨鹽類消毒劑，需在滅菌生理鹽水中加入3%（w/v）吐溫80和0.3%卵磷脂；對于醛類消毒劑，需在滅菌生理鹽水中加入0.3%甘氨酸；對于含有表面活性劑的各種消毒劑，需在滅菌生理鹽水中加入3%（w/v）吐溫80，以中和被檢樣液的殘效作用。）36內(nèi)鏡的采樣361咽喉鏡、支纖鏡 用10ml戊二醛中和液沖洗內(nèi)鏡后，送檢實驗室。362胃鏡、消化鏡、宮腔鏡 用10ml0.1%硫代硫酸鈉中和液沖洗內(nèi)鏡后，送檢實驗室。363鼻咽鏡、過氧化氫消毒的腔鏡類 用10ml生理鹽水中和液沖洗內(nèi)鏡后，送檢實驗室。37透析液的采

6、樣 用滅菌的空試管取透析液10ml送檢。4. 院感標(biāo)本的運送及交接簽收41標(biāo)本的采集411空氣標(biāo)本的采集由臨床科室負(fù)責(zé)完成，標(biāo)本采集完畢，由臨床各科在規(guī)定的時間內(nèi)將標(biāo)本安全送回實驗室。412物體表面、醫(yī)務(wù)人員手、消毒劑、內(nèi)鏡等由院感科負(fù)責(zé)組織采樣，在規(guī)定時間內(nèi)將標(biāo)本安全送達(dá)實驗室。42采樣后必須盡快對樣品進行相應(yīng)指標(biāo)的檢測，送檢時間不得超過6小時，若樣品保存于0-4條件時，送檢時間不得超過24小時。43標(biāo)本收回實驗室后,將標(biāo)本的信息登記在“院感監(jiān)測登記本”上。44微生物室工作人員的驗收 根據(jù)微生物室院感標(biāo)本拒收標(biāo)準(zhǔn)進行檢查，對不符合要求的，將拒收，立即退回給送檢人員，指出問題，告知標(biāo)本重取，所

7、有拒收標(biāo)本均需在標(biāo)本拒收記錄本上登記。拒收情況如下：441空氣培養(yǎng)平板數(shù)目擊者不正確（房間小于30平方米做3個平板培養(yǎng)，房間大于30平方米做5個平板培養(yǎng)）。442未注明標(biāo)本采集科別、來源和培養(yǎng)目的。443標(biāo)本明顯受污染。5. 檢測步驟 見本文件末面流程圖51空氣標(biāo)本的檢測511細(xì)菌室收到標(biāo)本后，將標(biāo)本編寫當(dāng)日日期，用平板壓住驗單，直接放入35培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時后，觀察結(jié)果。512有菌生長，則挑取可疑菌落進行鑒定，排除金黃色葡萄球菌、溶血鏈球菌、銅綠假單胞菌等致病微生物的檢出。513結(jié)果計算及菌落換算 空氣細(xì)菌菌落總數(shù)（cfu/m3）=50000N/AT，式中A平板面積，cm2；T平板暴露時間，

8、min；N平均菌落數(shù)，cfu/平皿。即平皿上1個菌落等于空氣中菌落數(shù)為157 cfu/m3 ，如果標(biāo)本為3個點時換算=平皿上的菌落數(shù)×157÷點數(shù)。52物體表面樣本檢測521細(xì)菌室收到標(biāo)本后，將標(biāo)本編號，振搖80次后，吸500ul于普通瓊脂平板中，把平板搖均勻，放入35培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時后，觀察結(jié)果。522有菌生長，則挑取可疑菌落進行鑒定，排除金黃色葡萄球菌、溶血鏈球菌、銅綠假單胞菌等致病微生物的檢出，如為兒科、愛嬰?yún)^(qū)、新生兒科、兒科ICU的標(biāo)本時，還要排除沙門氏菌的檢出。523結(jié)果計算及菌落換算 物體表面細(xì)菌菌落總數(shù)（cfu/c m2）=平皿上菌落數(shù)×采樣液稀釋

9、倍數(shù)（A）/采樣面積（cm2）。采樣液稀釋倍數(shù)即是采集液總量與接種的采集液量之比值，即平皿上1個菌落等到于物體表面上菌落數(shù)為0.2cfu/cm2。53醫(yī)護人員手樣本檢測531將標(biāo)本編號，振搖80次后，吸500ul于普通瓊脂平板中，如為兒科、愛嬰?yún)^(qū)、新生兒科、兒科ICU的標(biāo)本時，加做一個HE平板，以監(jiān)測沙門氏菌的檢出。把平板搖均勻，放入35培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時后，觀察結(jié)果。532有菌生長，則挑取可疑菌落進行鑒定，排除金黃色葡萄球菌、溶血鏈球菌、銅綠假單胞菌等致病微生物的檢出。533結(jié)果計算及菌落換算 手細(xì)菌菌落總數(shù)（cfu/c m2）=平皿上菌落數(shù)×采樣液稀釋倍數(shù)（A）/30×

10、2（cm2），即平皿上1個菌落等到于物體表面上菌落數(shù)為0.33cfu/cm2。54滅菌或一次性醫(yī)療用品樣本檢測541樣本采集完成后，接種于肉湯培養(yǎng)基，置35培養(yǎng)箱培養(yǎng)7天，每天觀察一次，培養(yǎng)基有混濁則轉(zhuǎn)種普通平板繼續(xù)培養(yǎng)，觀察最后結(jié)果。542有菌生長，則挑取可疑菌落進行鑒定，結(jié)果報告是否檢出細(xì)菌。55使用中消毒劑551細(xì)菌室收到標(biāo)本后，將標(biāo)本編號，振搖80次后，吸500ul于普通瓊脂平板中，如為兒科、愛嬰?yún)^(qū)、新生兒科、兒科ICU的標(biāo)本時，加做一個HE平板，以監(jiān)測沙門氏菌的檢出。把平板搖均勻，放入35培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時后，觀察結(jié)果。另接種于1個沙保勞培養(yǎng)基，置28培養(yǎng)箱培養(yǎng)7天，每天觀察一次，觀

11、察最后結(jié)果。552有菌生長，則挑取可疑菌落進行鑒定，結(jié)果報告是否檢出細(xì)菌及真菌。553結(jié)果計算及菌落換算 使用中消毒劑細(xì)菌菌落總數(shù)（cfu/ ml ）=平皿上菌落平均數(shù)×采樣液稀釋倍數(shù)（A）/采樣體積（1ml），即平皿上1個菌落等于消毒劑中菌落數(shù)為10 cfu/ ml。56滅菌效果監(jiān)測561壓力蒸汽滅菌效果監(jiān)測 采用嗜熱脂肪芽胞桿菌菌片，放于溴甲酚紫蛋白胨水指示劑中，標(biāo)本送檢后，把里面的玻璃壓碎，置于56培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時，如指示劑顏色為紫色，說明無嗜熱脂肪芽胞桿菌生長；如指示劑顏色為黃色則說明有嗜熱脂肪芽胞桿菌生長。562氣體滅菌效果監(jiān)測 采用枯草芽胞桿菌菌片，放于溴甲酚紫蛋白胨水

12、指示劑中，標(biāo)本送檢后，置于35培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時，如指示劑顏色為紫色，說明無枯草芽胞桿菌生長；如指示劑顏色為黃色則說明有芽枯草胞桿菌生長。57內(nèi)鏡標(biāo)本檢測 571將標(biāo)本編號，用旋渦器充分震蕩（振搖80次），取0.5ml，加入直徑9CM的普通瓊脂平板上，把平板搖均勻，放入35培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時后計數(shù)，觀察結(jié)果。572有菌生長，則挑取可疑菌落進行鑒定，排除金黃色葡萄球菌、溶血鏈球菌、銅綠假單胞菌等致病微生物的檢出。573結(jié)果計算及菌落換算 細(xì)菌菌落數(shù)/鏡=平皿菌落數(shù)×20 58透析液樣本檢測581將標(biāo)本編號，振搖80次后，吸200ul于普通瓊脂平板中，反平板搖均勻，放入35培養(yǎng)箱培養(yǎng)48

13、小時，觀察結(jié)果。582有菌生長，則挑取可疑菌落進行鑒定，排除金黃色葡萄球菌，、溶血鏈球菌、銅綠假單胞菌等致病微生物的檢出。583結(jié)果計算：透析液細(xì)菌菌落總數(shù)=平皿菌落數(shù)×56. 質(zhì)量控制61做好培養(yǎng)基及樣本采集液的質(zhì)量控制，確保其無菌以及適宜于細(xì)菌的生長。62標(biāo)本采集嚴(yán)格按照采集要求進行。63做好培養(yǎng)箱的溫度控制。7. 各類環(huán)境空氣、物體表面、醫(yī)護人員手細(xì)菌菌落總數(shù)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，見下表類別范圍標(biāo)準(zhǔn)空氣cfu/m3物體表面cfu/cm2醫(yī)護人員手cfu/cm2類層流潔凈手術(shù)室、層流潔凈病房1055類普通病房、產(chǎn)房、嬰兒室、早產(chǎn)兒室、普通保護性隔離室、供應(yīng)室無菌室、燒傷病房、重癥監(jiān)護病房20

14、055類兒科病房、婦產(chǎn)科檢查室、注射室、換藥室、治療室、供應(yīng)室清潔室、急診室、化驗室、各類普通病房和房間5001010類傳染病科及病房-151572致病性微生物 不得檢出金黃色葡萄球菌，、溶血鏈球菌及其他致病性微生物。在可疑污染情況下進行相應(yīng)指標(biāo)的檢測，母嬰同室、早產(chǎn)兒室、嬰兒室、新生兒及兒科病房的物體表面和醫(yī)護人員手上，不得檢出沙門氏菌。73醫(yī)療用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)731進入人體無菌組織、器官或接觸破損皮膚、粘膜的醫(yī)療用品必須無菌。732接觸粘膜的醫(yī)療用品 細(xì)菌菌落總數(shù)應(yīng)20cfu/g或100 cm2，致病性微生物不得檢出。733接觸皮膚的醫(yī)療用品 細(xì)菌菌落總數(shù)應(yīng)200cfu/g或100 cm2，致

15、病性微生物不得檢出。74使用中消毒劑衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn) 使用中消毒劑：細(xì)菌菌落總數(shù)應(yīng)100 cfu/ml；致病性微生物不得檢出。75內(nèi)鏡消毒后的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn) 細(xì)菌菌落總數(shù)應(yīng)20cfu/件；致病性微生物不得檢出。76透析液消毒后的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)761入水口細(xì)菌菌落總數(shù)應(yīng)200cfu/ml；致病性微生物不得檢出。762出水口細(xì)菌菌落總數(shù)2000cfu/ml；致病性微生物不得檢出。8. 院感標(biāo)本報告的錄入81在電腦點擊“院感系統(tǒng)”，進入“院內(nèi)檢測”，在“環(huán)境衛(wèi)生學(xué)及消毒滅菌效果監(jiān)測結(jié)果”中根據(jù)檢測的結(jié)果輸入相關(guān)的項目。輸入抽檢科別、標(biāo)本類別、抽檢項目、報告結(jié)果/細(xì)菌總數(shù)、標(biāo)本單位、檢出細(xì)菌、送檢日期、報告日期、檢驗者、

16、院感受辦抽查、次數(shù)。結(jié)果輸完后按保存鍵，審核無誤后按審核鍵。按錄入鍵繼續(xù)下一標(biāo)本的錄入。錄入完畢退出系統(tǒng)。82陰性院內(nèi)感染監(jiān)測標(biāo)本的報告方式821空氣、物體表面、消毒液、滅菌生物監(jiān)測菌片培養(yǎng)結(jié)果陰性發(fā)報告為“無菌生長”。822無菌物品培養(yǎng)結(jié)果陰性發(fā)報告為“無細(xì)菌生長”。83陽性院內(nèi)感染監(jiān)測標(biāo)本的報告方式831空氣培養(yǎng)結(jié)果陽性發(fā)報告為“XX cfu/m3”。832物體表面培養(yǎng)結(jié)果陽性發(fā)報告為“XX cfu/cm2”。833消毒液培養(yǎng)結(jié)果陽性發(fā)報告為“XX cfu/ml”。834生物監(jiān)測菌片培養(yǎng)結(jié)果陽性發(fā)報告為“檢出枯草芽胞桿菌/嗜熱脂肪芽胞桿菌”。835無菌物品陽性發(fā)報告為“檢出細(xì)菌”。9. 參考文獻1中華人民共和國衛(wèi)生部，制定，醫(yī)院感染管理文件匯編，附錄A：采樣及檢查方法。2 任南，主編， 實用醫(yī)院感染監(jiān)測方法與技術(shù)，湖南，湖南科學(xué)技術(shù)出版社，2008.3.院感標(biāo)本處理流程圖院感標(biāo)本按類編號消毒液培養(yǎng)震蕩標(biāo)本約20秒，吸500ul到普通平板上置35培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時后看結(jié)果另吸500ul到沙保勞平板上置28培養(yǎng)箱培養(yǎng)7天后看結(jié)果