重癥急性胰腺炎大鼠IL8IL10及NFκB的表達(dá)

1、重癥急性胰腺炎大鼠IL-8 IL-10及NF-B的表達(dá) 作者：金牡丹 周智林 傅志泉【摘要】 目的 通過觀察重癥急性胰腺炎（SAP）大鼠白介素-8（IL-8）、白介素-10（IL-10）及胰腺NF-B的表達(dá)，探討重癥急性胰腺炎的發(fā)生發(fā)展機制。方法 將40只大鼠隨機分為正常對照組（假手術(shù)組）、模型組（重癥急性胰腺炎組），每組20只，造模后24h測定血淀粉酶、IL-8及IL-10，切取相同部位的胰腺組織觀察組織病理學(xué)改變，進(jìn)行NF-B的免疫組織化學(xué)染色。 結(jié)果 模型組大鼠血清淀粉酶、IL-8及IL-10的濃度均顯著高于對照組，模型組NF-B免疫組化染色較對照組顯著增強。 結(jié)論 IL-8、IL-10

2、及NF-B在重癥急性胰腺炎的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，重癥急性胰腺炎的早期即有胰腺組織NF-B的活化。 【關(guān)鍵詞】 重癥急性胰腺炎 白介素-8 白介素-10 核因子-B【Abstract】 Objective To investigate the expression of nuclear factor-kappa B (NF-B), serum interleukin-8 (IL-8) and interleukin-10 (IL-10) in severe acute pancreatitis (SAP) in rats .And to investigate the roles of act

3、ivated nuclear factor-kappa B (NF-B) and serum IL-8 and IL-10 in SAP. Methods 40 Wistar rats were randomly divided into normal control group (Sham operation group) and model group (SAP group). There were 20 rats in each group. Levels of serum amylase, IL-8, IL-10 and activated NF-2 / 15B in the panc

4、reatic tissue were detected 24 hours after operations. Results The levels of IL-8 and IL-10 in serum SAP were significantly higher than those in normal control group. Activated NF-B was enhanced in SAP group compared with Sham operation group. Conclusions IL-8, IL-10 and NF-B play an important role

5、in severe acute pancreatitis. There was activated NF-B at the early stage of severe acute pancreatitis.【Key Words】 Severe acute pancreatitis Interleukin-8 Interleukin-10 Nuclear factor-kappa B 重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis, SAP）是由多因素誘發(fā)、多個臟器受累、病情兇險、發(fā)展迅速、病死率高的內(nèi)科急重癥，而多器官功能障礙綜合征（multiple organ dysfu

6、nction syndrome, MODS）或者多器官功能衰竭（multiple organ failure, MOF）是SAP的主要死亡原因。損傷因子（如異常激活的胰酶）導(dǎo)致各種炎癥細(xì)胞的過度激活，形成亢進(jìn)的免疫反應(yīng)，并釋放多種炎性介質(zhì)，啟動全身炎癥反應(yīng)綜合征（systemic inflammatory response syndrome, SIRS），在機體受到促炎細(xì)胞因子損傷引起SIRS的同時，機體的防御系統(tǒng)也隨之發(fā)生反應(yīng),合成并釋放抗炎細(xì)胞因子，引起代償性抗炎反應(yīng)綜合征(compensatory anti-inflammatory response syndrome, CARS)。無論

7、失控的SIRS，還是過度的CARS，均表現(xiàn)為機體致炎-抗炎因素的失衡，機體穩(wěn)態(tài)破壞，均可導(dǎo)致炎癥損害加重。在SAP時，大量細(xì)胞因子產(chǎn)生，促炎因子和抗炎因子共存，其中包括促炎細(xì)胞因子IL-8和抗炎細(xì)胞因子IL-10。核因子-B（nuclear factor kappa B, NF-B）活化是眾多炎癥介質(zhì)作用機制的共同通道，諸多炎癥因子在基因水平上都受到NF-B的調(diào)控。作者自2006年8月至2007年3月通過建立大鼠重癥急性胰腺炎模型，觀察血清中IL-8、IL-10的變化以及胰腺NF-B的表達(dá)，探討重癥急性胰腺炎的形成機制。1 材料和方法1.1 動物及分組 40只Wistar大鼠（購自浙江省醫(yī)學(xué)科

8、學(xué)院），體重250300g，隨機分為正常對照組（假手術(shù)組）、重癥急性胰腺炎組（模型組），每組20只。各組于術(shù)后24h全部處死，留取標(biāo)本。動物飼養(yǎng)：所有大鼠均給予普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水，飼養(yǎng)環(huán)境為每籠4只，人工光循環(huán)12h/12h，溫度為(21±2.0)，濕度為(55±2)%。1.2 化學(xué)試劑 兔抗鼠的NF-B單克隆抗體購自北京中山生物技術(shù)有限公司, 大鼠血清IL-8和IL-10的ELISA試劑盒購自R&D systems。1.3 重癥急性胰腺炎模型的制備大鼠術(shù)前禁食、不禁水12h，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉（300mg/kg）。無菌條件下取上腹正中切口入腹

9、，尋找膽胰管十二指腸乳頭開口，使用一次性靜脈留置套管針于對系膜緣腸壁穿刺，進(jìn)入腸腔后即將針芯退出，將套管經(jīng)乳頭部逆行插入膽胰管約1cm，以無損傷小動脈夾于肝門部阻斷膽管后，套管末端接微量泵，以0.1ml/min的速度勻速注入5%?；悄懰徕c（1ml/kg體重），注畢后拔管，胰腺組織可在短時間內(nèi)出現(xiàn)充血、水腫，可見包膜下胰腺組織點狀或小片狀出血，5min后去除小動脈夾，以無損傷縫線縫合腸壁穿刺孔處，關(guān)腹。對照組大鼠開腹后僅翻動胰腺數(shù)次后關(guān)腹。1.4 取材方法 大鼠造模后24h以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，固定，經(jīng)心臟取血，測定血淀粉酶、IL-8及IL-10；切取相同部位的胰腺組織。1.5 分光光度

10、法檢測血清淀粉酶1.6 血清IL-8 及IL-10測定（ELISA法） 洗滌液用重蒸水1:20稀釋。底物工作液配制：使用前將OPD片放入底物稀釋中溶解，每片加液5ml。標(biāo)準(zhǔn)品液配制：使用前每管中加入蒸餾水200l溶解。試劑盒設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔8孔，每孔中各加入樣品稀釋液100l，第1孔加標(biāo)準(zhǔn)品100l，混勻后用加樣器吸出100l，移至第2孔，如此反復(fù)作對倍稀釋至第7孔，最后，從第7孔中吸出100l棄去，使之體積均為100l，第8孔為空白對照，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。待測品孔各加入待測樣品100ml。將反應(yīng)板充分混勻后置37 120min。用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌5次，向濾紙上印干。每孔加第一抗體工作液1滴，將反應(yīng)

11、板置37 60min。同前洗板。每孔加酶標(biāo)抗體工作液2滴，將反應(yīng)板置37 60min。同前洗板。每孔加入底物工作液2滴，置37暗處反應(yīng)10min。每孔加入1滴終止液混勻。在492nm處測吸光值。以標(biāo)準(zhǔn)品1000、500、250、125、62、31、 16、0pg/ml之OD值在半對數(shù)紙上作圖，畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品OD值在該曲線圖上查出相應(yīng)IL-8 及IL-10含量。1.7 病理學(xué)檢查、NF-B測定每個標(biāo)本切片行HE染色，采用盲法由?？漆t(yī)師在光鏡下閱片，每張切片隨機選擇5個高倍視野，觀察胰腺組織病理變化。NF-B免疫組織化學(xué)染色，胰腺腺泡細(xì)胞及胰島細(xì)胞染色為棕黃色的是NF-B陽性細(xì)胞，以積分法

12、半定量描述所取標(biāo)本的染色情況，每張切片隨機觀察10個高倍視野，按染色強度分為4級：0 =陰性染色；1=弱陽性染色；2=中度陽性染色；3=強陽性染色；按陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比例分為5級：0=陰性；1=陽性細(xì)胞1%25%；2=陽性細(xì)胞26%50%；3=陽性細(xì)胞51%75%；4=陽性細(xì)胞76%100%；每張切片的染色積分以這二者乘積之和表示。1.8 統(tǒng)計學(xué)處理實驗結(jié)果以(x±s)表示，用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，首先進(jìn)行方差齊性檢驗，然后進(jìn)行單因素方差分析。2 結(jié)果2.1 血清淀粉酶，IL-8 及IL-10的變化模型組大鼠血清淀粉酶、IL-8 及IL-10的濃度均顯著高于對照組

13、，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。表1 各組大鼠血清淀粉酶、IL-8、IL-10及NF- B水平（略）2.2 各組大鼠胰腺的組織病理學(xué)變化胰腺組織學(xué)改變：對照組胰腺組織光鏡下各時段無明顯改變，胰腺腺泡細(xì)胞排列緊密，可見胰島，無中性粒細(xì)胞浸潤；模型組則見間質(zhì)水腫，大片腺泡細(xì)胞變性壞死，伴有大量粒細(xì)胞浸潤。對照組大鼠胰腺組織NF-B免疫組織化學(xué)染色，腺泡細(xì)胞未見陽性細(xì)胞，胰島細(xì)胞的胞漿呈淡黃色；模型組可見多數(shù)胰腺腺泡細(xì)胞胞漿呈棕黃色，胰島細(xì)胞胞漿呈棕黃色，部分胰島細(xì)胞的胞核亦呈棕黃色，染色范圍較對照組明顯增大，染色強度較對照組明顯增強，結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義（見表1、圖14）。3 討論 急性胰腺炎是常見急腹癥

14、，約10%15%發(fā)展為重癥急性SAP。其最直接的原因是病程早期出現(xiàn)嚴(yán)重的SIRS及其它系統(tǒng)并發(fā)癥，如急性呼吸窘迫綜合征和MODS。諸多研究己證實炎癥細(xì)胞過度激活及炎性細(xì)胞因子的過度表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失衡在SAP中起著關(guān)鍵性作用，并同上述并發(fā)癥密切相關(guān)。NF-B活化是眾多炎癥介質(zhì)作用機制的共同通道，諸多炎癥因子在基因水平上都受到NF-B的調(diào)控。NF-B是一種具有多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的蛋白，p50/p65異源二聚體是NF-B活化的最常見形式。生理情況下NF-B同其抑制因子（inhibitor of NF-B, IB）結(jié)合以無活性狀態(tài)存在于細(xì)胞漿內(nèi)；疾病過程中，多種因素如病毒、內(nèi)毒素、氧自由基、TNF

15、-a、IL-6、IL-8等均可使其激活，NF-B由胞漿進(jìn)入核內(nèi)，與其靶基因上的啟動子或增強子結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控多種細(xì)胞因子和免疫介質(zhì)的表達(dá)，進(jìn)一步放大炎癥反應(yīng)，促炎因子和抗炎因子共存,其中包括促炎細(xì)胞因子IL-8和抗炎細(xì)胞因子IL-10。1997年Dunn等首先發(fā)現(xiàn)NF-B的活化是AP發(fā)生中的重要早期事件，隨后Altavilla等發(fā)現(xiàn)雨蛙素誘導(dǎo)的大鼠水腫性AP胰腺組織中NF-B的活性在疾病的早期有明顯的升高。Osman等把IL-10類似劑應(yīng)用于實驗性AP動物模型后，發(fā)現(xiàn)血清TNF-a和IL-8水平下降，腹水量減少，中性粒細(xì)胞浸潤和趨化以及肺組織CD11B/CD18陽性細(xì)胞功能明顯受到抑制，生存率明

16、顯改善。在體外試驗中，Olivier發(fā)現(xiàn)IL-10可以通過抑制IB激酶復(fù)合體來抑制NF-B的活性，從而減少支氣管上皮細(xì)胞中IL-8的表達(dá)。本研究表明在重癥急性胰腺炎的早期胰腺組織即有NF-B的活化，IL-8，IL-10及NF-B在重癥急性胰腺炎的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，重癥急性胰腺炎時機體致炎-抗炎因素失衡，IL-10可能有助于促進(jìn)致炎-抗炎因素的平衡，減輕重癥急性胰腺炎時的炎癥反應(yīng)。【參考文獻(xiàn)】 1 Bone RC. Sir Isaac Newton, sepsis SIRS and CARS. Crit Care Med, 1996, 24: 11251128.2 Wereszczynska

17、-Siemiatkowska U, Dabrowski A, Siemiatkowski A, et al. Serum profiles of E-selectin, interleukin-10, and interleukin-6 and oxidative stress parameters in patients with acute pancreatitis and nonpancreatic acute abdominal pain. Pancreas, 2003, 26(2): 144152.3 Dunn JA, Li C, Ha T, et al. Therapeutic m

18、odification of nuclear factor kappa B binding activity and tumor necrosis factor-alpha gene expression during acute biliary pancreatitis. Am Surg, 1997, 63(12): 10361043.4 Altavilla D, Famulari C, Passaniti M, et al.Lipid peroxidation inhibition reduces NF-kappaB activation and attenuates cerulein-induced pancreatitis.Free Radic Res， 2003，37(4):425435.5 Osman MO, Jacobsen NO, Kristensen JU, et al. IT 9302, a synthetic interleukin-10 agonist, diminishes acute lung injury in rabbits with acute necrotizing pancreatitis. Surgery, 1998, 124(3): 584592.6 Tab