發(fā)酵產(chǎn)品可行性報告

1、課題名稱：紫杉醇發(fā)醉產(chǎn)品的可行性報告姓名：專業(yè)班級：學號：紫杉醇發(fā)酯產(chǎn)品可行性報告摘要：紫杉醇是當前公認的廣譜、活性強的抗癌藥物之一，在臨床上廣泛應用, 但受原料紅豆杉木短缺的制約，存在巨大的供需差距。目前，人們主要進行的是 從紅豆杉樹中提取、分離和純化紫杉醇的研究。然而研究表明紅豆杉各個部位的 紫杉醇含量均甚微，且紅豆杉樹又是生長緩慢、散生、瀕危的珍惜保護植物。本 文研究了微生物（內(nèi)生真菌）發(fā)酵法在紫杉醇現(xiàn)代生產(chǎn)中的應用 （包括內(nèi)生真菌 的分離純化，紫杉醇的制?。?，該方法有效地為產(chǎn)生紫杉醇藥物開辟了新的途徑， 其應用前景十分廣闊；而且對于植物來源的天然藥物的新生產(chǎn)途徑的開發(fā)及瀕危 藥用植物的

2、保護具有十分重要的經(jīng)濟及生態(tài)效益。關鍵詞：紫杉醇，微生物發(fā)酵，內(nèi)生真菌，分離純化一、紫杉醇的研究意義：紫杉醇（PacHtaxel ,商品名Taxol）是一種二菇類衍生物，是當前公認的廣 譜、活性強的抗癌藥物之一 1。紫杉醇最早是Wan等2于1971年從短枝紅豆杉 （Taxusbreviifolia） 樹皮中分離得到的。隨后，Schif等3證實紫杉醇具有獨特 的抗癌機制。隨著紫杉醇的臨床應用，對其研究也逐漸深入，其主要抗癌機制為 抑制月中瘤細胞的微管（Microtubules）合成，以阻斷細胞分裂，致使月中瘤體積逐漸 縮小；紫杉醇還可誘導細胞凋亡，另外還有類似脂多糖（LPS）的作用，可調(diào)節(jié)機體的

3、免疫功能4。目前國際市場上的紫杉醇仍依靠從紅豆杉樹皮提取及半合成， 迄今為止尚未見有第三種形式形成大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的報道。紫杉醇的工業(yè)生產(chǎn)受到了原料和技術兩方面的制約，短期內(nèi)難以突破 5。為了解決紅豆杉資源短 缺與紫杉醇需求量的日益增加的矛盾，人們對生產(chǎn)紫杉醇進行了多方面的研究， 包括化學全合成、紅豆杉細胞培養(yǎng)及微生物發(fā)酵。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)紫杉醇因具 有明顯優(yōu)勢，其研究和開發(fā)越來越受到國內(nèi)外研究學者的廣泛關注。二、目前生產(chǎn)紫杉醇的幾種主要方法：紫杉醇的生產(chǎn)方法主要是提取分離和化學合成，提取分離的方法按來源不 同又可分為三大類：從植物中分離提取、從真菌中分離提取及從培養(yǎng)細胞中分離 提取.1 .化

4、學合成法化學合成是生產(chǎn)藥物的一條重要途徑，許多天然藥物 （如一些抗生素）除了 可從生物體內(nèi)提取外，還可通過化學的方法合成.紫杉醇的藥效被發(fā)現(xiàn)以來，其 化學合成的方法一直受到重視并得到很多的研究探索.迄今為止，在生產(chǎn)上有價值的紫杉醇的全合成尚未取得成功.紫杉醇的半合成法的問題主要在于：（1）合成原料在植物中含量不高，提取分離成本較高.（2）每一步反應得率低，而且有 時會碰到選擇性較差的問題.所以，無論是全合成還是半合成，即使目前都取得 了成功，但都難以應用于大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn).2 .直接從紅豆杉科植物中分離提取紫杉醇含量與種、部位、生長年限、生長環(huán)境等因素有關.在所有紅豆杉 中短葉紅豆杉中紫杉醇

5、含量最高；從生長時間上看，生長時間越長的器官或組織 紫杉醇含量越高；從生長環(huán)境上看，生長在陰處的樹皮比暴露在日光下的高； 就 部位來看，一般樹皮中紫杉醇含量較高，短葉紅豆杉樹皮中紫杉醇含量可達 0. 069 .據(jù)估算，從2 0003 000棵稀有的紫杉樹皮中只能提取1kg紫杉醇，而 對1例病人制備充足的藥物需34棵百年的老紅豆杉樹6.自紫杉醇藥效發(fā)現(xiàn)以 來，紅豆杉資源遭到毀滅性開發(fā)，有些種系瀕臨滅絕.3利用紅豆杉細胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇大規(guī)模地培養(yǎng)微生物細胞實現(xiàn)了許多種抗生素的大量生產(chǎn)，極好地滿足了 病人對抗生素的需求，挽救了無數(shù)人的生命.抗生素是微生物的次生代謝產(chǎn)物， 紫杉醇是植物細胞的次生代謝產(chǎn)

6、物，能否通過大規(guī)模的植物細胞培養(yǎng)大量獲取紫 杉醇很有研究價值。目前未能實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，這主要是因為：植物細胞生長慢， 紫杉醇含量低，使得單位時間單位質(zhì)量細胞紫杉醇含量較低，即使在理論上工業(yè)化生產(chǎn)也不能取得經(jīng)濟效益。4從紫杉醇內(nèi)生真菌中發(fā)酵制取與過去從紅豆杉植物的樹皮中提取紫杉醇相比，內(nèi)生真菌生產(chǎn)紫杉醇具有更大的優(yōu)勢，真菌不僅能在簡單的培養(yǎng)基上良好生長， 產(chǎn)生大量的發(fā)酵產(chǎn)物，發(fā) 酵周期短，還可以在生物反應器中人為控制各種參數(shù)， 并可通過誘變育種等手段 來提高菌種性能以提高紫杉醇產(chǎn)量， 所以大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)容易實現(xiàn)，其應用前景 十分廣闊；而且對于植物來源的天然藥物的新生產(chǎn)途徑的開發(fā)及瀕危藥用植物的

7、保護具有十分重要的經(jīng)濟及生態(tài)效益，這樣就為無限而有效地產(chǎn)生紫杉醇藥物開 辟了新的途徑。利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)紫杉醇的優(yōu)點：無論是從生態(tài)還是經(jīng)濟條件的角度來 看，利用植物內(nèi)生真菌作為藥源是一項不會枯竭的資源，微生物發(fā)酵的方法具有以下優(yōu)點：（1）微生物作為工業(yè)生產(chǎn)的源泉，可以在發(fā)酵罐中進行，可以源源 不盡的進行生產(chǎn)；（2）微生物發(fā)酵的方法容易擴大化，利于工業(yè)化生產(chǎn)；（3） 微生物的生長僅僅需要一般的培養(yǎng)技術， 在收集紫杉醇之前，可以通過改善培養(yǎng) 環(huán)境、改進技術來提高產(chǎn)量；（4）微生物易于通過基因工程等方法篩選高產(chǎn)菌 株，提高紫杉醇的產(chǎn)量；（5）內(nèi)生真菌生長迅速，易于培養(yǎng)，應用的培養(yǎng)基相 對比較便宜；（

8、6）可望滿足市場的需求，降低紫杉醇的價格。植物內(nèi)生真菌是 一類應用前景廣闊的資源微生物，用微生物發(fā)酵的方法生產(chǎn)紫杉醇，是解決藥源 問題的有效途徑。三、紫杉醇的生產(chǎn)工藝1 .內(nèi)生真菌分離：從植物體內(nèi)分離內(nèi)生真菌的關鍵一步是對植物組織表面進行消毒，以控制表生真菌的生長，使內(nèi)生真菌得以分離。目前常用次氯酸鈉作為消毒劑7,其分離方法是先用水沖洗植物材料，然后在 75%乙醇中浸泡50s后，在4%次氯酸 鈉水溶液浸泡0. 5h,然后在75%酒精中再浸泡30s,最后用無菌水沖洗。一般分 離所用的培養(yǎng)基為PDA&養(yǎng)基。為了防止細菌污染可在培養(yǎng)基中加抗菌素，如鏈 霉素、四環(huán)素等。一般20c25C培養(yǎng)一個

9、月左右，即可形成內(nèi)生真菌菌落。2 .發(fā)酵培養(yǎng)：從PD所板上切取5 m儲5 mml、塊菌落，接種至裝有150 mlM體培養(yǎng)基的500mLE角瓶中，于28c , 100 r/min搖床上振蕩培養(yǎng)1014 d3 .紫杉醇的提取分離：真菌培養(yǎng)物首先要進行預處理，然后進行紫杉醇的提取。主要提取方法是 用有機溶劑萃取。馬天有等8的方法是，將培養(yǎng)物冷凍后用轉(zhuǎn)速為lO000r/min 組織搗碎機勻漿3min,用4層紗布過濾，濾液中加入等體積的氯仿和甲醇混合液 (10: 1,V/V),充分振蕩后靜置8h12h,收集有機溶液相，并在45c條件下減 壓蒸發(fā)，殘留物溶于1m爐醇中作為樣品溶液備用。周東坡等人9對發(fā)酵產(chǎn)

10、物萃 取的方法是：收集培養(yǎng)物先經(jīng)3 O00r/min離心15min,并將沉淀物搗碎后重新與 上清液混合，再經(jīng)3500r/min離心12min,保留上清液，用等體積的氯仿與甲醇 混合液(10: 1, V/V)萃取，收集有機相后置3OC下鼓風干燥，將蒸發(fā)后的萃 取物溶于少量的氯仿中保存。后來又進行了改進，即發(fā)酵液過濾后，濾渣烘干(低 于5OC),濾液稱量體積。濾渣用適量乙酸乙酯萃取，濾液用 1/2濾液體積的乙 酸乙酯萃取(30min),下層水層再用乙酸乙酯萃取一次，合并乙酸乙酯，減壓蒸 儲。用適量甲醇洗滌減壓蒸儲得到的固體，再用正己烷洗滌15min,收集下層甲醇，加入乙酸乙酯和水(1:1,)進行萃

11、取(30min),將收集的乙酸乙酯進行減壓 蒸儲，用一定量的乙月青洗下固體，。的封保存，優(yōu)點是能夠充分萃取出發(fā)酵液 和菌絲中的紫杉醇。陳建華等人10的萃取方法比較簡單，直接用菌絲進行，取 菌絲1g均質(zhì)5min后用甲醇抽提，將抽提液通過離心，收集上層，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸 干，加入等體積水和二氯甲烷抽提，棄水相收集有機相，再次蒸干，所得粉末溶 于少量甲醇中，用粒徑為0. 15 m0. 18ttm的硅膠粒子作填料的硅膠柱進一步 純化。綜上所述，在分離真菌發(fā)酵液中的紫杉醇首先要考慮預處理，然后用相應的萃取方法進行分離，要考慮萃取液的種類和減壓蒸儲的溫度。4 .紫杉醇的純化：得到較高純度的紫杉醇十分重要。紫

12、杉醇的純化多采用色譜法。已報道的 用于紫杉醇分離的方法除薄層色譜法、柱層析法外還有膠束電動毛細管色譜法、 高速逆流色譜法、樹脂吸附分離法、膜分離法、沉淀法、化學反應法和藥理作用 靶點法11。粗分離的紫杉醇一般采用柱層析純化。周東坡12 (1995)報道，用高20cmi析柱，以硅膠(60目100目)為吸附劑純化紫杉醇。將一定量的氯仿加入萃取物中，然后加樣入柱，先用氯仿洗脫再用乙月青洗脫。龐欣13采用苯基柱固相萃（SPE）與高效液相色譜（HPLCM用來純化紫杉醇。經(jīng)SPEt理的樣品最大吸收 峰的峰高明顯降低，雜質(zhì)峰大大減少。真菌發(fā)酵產(chǎn)物的提取物中雜質(zhì)較多， 常規(guī) 精制方法使用大量溶劑，而且處理過程

13、中乳狀液的生成也會造成樣品的損失，導致樣品的回收率不夠理想，該法克服了上述缺點，是目前解決微生物發(fā)酵產(chǎn)物雜 質(zhì)多、產(chǎn)量低的較好方案。金濤等14探索了對紫杉醇產(chǎn)生菌發(fā)酵液有效脫色作 用同時制備高純度紫杉醇的樹脂及層析條件。他采用了7種樹脂對紫杉醇產(chǎn)生菌發(fā)酵液進行脫色和提取，結(jié)果表明201 X 4型樹脂處理樣品的效果最好，利用80% 的乙月青水溶液洗脫，紫杉醇的回收率達到了 98.8%。從而為提取紫杉醇提供了 一種操作簡單、回收率高、污染較低的樹脂層析方法。5 .紫杉醇含量測定：真菌發(fā)酵液中紫杉醇的定量可采用薄層色譜（TLC）、高效液相色譜（HPLC）、 UVfe疫分析、生物學方法和放射性前體標記

14、等。另外還有競爭抑制酶免疫分析法， 它是利用對紫杉醇有專一特性的單抗進行測定，此方法簡單易行且靈敏度高。HPLO最常用的、較為有效的分析檢測方法。HPLCT僅可以測定紫杉醇含量，而 且還能追蹤分離紫杉醇。四、內(nèi)生真菌的分離篩選：1 .內(nèi)生菌種的分離內(nèi)生真菌的分離可以采取兩種方法：一種是，采用標準的真菌分離純化的 方法15,16。取植物組織，用70%的酒精將其表面消毒，然后用滅菌的刀片將外 層組織削去，將內(nèi)部組織削成小片，小心置入水瓊脂培養(yǎng)基中，待菌絲長成后， 挑取不同菌絲末端置于PDA培養(yǎng)基中，觀察生長情況。另外一種方法平板灌注法17 0用滅菌的刀片去除外皮層和木質(zhì)部， 用70%的酒精消毒，無

15、菌水沖 洗，將紅豆杉樣品加入到適量的無菌水中， 放入研缽中充分研磨，取勻漿注入融 化的的PDA培養(yǎng)基中，搖勻，倒平板，25c培養(yǎng)。內(nèi)生真菌一般在PDA或MID培 養(yǎng)基中不形成抱子，或者是在滅菌的寄主莖葉中也不形成抱子。然而，這些真菌 可以在康乃馨的葉片上形成抱子。 康乃馨葉片經(jīng)過丫射線照射后，置于水瓊脂培 養(yǎng)基中，將分離得到的內(nèi)生真菌接種到康乃馨葉片上，23c下培養(yǎng)12個星期后， 在康乃馨葉片上形成暗色的子實體結(jié)構(gòu)， 對于真菌的鑒定具有重要的作用。研究 人員已經(jīng)將小抱擬盤多毛抱的有性階段研究清楚 18。內(nèi)生真菌可以在15%的甘 油中一70C保存16,19 02 .內(nèi)生菌種的純化待PDAg養(yǎng)基初

16、步長出菌落時，選才¥長勢較好的菌落，切取 5 mrrX 5 mmb塊 單菌落接種另一 PDAF板，28c培養(yǎng)34 d .3 .冷凍保存從PD所板上選擇長勢良好且未染雜菌的菌落，切取 34小塊菌體，放入滅 菌后裝有1 mL液體石蠟的塑料管中，置于4c冰箱保存.本次實驗共分離純化并 保存了 147株菌種.當重新培養(yǎng)菌種時，只需從石蠟管中取出一小塊菌體貼于PDA 平板上即可活化.五、前景展望：抗癌物紫杉醇已在臨床上廣泛應用，但受原料紅豆杉木短缺的制約，存在 巨大的供需差距。目前，人們主要進行的是從紅豆杉樹中提取、分離和純化紫杉 醇的研究。然而研究表明紅豆杉各個部位的紫杉醇含量均甚微，且紅豆

17、杉樹又是 生長緩慢、散生、瀕危的珍惜保護植物，因此單純依靠從紅豆杉屬植物中提取來 解決紫杉醇的藥源問題，幾乎不可能。在人工栽培紅豆杉樹遠水不解近渴； 化學 合成線路復雜，反應條件難以控制，試劑繁多，制備成本昂貴，而且只能停留在 實驗室階段，不能進行工業(yè)化生產(chǎn)；能合成紫杉醇的紅豆杉樹內(nèi)生真菌的發(fā)現(xiàn)， 是紫杉醇資源研究的重要進展，開辟微生物發(fā)酵法生產(chǎn)紫杉醇并通過各種手段提 高紫杉醇產(chǎn)生菌的產(chǎn)量以達到工業(yè)化生產(chǎn)所需的毫克級水平，實現(xiàn)微生物發(fā)酵法生產(chǎn)紫杉醇，有望解決迫在眉睫的抗癌藥物紫杉醇的藥源問題，既可以改善目前 市場上紫杉醇供不應求、價格昂貴的現(xiàn)狀，又可以保護瀕臨滅絕的珍稀紅豆杉樹 種，具有很大的

18、經(jīng)濟價值和市場前景。六、參考文獻1江澤飛，宋三泰，馮奉儀.中國月中瘤臨床與康復，2000, 7(2) : 6667 .2Wani MC, Taylor H L, Wall ME, Coggon P, MePhail A T. J AmChern Soc, 1971, 19: 23252327.3Schif P B, Fant J, Horwltz S B. Promotion of mietrotubule assembly in vitro by taxo1 . Nature , 1979, 277： 665.4袁金輝，郭立霞，王興旺，等.紫杉醇的最新研究進展.中國藥理學通報， 2001,

19、17(2) : 135139.5紀元，畢建男，嚴冰，等.生物工程學報，2006, 22(1) : 16.6翁開敏，賀全山.紫杉醇研究概況J.海峽藥學，2002, 14(2).5 77Petfini O . Taxonomy of endophytie funsi Of aerial plant tissues. InFokkema N J and vanden Heuvel J ed Microbiology of the PhyHosphere. Cambridge Cambridge University Prase 1986, PP. 1751878馬天有，董兆麟.西北大學學報(自然科學

20、版)，1999, 29(1) : 4749 .9周東坡，平文祥，孫劍秋，等.微生物學雜志，2001, 21(1) : 1819. 32.10陳建華，劉佳佳，臧鞏固，等.中南大學學報(自然科學版)，2004, 35(1): 65 69.11趙凱，周東坡.生物技術通訊，20O4, 15(3) : 309312.12周東坡，平文祥.微生物發(fā)酵法生產(chǎn)抗癌藥物紫杉醇.北京：中國科技出版社，2002, PP. 81.13龐欣，章光明，張瑞萍，等.色譜，2003, 22(2) : 185.14金濤，劉利群，王 偉，等.黑龍江醫(yī)藥，2006, 19(5) : 375377.15strobel G A,Yang

21、 X S,Sears J,et al.Taxol from Pestalotiopsismicrospora , an endophytic fungus of Taxuus wallachiana. Micrology, 1996,142:435-44016Li J Y,Strobel GA,Sidhu R,et al.Endophytic taxol producing fungi from Bald Cpyress Taxodium,Mcroibiology,1996,142:2223222617Huang Y J,Wang J F,Li G L,Antitumor and antifu

22、ngal activities inendophytic fungi isolated from pharmaceutical plants Tacus Mairei, Cephalataxus fortunei and Torreya grandis .FEMS Immumology and Medical Microbiology ,2001,31:163-16718 Metz A,Haddad A,Worapong J,er al.Induction of the sexual stage of Pestalotiopsismicrospora,a taxol-producingfungi.microbiology,2000,146 ; 20792089.19邱德有，黃美娟，方曉華，等。一種云南紅豆杉內(nèi)生真菌的分離。真菌學報報,1994,13(4):314-316.獎品名稱：500萬U豆體驗卡甘號：50Dd4fea7001 everage D、stain7、The words below equals to one another except().A、the high season B 、the busy season C 、the peak season D. the off seasonA、熱辣的B、菜系C、苦干的D、大