蛋白質(zhì)純化實(shí)驗(yàn)參考手冊

1、蛋白質(zhì)純化實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)手冊1 / 26第一章 外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)一、通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）將靶基因亞克隆到質(zhì)粒載體上（一）PCR引物設(shè)計(jì)的基本原則與PCR反應(yīng)組分和條件1. PCR引物設(shè)計(jì)的基本原則（1）引物與靶基因間配對的堿基一般為15-20。（2）引物堿基盡可能隨機(jī)分布，避免出現(xiàn)嘌呤、嘧啶堆積現(xiàn)象，引物G + C含量宜在45-55%左右。（3）引物內(nèi)部不應(yīng)形成二級結(jié)構(gòu)，兩個引物之間尤其在3末端不應(yīng)有互補(bǔ)鏈存在。（4）引物的堿基順序不應(yīng)與非擴(kuò)增區(qū)域有同源性?？捎糜?jì)算機(jī)進(jìn)行輔助檢索分析。（5）引物3末端一般以單個C或G結(jié)尾。2. PCR反應(yīng)組分和條件PCR反應(yīng)體系一般選用50 l體

2、積，其中含有：10×Reaction buffer，5 l2個引物，各12.5-25 pmol (終濃度各0.25-0.50 mol/L)4種底物（dATP + dCTP + dGTP + dTTP），各200mol/L模板DNA，100 ng左右Taq DNA聚合酶，2.5-3 UPCR反應(yīng)條件一般為：（1）94，5分鐘（2）94變性30-60秒（3）50-55退火30-60秒（4）70-72延伸30-60秒（5）725-10分鐘共進(jìn)行25-35次循環(huán)。循環(huán)是步驟（2）和（4）(二) 質(zhì)粒DNA的小量制備1、傳統(tǒng)方法（1）用滅菌牙簽挑單菌落于3 ml LB培養(yǎng)液中，37培養(yǎng)過夜。（

3、2）在每個EP管中倒入1 ml 左右的過夜培養(yǎng)物，6,000 rpm 離心1分鐘以收集菌體。（3）將菌體重懸于100 l 4預(yù)冷的溶液I中，并加入200 l新配制的溶液II, 蓋緊管口，快速顛倒離心管6-7次，然后，冰浴5分鐘。（4）加150 l 4預(yù)冷的溶液III, 倒置5-6次以混合內(nèi)容物，然后，冰浴5分鐘。（5）12,000 rpm 離心10分鐘后，小心吸取上清至另一EP管中。（6）加2倍體積的無水乙醇，振蕩混合，并在室溫放置5分鐘。（7）12,000 rpm離心5分鐘后，移去上清，并用70%乙醇漂洗DNA沉淀。DNA沉淀自然干燥，并溶于20 l 雙蒸水或1×TE緩沖液 (10

4、 mmol/L Tris, 1 mmol/L EDTA, pH 8.0) 中。2. Promega公司W(wǎng)izard Plus小量DNA純化方法-離心方案（適用于產(chǎn)品A1330，A1340，A1460及A1470）（1）12,000 rpm離心1分鐘，以沉淀1-10 ml過夜培養(yǎng)物。（2）用250l Cell Resuspension Solution充分懸浮大腸桿菌細(xì)胞。（3）加250l Cell Lysis Solution，倒置5-6次混合。（4）加10l Alkaline Protease Solution，倒置5-6次混合，室溫放置5分鐘。（5）加350l Neutralization

5、 Solution，倒置5-6次混合。（6）室溫，最高轉(zhuǎn)速離心10分鐘，回收上清。（7）將離心柱插入收集管中。（8）將上清倒入離心柱中。（9）室溫，最高轉(zhuǎn)速離心1分鐘，倒掉流穿液，將離心柱重新插入收集管中。（10）加750l Wash Solution（加乙醇），最高轉(zhuǎn)速離心1分鐘，倒掉流穿液，將離心柱重新插入收集管中。（11）重復(fù)步驟（10）（用250l Wash Solution）。（12）室溫，最高轉(zhuǎn)速離心2分鐘。（13）將離心柱插入一個無菌的1.5 ml微量離心管中。（14）在離心柱中加50-100l Nuclease-Free Water，室溫，最高轉(zhuǎn)速離心1分鐘。（15）DNA溶液

6、保存在-20備用。 (三) 質(zhì)粒DNA的中量制備1. 在100 ml 含100 g/ml 氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中加入1 ml pET-15b/Novablue甘油菌，37培養(yǎng)過夜；2. 4, 4,000 rpm離心10分鐘以收集菌體；在菌體用3 ml 溶液 I (50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris, pH 8.0, 10 mmol/L EDTA, pH 8.0) 充分懸浮后，加入6 ml 溶液II (0.2 mol/L NaOH, 1% SDS)，并倒置混合，冰浴5-10分鐘；3. 加入4.5 ml 溶液III（60ml 5 mol/L 乙酸鉀，11.5 ml 冰乙酸和

7、28.5ml水），輕搖混合，冰浴10分鐘；4. 4，12,000 rpm 離心20分鐘，小心吸取上清至另一個50 ml離心管中；加入0.6倍體積的異丙醇，混勻，室溫放置10分鐘；5. 室溫，10,000 rpm離心10分鐘以沉淀DNA；6. 在沉淀用70%乙醇漂洗，自然干燥，并溶于0.3 ml 的TE (10 mmol/L Tris, 1 mmol/L EDTA, pH 8.0) 緩沖液中，然后轉(zhuǎn)入EP管中；7. 加入等體積的5 mol/L LiCl, 室溫，10,000 rpm離心10分鐘以沉淀大分子RNA分子；8. 回收上清，加入等體積的異丙醇，室溫放置10分鐘，12,000 rpm 離心

8、5分鐘以沉淀DNA；9. DNA沉淀用70%乙醇漂洗，然后，自然干燥；10. DNA沉淀溶于200 l含50-100 g/ml 胰RNA酶的TE緩沖液中，在37保溫30分鐘；11. 加入等體積的13% PEG8000/1.6 mol/L NaCl, 室溫放置5分鐘；12,000 rpm 離心10分鐘以沉淀DNA；12. 小心移去上清，DNA沉淀溶于200 l TE (pH 8.0) 緩沖液中，并用酚-氯仿-異戊醇（25:24:1）抽提一次；小心將上層溶液轉(zhuǎn)移到一個干凈的EP管中，并加入0.1體積的3mol/L NaAc (pH 5.2)和2倍無水乙醇，混勻，-40放置30分鐘；13. 12,0

9、00 rpm 離心5分鐘以沉淀DNA；DNA沉淀用70%的乙醇漂洗，自然干燥，并溶于100 l TE 緩沖液中。最后，用1%的瓊脂糖凝膠電泳對DNA進(jìn)行定量和純度鑒定。（四）DNA（PCR產(chǎn)物或質(zhì)粒）的酶切 1. 一般在15-20 l體積中酶切0.2-1 g的DNA，可根據(jù)實(shí)際情況，按比例放大酶切反應(yīng)的體積和DNA的量。 2. 一般用7-8 u的限制性內(nèi)切酶酶切1 g的DNA，酶:DNA的比率應(yīng)小于25u/g，以防止star activity。 3. 限制性內(nèi)切酶一般保存在50%的甘油中，而大于5%的甘油可能會引起star activity或抑制酶切反應(yīng)。因此，在酶切反應(yīng)體系中，甘油的濃度一般

10、應(yīng)小于5%，也就是說，限制性內(nèi)切酶的體積應(yīng)小于酶切反應(yīng)總體積的1/10。 4. 對于雙酶切反應(yīng)，可考慮在同一種緩沖液中進(jìn)行，一般要求任一一種限制性內(nèi)切酶的活性不低于其最大活性的50%。 5. 酶切反應(yīng)的時(shí)間一般為2-3小時(shí)。如果酶切不完全，可適當(dāng)延長酶切反應(yīng)的時(shí)間。（五）從瓊脂糖凝膠或PCR反應(yīng)物中回收DNA （用Promega公司的Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System適用于產(chǎn)品A9280、A9281及A9282）1. 從瓊脂糖凝膠中切下含DNA的膠條，并放入一潔凈的EP管中。按每10 mg膠條加10 l的Membrane Binding Solution

11、，漩渦震蕩，并在50-60保溫直到膠條完全溶解；對于PCR反應(yīng)物，可直接加等體積的Membrane Binding Solution混合。2. 將SV 微柱插入收集管中，并將上述溶液加入SV微柱，室溫放置1分鐘。 3. 10,000 g離心1分鐘，丟棄流穿液，重新將微柱插入收集管中。 4. 加700 l Membrane Wash Soluton，10,000 g離心1分鐘，丟棄流穿液，重新將微柱插入收集管中。5. 用500 l Membrane Wash Solution 重復(fù)步驟4，10,000 g離心5分鐘。6. 小心將微柱插入一潔凈的EP管中。7. 在微柱中加50 l Nuclease

12、-Free Water，室溫放置1分鐘，10,000 g離心1分鐘。8. 丟棄微柱，將DNA儲存在4或-20。（六）PCR產(chǎn)物或DNA酶切片斷與質(zhì)粒載體的連接1. 常規(guī)方法一般在10l反應(yīng)體系中，加酶切并回收的質(zhì)粒載體50-100 g左右及1 l的T4 DNA連接酶（3-5 u/l），按PCR產(chǎn)物或DNA酶切片斷摩爾數(shù)與載體摩爾數(shù)比約為3:1的比例進(jìn)行連接。連接反應(yīng)在13-16保溫過夜。2. 快速連接方法可以通過連接Kit進(jìn)行。例如，對于Takara公司的連接Kit，可在載體與插入片段的混合液（5 l）中加入5 l Kit溶液，16 保溫2小時(shí)即可。（七）大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備1. 單菌落接

13、種于3 ml LB培養(yǎng)液中，37過夜培養(yǎng)。2. 取2 ml 過夜培養(yǎng)物接種于200 ml LB培養(yǎng)液中，并且，當(dāng)37培養(yǎng)至OD600為0.4左右時(shí)，轉(zhuǎn)移至250 ml離心管中，立即冰浴30分鐘。3. 在4，3,600 rpm離心10分鐘，棄上清，加4預(yù)冷的0.1 mol/L CaCl2溶液10 ml, 輕搖以充分懸浮細(xì)胞。4. 轉(zhuǎn)移至 50 ml 離心管中，在4，3,500 rpm離心7分鐘，小心棄上清。5. 加5 ml 預(yù)冷的0.1 mol/L CaCl2 ，輕搖離心管以充分懸浮細(xì)胞；冰浴2小時(shí)后，加4預(yù)冷的80%甘油至終濃度為15%，混勻分裝，并保存于-70。（八）用質(zhì)?；蜻B接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸

14、桿菌感受態(tài)細(xì)胞1. 常規(guī)方法一般用2-3 l連接反應(yīng)物與200 l 大腸桿菌菌株感受態(tài)細(xì)胞混合，冰浴30分鐘；42熱激90秒，冰浴2分鐘；加0.5-0.8 ml 的LB培養(yǎng)液，37，150-200 rpm振蕩培養(yǎng)60分鐘；低速離心以沉淀細(xì)胞，并移去大部分上清；用移液器吹吸混勻細(xì)胞，在9 cm 直徑的平板涂布100-200 l 細(xì)胞懸液，并在37保溫過夜。2. 快速轉(zhuǎn)化方法用2-3 l連接反應(yīng)物與200 l 大腸桿菌菌株感受態(tài)細(xì)胞混合，冰浴10分鐘，42熱激90秒，冰浴2分鐘，然后涂布在含有適宜抗生素的平板上。（九）轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定1. 通過Promega公司pGEM-T Vector Sys

15、tem的藍(lán)/白斑篩選（1）在含有適當(dāng)抗生素90 mm LB瓊脂平板中央滴加40 l 2% X-gal（用二甲基甲酰胺配制）和7 l 20% IPTG.。如用150 mm平板，則加100 l 2% X-gal 和 20 l 20% IPTG。（2）用涂布棒使溶液均勻地分散在整個平板的表面。然后，在37保溫1小時(shí)，使全部液體消失。（3）將pGEM-T Vector-插入片斷連接反應(yīng)物轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞涂布在上述平板的表面，37保溫過夜。其中，白色菌落表明：細(xì)胞中的質(zhì)粒含有插入片斷；藍(lán)色菌落表明：細(xì)胞中的質(zhì)粒不含有插入片斷。2. 轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒DNA的酶切鑒定用滅菌牙簽挑單菌落于3 ml含有適宜抗生素的

16、LB培養(yǎng)液中，37振蕩過夜培養(yǎng)。吸取1 ml過夜培養(yǎng)物進(jìn)行質(zhì)粒DNA的小量抽提，用限制性內(nèi)切酶酶切檢驗(yàn)質(zhì)粒DNA中是否有插入片斷。3. 以菌落為模板的PCR鑒定用滅菌吸頭挑取少許單菌落細(xì)胞，點(diǎn)在PCR管的底部。然后，加入其他PCR組分，進(jìn)行正常的PCR反應(yīng)（其中，PCR循環(huán)前的反應(yīng)參數(shù)為：95保溫10分鐘），以檢測菌落細(xì)胞質(zhì)粒DNA中是否有插入片斷。二、Stratagene公司的QuikChangeTM 定點(diǎn)突變方法為了保證高的突變效率，DNA模板的用量要小，DNA聚合酶的保真度要高，PCR的循環(huán)數(shù)要少。（一） 突變引物的設(shè)計(jì) 1. 對于每一個突變，需合成兩條互補(bǔ)的引物，并且引物應(yīng)通過PAGE

17、純化。2. 引物的長度為25-45個堿基，其Tm值應(yīng)大于或等于78。Tm = 81.5 + 0.41 (%GC) 675/N % mismatch, N為引物的長度。3. 突變堿基應(yīng)當(dāng)位于引物的中間。4. 引物的GC含量應(yīng)大于或等于40%，并且應(yīng)當(dāng)以一個或多個C或G結(jié)尾。（二） PCR相關(guān)參數(shù)1. 小抽或中抽的質(zhì)粒DNA均可用作DNA模板。 對于50l反應(yīng)體系，DNA模板的用量為10-100 ng，最適用量應(yīng)通過實(shí)驗(yàn)來確定。2. 引物應(yīng)過量，一般可配成100 ng/l，用量為3-5 l。3. PCR反應(yīng)條件為：95，1分鐘；50-55, 1-2分鐘； 68, 2 minutes/kb of p

18、lasmid length。4. 對于單個堿基的改變，退火溫度為55，循環(huán)數(shù)為12次；對于兩個或三個堿基的改變，或者單個氨基酸的缺失或插入，退火溫度為50或55，循環(huán)數(shù)為16次；對于多個氨基酸的缺失或插入，退火溫度為50或55，循環(huán)數(shù)為18次。（三）DNA模板的去除PCR反應(yīng)后，取10 l反應(yīng)物走1%瓊脂糖凝膠電泳，以檢測目標(biāo)產(chǎn)物的量和純度。如果目標(biāo)產(chǎn)物的量和純度符合要求，則在剩余反應(yīng)物中加1 l限制性內(nèi)切酶DpnI (10-20 u/l), 37保溫2-3小時(shí)以酶解模板DNA。（四）轉(zhuǎn)化取3 l DpnI酶切反應(yīng)物轉(zhuǎn)化200 l大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。（五） 突變基因的鑒定突變基因通過DNA測序

19、鑒定。三、檢測外源蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的表達(dá)如果靶基因亞克隆在含有T7啟動子的表達(dá)載體（如質(zhì)粒載體pET-22b和pET-15b等）上，那么重組質(zhì)粒應(yīng)轉(zhuǎn)化入DE3溶源菌菌株 如BL21(DE3)、JM109(DE3)及Qrigami B(DE3)等 中，以進(jìn)行靶基因的表達(dá)。（一） 溶菌酶-DNase I-反復(fù)凍融裂解菌體法1. 單菌落接入4ml LB培養(yǎng)液中，過夜培養(yǎng)。再以1:20轉(zhuǎn)接至2管4 ml LB培養(yǎng)液中，當(dāng)OD600為0.6-0.8時(shí)，一管加IPTG誘導(dǎo)，另一管不加IPTG作對照。2. 離心收集菌體，每管加Binding buffer 100 l，DNase I (2,000 u/ml

20、) 10 l，溶菌酶 (2 mg/ml) 5 l。菌體充分懸浮后，在-20放置20分鐘，室溫融化，如此反復(fù)凍融8-10次。3. 吸取20 l加入一潔凈的EP管中，12,000 rpm離心10分鐘，上清和沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳，以判斷靶蛋白質(zhì)主要以溶解形式還是以包涵體形式存在。（二） 超聲波裂解菌體法1. 單菌落接入4 ml LB培養(yǎng)液中，過夜培養(yǎng)。其中2 ml過夜培養(yǎng)物用于菌種保存和DNA測序，另外2 ml過夜培養(yǎng)物接入100 ml LB培養(yǎng)液中擴(kuò)大培養(yǎng)。當(dāng)OD600為0.6-0.8時(shí)，加IPTG誘導(dǎo)表達(dá)3-4小時(shí)。2. 4，5,000 rpm離心10分鐘收集菌體，用5 ml Bin

21、ding buffer充分懸浮細(xì)胞，超聲波破碎細(xì)胞（功率：120 W左右，間歇時(shí)間：10 秒，工作時(shí)間：3秒，破碎次數(shù)：40-50次）。3. 吸取20 l加入一潔凈的EP管中，12,000 rpm離心10分鐘，上清和沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳，以判斷靶蛋白質(zhì)主要以溶解形式還是以包涵體形式存在。（三） SDS-煮沸裂解菌體法1. 單菌落接入4ml LB培養(yǎng)液中，37培養(yǎng)。當(dāng)OD600為0.6-0.8時(shí)（約需3-4小時(shí)），吸取2 ml加入另一空的培養(yǎng)管中。其中，一管加IPTG誘導(dǎo)，另一管不加IPTG作為對照。2. 吸取1 ml培養(yǎng)物加入潔凈的EP管中，10,000 rpm離心1分鐘收集菌體。

22、在菌體管中加20 l水和20 l 2×loading buffer，沸水浴中維持3-5分鐘。3. 用SDS-PAGE電泳分析上述樣品，以判斷靶蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的表達(dá)量。四、用大腸桿菌生產(chǎn)13C-15N標(biāo)記的蛋白質(zhì)1. 用于生產(chǎn)13C-15N標(biāo)記蛋白質(zhì)的組合培養(yǎng)基（每升） K2HPO4·3H2O：10.375克KH2PO4：4.375克15NH4Cl：0.5克MgSO4·7H2O：50 毫克NH4FeSO4·6H2O：7毫克鹽酸硫胺：10毫克（母液濃度為10毫克/毫升）13C-葡萄糖：2.5克氨芐青霉素：100毫克（母液濃度為100毫克/毫升）除15NH

23、4Cl、13C-葡萄糖及氨芐青霉素外，其余試劑均為國產(chǎn)分析純試劑；2.5克葡萄糖溶于25毫升蒸餾水中，并單獨(dú)滅菌；對鹽酸硫胺和氨芐青霉素采用過濾除菌；葡萄糖、鹽酸硫胺及氨芐青霉素在培養(yǎng)前加入。2. 在大腸桿菌細(xì)胞中合成13C-15N標(biāo)記的蛋白質(zhì)將來自LB平板上的單菌落（含有重組質(zhì)粒）接入2-3毫升組合培養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)12小時(shí)（例如，從9:00-21:00），然后接入100毫升組合培養(yǎng)基中；過夜培養(yǎng)后，分別接入三個330毫升（在1升三角瓶中）組合培養(yǎng)基中；當(dāng)37培養(yǎng)至OD600=0.6-0.7時(shí)，加IPTG至終濃度為1 mmol/L，并繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，以誘導(dǎo)13C-15N標(biāo)記蛋白質(zhì)的合成。

24、第二章 蛋白質(zhì)的純化和鑒定一、 用Ni2+親和層析柱純化可溶性蛋白質(zhì)1. 30 ml的過夜培養(yǎng)物加入300 ml（在1升三角瓶中） 含有100 g/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，在37 振蕩培養(yǎng)。2. 當(dāng)OD600達(dá)到0.6-1.0時(shí)，加IPTG至終濃度為1 mmol/L 進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，培養(yǎng)物繼續(xù)保溫4小時(shí)以進(jìn)行目標(biāo)蛋白質(zhì)的累積。3. 4 ，5,000 rpm離心10分鐘收集菌體。對于500 ml菌液中的菌體，用20-30ml的start buffer充分懸浮。4. 在冰浴條件下，用超聲波破碎細(xì)胞（條件為：工作時(shí)間3秒，間歇時(shí)間10秒，總次數(shù)120-200）。5. 4 ，12,000 rpm離

25、心20分鐘以去除細(xì)胞碎片，上清與Ni2+親和層析柱混合。6. 上樣后，分別用start buffer (20 mmol/L Tris, pH 7.8, 0.5 mol/L NaCl) 和wash buffer （20 mmol/L Tris, pH 7.8, 0.5 mol/L NaCl, 50-100 mmol/L 咪唑）洗脫雜蛋白質(zhì)，用elution buffer（20 mmol/L Tris, pH 7.8, 0.5 mol/L NaCl, 0.5 mol/L咪唑）洗脫目標(biāo)蛋白質(zhì)。二、 通過Ni2+親和層析柱純化包涵體蛋白質(zhì)1. 5,000 rpm離心15 min。棄培養(yǎng)基，按每500

26、ml菌體加入20 ml緩沖液A。2. 震蕩混勻，加入200ml 100 mmol/L PMSF。超聲破碎200次（功率為200 W，工作時(shí)間為3 s，間隙時(shí)間為10 s）。12,000 rpm離心20 min。3. 棄上清，沉淀再加入5 ml緩沖液A洗滌1次。12000rpm離心20min。加入6ml鹽酸胍溶液，4靜置過夜。12000rpm離心20min。按以下步驟處理：（1） 用緩沖液B平衡Ni agarose柱。（2） 將鹽酸胍處理的蛋白質(zhì)溶液上Ni agarose柱。（3） 用約10倍床體積的含25 mmol/L咪唑的緩沖液C洗脫。（4） 用約10倍床體積的含40 mmol/L咪唑的緩沖

27、液C洗脫。（5） 用約 5倍床體積的含400 mmol/L咪唑的緩沖液C解析下目標(biāo)蛋白質(zhì)。緩沖液A： Tris·Cl (pH8.0) 50 mmol/ LEDTA 0.5 mmol/ LNaCl 0.4 mmol/ LMgCl 5 mmol/ L甘油 5%鹽酸胍溶液：鹽酸胍 6 mol/ LTris·Cl (pH8.0) 50 mmol/ L甘油 5%緩沖液B：Tris·Cl (pH 7.9) 10 mmol/ L甘油 10%NaCl 0.5 mmol/ L緩沖液C：Tris·Cl (pH 7.9) 20 mmol/ L甘油 20%KCl 100 mmo

28、l/ L三、 透析袋與超濾膜的使用注意事項(xiàng)可用脫鹽層析柱、透析袋或超濾膜對蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行脫鹽、緩沖液置換或濃縮。對于透析脫鹽，宜采用逐漸降低鹽濃度的方式進(jìn)行。（一） 透析袋使用注意事項(xiàng) 1. 應(yīng)帶上一次性薄膜手套操作透析袋。2. 透析袋一般剪成10-20 cm的小段。3. 新透析袋應(yīng)在2%（w/v）碳酸氫鈉和1 mmol/L (pH8.0) EDTA中煮沸10分鐘，然后用蒸餾水清洗干凈，再用1 mmol/L (pH8.0) EDTA中煮沸10分鐘。冷卻后，4保存于20%的乙醇中。4. 用過的透析袋需用蒸餾水徹底清洗干凈，然后浸于20%的乙醇中，在4保存?zhèn)溆?。（二?超濾膜使用注意事項(xiàng) 1. 不

29、要用手直接拿超濾膜，應(yīng)用平頭鑷子小心夾取超濾膜的邊緣。2. 在 4，10%-20%的乙醇中保存，不要冰凍。3. 使用過的超濾膜應(yīng)進(jìn)行再生處理（放在培養(yǎng)皿中，在脫色搖床上進(jìn)行），具體方案如下:(1) 蒸餾水漂洗2分鐘。(2) 用0.1 mol/L NaOH漂洗10分鐘。(3) 用蒸餾水漂洗以除去NaOH。(4) 70%乙醇浸泡5分鐘。(5) 用蒸餾水漂洗2分鐘，再保存于10%-20%的乙醇中。4. 光面向上。5. 應(yīng)避免超濾pH小于3.0或pH大于13的溶液。6. 不能與下列溶液混用：（1） 胺（2） 大于10%的磷酸溶液。（3） 大于0.5%的酚溶液。（4） 大于0.01 mol/L的鹽酸。四

30、、蛋白質(zhì)濃度的測定 蛋白質(zhì)的濃度用BCA Protein Assay Kit (pierce 公司) 測定，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)。具體方案如下：1. 用Kit中的牛血清白蛋白標(biāo)樣配制成下列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液：2,000 g/ml, 1,500 g/ml、1,000 g/ml、750 g/ml、500 g/ml、250 g/ml、125 g/ml及 25 g/ml（0 g/ml=空白溶液）。在這里，配標(biāo)準(zhǔn)溶液所用的稀釋劑應(yīng)與待測樣品的相同。 2. 將50體積的BCA試劑A與1體積的試劑B充分混合，從而配成工作溶液。工作溶液最好在測定的當(dāng)天配制。3. 分別將0.15 ml標(biāo)準(zhǔn)溶液、待測樣品及空白溶

31、液與3 ml工作溶液在5 ml離心管中混合，37保溫30分鐘。然后，迅速用冰浴冷卻所有的管。4. 用蒸餾水調(diào)零，在562 nm處測定樣品的光密度值（最好在10分鐘內(nèi)完成）。5. 從標(biāo)準(zhǔn)溶液和所測樣品的562 nm光密度值中減去空白溶液的相應(yīng)吸收值，即得到凈吸收值。然后，以牛血清白蛋白濃度為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的562 nm凈吸收值為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。用標(biāo)準(zhǔn)曲線判定每個未知樣品的濃度。 第三章 DNA-蛋白質(zhì)相互作用研究方法一、 凝膠遷移率變動實(shí)驗(yàn) (gel shift or electrophoretic mobility shift assay)凝膠遷移率變動實(shí)驗(yàn)又稱凝膠滯留法（gel retar

32、dation assay）或遷移率改變法（mobility shift assay），是檢測DNA結(jié)合蛋白的一種簡單迅速而又靈敏可靠的實(shí)驗(yàn)方法。凝膠遷移率變動實(shí)驗(yàn)的基本原理是：當(dāng)DNA結(jié)合蛋白與相應(yīng)的DNA片斷或寡核苷酸結(jié)合而形成DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物后，使DNA片段的分子量及電荷發(fā)生改變，因而在聚丙烯酰胺凝膠電泳體系中其電泳遷移率發(fā)生改變，通常較游離的DNA片段的泳動速率慢得多，在放射自顯影X光膠片上形成一較游離DNA片斷滯后的帶型。（一） DNA片段的制備DNA片段的長度一般要求在300 bp一下。DNA片斷過大，在聚丙烯酰胺凝膠中不易分離，DNA片斷泳動速度的輕微改變不易監(jiān)測到。1. 對于

33、DNA酶切片段，需用牛小腸堿性磷酸酶（CIAP）去除DNA片段中的5 磷酸，具體方案如下：在40 l體系中， 加1 l CIAP (0.1 U/l), 37保溫15分鐘，56保溫15分鐘；再用CIAP處理一次；用苯酚/氯仿抽提一次，向上清中加入5 mol/L NaCl至終濃度為0.2 mol/L, 以及兩倍體積無水乙醇，-20過夜；12,000 rpm離心5分鐘以沉淀DNA。 DNA溶于雙蒸水中。2. 對于合成的單鏈DNA片斷，需要退火，具體方案如下：將兩條互補(bǔ)的單鏈DNA片斷分別溶解于雙蒸水中，在EP管中等摩爾數(shù)混合后，放入100水中，自然冷卻到37以下。（二） DNA片段的標(biāo)記1. 在一個

34、潔凈的EP管中，分別加入下列組分：DNA片段 5-6 pmolT4多聚核苷酸激酶10×Buffer 1 l-32PATP (3,000 Ci/mmol, 10 Ci/l) 2 l或 -32PATP (5,000 Ci/mmol, 10 Ci/l) 3 l加水至總體積為9 lT4多聚核苷酸激酶（5-10 u/l） 1 l2. 混勻，37保溫10分鐘。3. 加1 l 0.5 mol/L EDTA終止反應(yīng)。（三） 游離-32PATP的去除 1. 對于小于18 bp的DNA片斷，可用G-25離心柱去除其中未結(jié)合的-32PATP。 2. 對于大于18 bp的DNA片斷，可用乙醇沉淀的方法去除其

35、中未結(jié)合的-32PATP，具體方案如下： 加0.5倍體積的7.5 mol/L乙酸銨和兩倍體積的無水乙醇，-70放置30分鐘；12,000 rpm離心5分鐘以沉淀DNA；DNA溶于50l雙蒸水中，即為32P標(biāo)記的DNA片斷溶液。32P標(biāo)記的DNA片斷溶液可放在密閉的鉛罐中，并保存在-20備用。（四） 遷移率變動實(shí)驗(yàn)32P標(biāo)記DNA片斷的量一般為0.1-1 ng，可根據(jù)具體情況適當(dāng)增減，以能形成清晰的滯后帶而游離DNA帶又不過濃為宜；蛋白質(zhì)的量為0.1-10 g，應(yīng)進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索出適宜的蛋白質(zhì)加入量。以能形成清晰的滯后帶，而又有適量的游離DNA帶殘存為宜。1. 在無菌的EP管中建立下列反應(yīng)：反應(yīng)1

36、（負(fù)對照）：7 l 雙蒸水2 l Gel Shift Binding 5×Buffer0 l 蛋白質(zhì)溶液9 l 總體積反應(yīng)2（正對照）： l 雙蒸水2 l Gel Shift Binding 5×Buffer l 蛋白質(zhì)溶液9 l 總體積反應(yīng)3（專一性競爭物）： l 雙蒸水2 l Gel Shift Binding 5×Buffer l 蛋白質(zhì)溶液1 l 未標(biāo)記的DNA片斷（5-6 pmol）9 l 總體積2. 室溫放置5-10分鐘，然后在上述每個反應(yīng)管中分別加1 l 32P標(biāo)記的DNA片斷。3. 室溫放置20分鐘。4. 僅在負(fù)對照反應(yīng)管中加1 l 凝膠上樣10