第八章蛋白質(zhì)和氨基酸的測定

1、第八章第八章 蛋白質(zhì)和氨基酸的測定蛋白質(zhì)和氨基酸的測定第一節(jié)第一節(jié) 概述概述一、蛋白質(zhì)的生理功用及在食品中的作用一、蛋白質(zhì)的生理功用及在食品中的作用蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)。 蛋白質(zhì)是人體重要的營養(yǎng)物質(zhì)。蛋白質(zhì)是人體重要的營養(yǎng)物質(zhì)。 蛋白質(zhì)是食品的重要質(zhì)量指標(biāo)。蛋白質(zhì)是食品的重要質(zhì)量指標(biāo)。1. 二、蛋白質(zhì)系數(shù)二、蛋白質(zhì)系數(shù)含氮則是蛋白質(zhì)區(qū)別其他有機化合物的主要標(biāo)志含氮則是蛋白質(zhì)區(qū)別其他有機化合物的主要標(biāo)志 。 不同蛋白質(zhì)其氨基酸構(gòu)成比例及方式不同，不同蛋白質(zhì)其氨基酸構(gòu)成比例及方式不同，故各種不同的蛋白質(zhì)其含氮量也不同，故各種不同的蛋白質(zhì)其含氮量也不同，一般蛋白一般蛋白質(zhì)含

2、氮量為質(zhì)含氮量為16%，即一，即一 份氮相當(dāng)于份氮相當(dāng)于6.25份蛋白質(zhì)，份蛋白質(zhì)，此數(shù)值（此數(shù)值（6.25）稱為蛋白質(zhì)系數(shù)。）稱為蛋白質(zhì)系數(shù)。 一般食物為一般食物為6.25；純?nèi)榕c純?nèi)橹破窞?；純?nèi)榕c純?nèi)橹破窞?.38；面粉為面粉為5.70；玉米、高粱為；玉米、高粱為6.24；花生為；花生為5.46；大；大米為米為5.95；大豆及其粗加工制品為；大豆及其粗加工制品為5.71；大豆蛋；大豆蛋白制品為白制品為6.25；肉與肉制品為；肉與肉制品為6.25；大麥、小米、；大麥、小米、燕麥、裸麥為燕麥、裸麥為5.83；芝麻、向日葵為；芝麻、向日葵為5.30；復(fù)合；復(fù)合配方食品為配方食品為6.25。三、氨

3、基酸三、氨基酸氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的最基本物質(zhì)，氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的最基本物質(zhì)，8種氨基酸在人體內(nèi)不能合成，必須依靠食種氨基酸在人體內(nèi)不能合成，必須依靠食品提供，品提供，必需氨基酸必需氨基酸 四、蛋白質(zhì)的測定方法四、蛋白質(zhì)的測定方法 蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，人體蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，人體11%13%總熱量來自蛋白質(zhì)。無論動物、植物都含有蛋白總熱量來自蛋白質(zhì)。無論動物、植物都含有蛋白質(zhì)，只是含量及類型不同。質(zhì)，只是含量及類型不同。 一類是利用蛋白質(zhì)的共性即含氮量、肽鍵和一類是利用蛋白質(zhì)的共性即含氮量、肽鍵和折射率等測定蛋白質(zhì)含量；折射率等測定蛋白質(zhì)含量； 另一類是利用蛋白質(zhì)中的氨基酸殘基、酸性另

4、一類是利用蛋白質(zhì)中的氨基酸殘基、酸性和堿性基因以及芳香基團等測定蛋白質(zhì)含量。和堿性基因以及芳香基團等測定蛋白質(zhì)含量。 食品和其原料中蛋白質(zhì)含量的測定，主要（也食品和其原料中蛋白質(zhì)含量的測定，主要（也是最常用的）用凱氏定氮法測定總氮量，然后乘一是最常用的）用凱氏定氮法測定總氮量，然后乘一個蛋白質(zhì)換算系數(shù)。這里也包括非蛋白的氮，所以個蛋白質(zhì)換算系數(shù)。這里也包括非蛋白的氮，所以只能稱為粗蛋白的含量（但馬鈴薯等非蛋白氮多的只能稱為粗蛋白的含量（但馬鈴薯等非蛋白氮多的要單測）。要單測）。具體測定方法：具體測定方法：凱氏定氮法凱氏定氮法最常用的，國內(nèi)外應(yīng)用普遍。最常用的，國內(nèi)外應(yīng)用普遍。雙縮脲反應(yīng)雙縮脲反

5、應(yīng)染料結(jié)合反應(yīng)染料結(jié)合反應(yīng)酚試劑法酚試劑法國外：國外： 紅外分析儀紅外分析儀氨基酸總量氨基酸總量酸堿滴定法測定。酸堿滴定法測定。各種氨基酸的分離與定量各種氨基酸的分離與定量色譜技術(shù)。色譜技術(shù)。有多種氨基酸分析儀。有多種氨基酸分析儀。第二節(jié)第二節(jié) 蛋白質(zhì)的定性測定蛋白質(zhì)的定性測定一、蛋白質(zhì)的一般顯色反應(yīng)一、蛋白質(zhì)的一般顯色反應(yīng)電泳或紙層析之后用一些染料與蛋白質(zhì)結(jié)合電泳或紙層析之后用一些染料與蛋白質(zhì)結(jié)合并變色。書中列舉了并變色。書中列舉了 5 種染料。種染料。二、復(fù)合蛋白質(zhì)的顯色反應(yīng)二、復(fù)合蛋白質(zhì)的顯色反應(yīng)（一）糖蛋白的顯色（一）糖蛋白的顯色（3種方法）種方法）（二）脂蛋白的顯色（二）脂蛋白的顯色

6、（2種方法）種方法）第三節(jié)第三節(jié) 蛋白質(zhì)的定量測定蛋白質(zhì)的定量測定 一般說來，動物性食品的蛋白質(zhì)含量高于植物一般說來，動物性食品的蛋白質(zhì)含量高于植物性食品。例如牛肉中蛋白質(zhì)含量為性食品。例如牛肉中蛋白質(zhì)含量為 20.0%左右，左右，豬肉豬肉 9.5%， 兔肉兔肉 21%， 雞肉雞肉 20%， 牛乳牛乳 3.5%， 帶魚帶魚 18.0%， 大豆大豆 40%，面粉面粉 9.9%， 菠菜菠菜 2.4%， 黃瓜黃瓜 1.0%，蘋果蘋果 1.4% 測定食品中的蛋白質(zhì)的含量，對于評價食品的測定食品中的蛋白質(zhì)的含量，對于評價食品的營養(yǎng)價值，合理開發(fā)利用食品資源、提高產(chǎn)品質(zhì)營養(yǎng)價值，合理開發(fā)利用食品資源、提高

7、產(chǎn)品質(zhì)量、優(yōu)化食品配方、指導(dǎo)經(jīng)濟核算及生產(chǎn)過程控量、優(yōu)化食品配方、指導(dǎo)經(jīng)濟核算及生產(chǎn)過程控制均具有極其重要的意義。制均具有極其重要的意義。一些蛋白質(zhì)的含氮量一些蛋白質(zhì)的含氮量 一般為一般為 15% 17.6%，有的上下浮動，有的上下浮動,可以測可以測出總氮出總氮 N.16%N= N6.25 = 蛋白質(zhì)含量蛋白質(zhì)含量一、 凱氏定氮法 由由Kieldhl于于1833年提出，現(xiàn)發(fā)展為常量、微量、年提出，現(xiàn)發(fā)展為常量、微量、自動定氮儀法，半微量法及改良凱氏法。自動定氮儀法，半微量法及改良凱氏法。過程：是通過測出樣品中的總含氮量再乘以相過程：是通過測出樣品中的總含氮量再乘以相應(yīng)的蛋白質(zhì)系數(shù)而求出蛋白質(zhì)的

8、含量，由于樣品中應(yīng)的蛋白質(zhì)系數(shù)而求出蛋白質(zhì)的含量，由于樣品中含有少量非蛋白質(zhì)含氮化合物（如核酸、含氮碳水含有少量非蛋白質(zhì)含氮化合物（如核酸、含氮碳水化合物、生物堿等；含氮類脂、卟啉和含氮的色化合物、生物堿等；含氮類脂、卟啉和含氮的色素），故此法的結(jié)果稱為粗蛋白質(zhì)含量。素），故此法的結(jié)果稱為粗蛋白質(zhì)含量。適用范圍：可用于所有動、植物食品的分析及適用范圍：可用于所有動、植物食品的分析及各種加工食品的分析，可同時測定多個樣品，是經(jīng)各種加工食品的分析，可同時測定多個樣品，是經(jīng)典分析方法。典分析方法。（一）微量凱氏定氮法（一）微量凱氏定氮法1. 原理原理 樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使樣品與濃硫酸

9、和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水蛋白質(zhì)分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機氮轉(zhuǎn)化為氨與硫酸結(jié)合成逸出，而樣品中的有機氮轉(zhuǎn)化為氨與硫酸結(jié)合成硫酸銨。然后加堿蒸餾，使氨蒸出。硫酸銨。然后加堿蒸餾，使氨蒸出。 用用H3BO3吸收后再以標(biāo)準(zhǔn)吸收后再以標(biāo)準(zhǔn)HCl溶液滴定。根溶液滴定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)酸消耗量可以計算出蛋白質(zhì)的含量。據(jù)標(biāo)準(zhǔn)酸消耗量可以計算出蛋白質(zhì)的含量。2.過程：消化、蒸餾、吸收與滴定過程：消化、蒸餾、吸收與滴定1）消化）消化 總反應(yīng)式：總反應(yīng)式：加硫酸鉀加硫酸鉀 作為增溫劑，提高溶液沸點，作為增溫劑，提高溶液沸點，純硫酸沸點純硫酸沸點 340

10、，加入硫酸鉀之后可以提高，加入硫酸鉀之后可以提高至至400以上。也可加入硫酸鈉，氯化鉀等提以上。也可加入硫酸鈉，氯化鉀等提高沸點，但效果不如硫酸鉀。高沸點，但效果不如硫酸鉀。2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4 （NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O一定要用濃硫酸（一定要用濃硫酸（98%） 加硫酸銅加硫酸銅 作為催化劑。還可以作消化終點指示劑（做蒸餾時作為催化劑。還可以作消化終點指示劑（做蒸餾時堿性指示劑）。還可以加氧化汞、汞（均有毒，價格貴）、硒堿性指示劑）。還可以加氧化汞、汞（均有毒，價格貴）、硒粉、二氧化鈦。粉、二氧化鈦。 加氧化劑加氧化劑 如雙氧水、次氯酸鉀等加速

11、有機如雙氧水、次氯酸鉀等加速有機 物氧化速度。物氧化速度。 98%濃硫酸濃硫酸 濃硫酸具有脫水性，使有機物脫水后被炭化為碳、氫、氮。濃硫酸具有脫水性，使有機物脫水后被炭化為碳、氫、氮。 濃硫酸具有氧化性，將有機物炭化后的碳氧化為二氧化碳，濃硫酸具有氧化性，將有機物炭化后的碳氧化為二氧化碳，硫酸則被還原成二氧化硫。硫酸則被還原成二氧化硫。 二氧化硫使氮還原為氨，本身則被氧化為三氧化硫，氨隨二氧化硫使氮還原為氨，本身則被氧化為三氧化硫，氨隨之與硫酸作用生成硫酸銨留在酸性溶液中。之與硫酸作用生成硫酸銨留在酸性溶液中。2） 蒸餾蒸餾 消化液消化液 + 400g/L氫氧化鈉加熱蒸餾，放出氨氣。氫氧化鈉加

12、熱蒸餾，放出氨氣。3）吸收與滴定）吸收與滴定 用用20g/L硼酸吸收，用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，指示劑硼酸吸收，用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，指示劑用混合指示劑。用混合指示劑。 甲基紅甲基紅溴甲基酚綠指示劑（變色點呈灰色，溴甲基酚綠指示劑（變色點呈灰色，pH5.1）指示劑指示劑 酒紅色酒紅色 藍(lán)綠色藍(lán)綠色 酒紅色酒紅色 （酸）（酸） （堿）（堿） （酸）（酸） 亞甲基藍(lán)亞甲基藍(lán)+甲基紅指示劑（變色點呈灰色，甲基紅指示劑（變色點呈灰色，pH5.4） 指示劑指示劑 紫紅色紫紅色 藍(lán)綠色藍(lán)綠色 （酸）（酸） （堿）（堿）吸收吸收滴定滴定3.操作方法操作方法1）樣品消化）樣品消化 準(zhǔn)確稱取均勻的固體樣品準(zhǔn)確稱取均勻的

13、固體樣品0.202.00g，或半固體樣品或半固體樣品2.005.00g，或吸取液體試樣，或吸取液體試樣10.0025.00 (約相當(dāng)于約相當(dāng)于30-40mg氮氮)。小心移。小心移入干燥的入干燥的100mL或或500mL定氮瓶中定氮瓶中(勿粘附在勿粘附在瓶壁上瓶壁上)。 加入加入0.g硫酸銅、硫酸銅、g硫酸鉀及硫酸鉀及2mL濃濃硫酸，稍搖勻后，于瓶口放一小漏斗，將瓶硫酸，稍搖勻后，于瓶口放一小漏斗，將瓶以以45角傾斜支于電爐上（在通風(fēng)櫥內(nèi)加熱角傾斜支于電爐上（在通風(fēng)櫥內(nèi)加熱消化）。消化）。3.操作方法操作方法 先以小火緩慢加熱，待內(nèi)容物全部炭化、先以小火緩慢加熱，待內(nèi)容物全部炭化、泡沫完全停止后

14、，加強火力，并保持瓶內(nèi)液泡沫完全停止后，加強火力，并保持瓶內(nèi)液體微沸，至溶液呈藍(lán)綠色清澈透明后，再繼體微沸，至溶液呈藍(lán)綠色清澈透明后，再繼續(xù)加熱續(xù)加熱0.5-1h。 取下冷卻至室溫，小心加取下冷卻至室溫，小心加20mL水。放冷水。放冷后，移入后，移入100mL容量瓶中，并用少量水洗定容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混勻備用。同時做試劑空白試驗?；靹騻溆谩Ｍ瑫r做試劑空白試驗。儀器：儀器：消化裝置消化裝置2）蒸餾、吸收）蒸餾、吸收 按圖裝好定氮裝置，于水蒸氣發(fā)生瓶內(nèi)裝按圖裝好定氮裝置，于水蒸氣發(fā)生瓶內(nèi)裝水至三分之二處，加入數(shù)粒玻璃

15、珠，加甲水至三分之二處，加入數(shù)粒玻璃珠，加甲基紅指示液數(shù)滴及數(shù)毫升硫酸，以保持水基紅指示液數(shù)滴及數(shù)毫升硫酸，以保持水呈酸性，用調(diào)壓器控制，加熱煮沸水蒸氣呈酸性，用調(diào)壓器控制，加熱煮沸水蒸氣發(fā)生瓶內(nèi)的水。發(fā)生瓶內(nèi)的水。 向接收瓶內(nèi)加入向接收瓶內(nèi)加入10mL硼酸溶液（硼酸溶液（20g/L）及）及1-2滴混合指示液，并使冷凝管的下端插入滴混合指示液，并使冷凝管的下端插入接受瓶液面下。接受瓶液面下。2）蒸餾、吸收）蒸餾、吸收 準(zhǔn)確吸取準(zhǔn)確吸取10mL試樣處理液，由小漏斗慢慢流試樣處理液，由小漏斗慢慢流入反應(yīng)室，并以入反應(yīng)室，并以10mL水洗滌小燒杯使流入反水洗滌小燒杯使流入反應(yīng)室內(nèi)，棒狀玻塞塞緊。應(yīng)室

16、內(nèi)，棒狀玻塞塞緊。 將將10mL氫氧化鈉溶液（氫氧化鈉溶液（400g/L）倒入小玻杯，）倒入小玻杯，提起玻塞使其緩緩流入反應(yīng)室，立即將玻塞蓋提起玻塞使其緩緩流入反應(yīng)室，立即將玻塞蓋緊，并加水于小玻杯以防漏氣。夾緊螺旋夾，緊，并加水于小玻杯以防漏氣。夾緊螺旋夾，開始蒸餾。開始蒸餾。 蒸餾蒸餾5min，移動接收瓶，將冷凝管下端離開液，移動接收瓶，將冷凝管下端離開液面繼續(xù)蒸餾面繼續(xù)蒸餾1min，然后用少量蒸餾水沖洗冷凝，然后用少量蒸餾水沖洗冷凝管下端外部，取下接收瓶，停止蒸餾。管下端外部，取下接收瓶，停止蒸餾。3）滴定）滴定 以硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液（以硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液（0.0500mol/L

17、）滴定至灰）滴定至灰色或藍(lán)紫色為終點。色或藍(lán)紫色為終點。 同時準(zhǔn)確吸取同時準(zhǔn)確吸取10mL試劑空白消化液操作。試劑空白消化液操作。4.計算計算 注意：注意：F氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)，一般為氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)，一般為6.25 也也可查表?？刹楸?。 計算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。計算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。100100101000)()100/100/(21FmMVVcmLggg或蛋白質(zhì)含量5.注意事項：注意事項：所用試劑溶液應(yīng)用無氨蒸餾水配制。所用試劑溶液應(yīng)用無氨蒸餾水配制。 消化時不要用強火，應(yīng)保持和緩沸騰，以消化時不要用強火，應(yīng)保持和緩沸騰，以免粘貼在凱氏瓶內(nèi)壁上的含氮化合物在無免粘貼在凱氏瓶內(nèi)壁

18、上的含氮化合物在無硫酸存在的情況下消化不完全而造成氮損硫酸存在的情況下消化不完全而造成氮損失。失。 消化時應(yīng)注意不時轉(zhuǎn)動凱氏燒瓶，以便利消化時應(yīng)注意不時轉(zhuǎn)動凱氏燒瓶，以便利用冷凝酸液將附在瓶壁上的固體殘渣洗下，用冷凝酸液將附在瓶壁上的固體殘渣洗下，并促進(jìn)其消化完全。并促進(jìn)其消化完全。儀器：儀器：消化裝置消化裝置 樣品中若含脂肪較多時，消化過程中易產(chǎn)樣品中若含脂肪較多時，消化過程中易產(chǎn)生大量泡沫，為防止泡沫溢出瓶外，在開生大量泡沫，為防止泡沫溢出瓶外，在開始消化時應(yīng)用小火加熱，并時時搖動；或始消化時應(yīng)用小火加熱，并時時搖動；或者加入少量辛醇或液體石蠟或硅油消泡劑，者加入少量辛醇或液體石蠟或硅油消

19、泡劑，并同時注意控制熱源強度。并同時注意控制熱源強度。 當(dāng)樣品消化液不易澄清透明時，可將凱氏當(dāng)樣品消化液不易澄清透明時，可將凱氏燒瓶冷卻，加入燒瓶冷卻，加入30過氧化氫過氧化氫 23 mL 后后再繼續(xù)加熱消化再繼續(xù)加熱消化。 若取樣量較大，如干試樣超過若取樣量較大，如干試樣超過5 g 可按每可按每克試樣克試樣5 mL的比例增加硫酸用量。的比例增加硫酸用量。 般消化至呈透明后，繼續(xù)消化般消化至呈透明后，繼續(xù)消化30min即即可，但對于含有特別難以氨化的氮化合物的可，但對于含有特別難以氨化的氮化合物的樣品，如含賴氨酸、組氨酸、色氨酸、酪氨樣品，如含賴氨酸、組氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等時，需適當(dāng)

20、延長消化時間。有酸或脯氨酸等時，需適當(dāng)延長消化時間。有機物如分解完全，消化液呈藍(lán)色或淺綠色，機物如分解完全，消化液呈藍(lán)色或淺綠色，但含鐵量多時，呈較深綠色。但含鐵量多時，呈較深綠色。 蒸餾裝置應(yīng)平穩(wěn)牢固，各連接部位不得漏蒸餾裝置應(yīng)平穩(wěn)牢固，各連接部位不得漏氣，水蒸氣發(fā)生應(yīng)均勻充足。蒸餾過程中不氣，水蒸氣發(fā)生應(yīng)均勻充足。蒸餾過程中不能停止加熱斷氣，否則會發(fā)生倒吸現(xiàn)象。能停止加熱斷氣，否則會發(fā)生倒吸現(xiàn)象。加入堿液時應(yīng)小心，注意安全。加堿量要加入堿液時應(yīng)小心，注意安全。加堿量要充足，動作快，冷凝器出口應(yīng)浸于吸收液中，充足，動作快，冷凝器出口應(yīng)浸于吸收液中，防止氨的揮發(fā)損失。在蒸餾結(jié)束時，先將冷防止氨

21、的揮發(fā)損失。在蒸餾結(jié)束時，先將冷凝管的管口提離吸收液面以免發(fā)生倒吸。繼凝管的管口提離吸收液面以免發(fā)生倒吸。繼續(xù)蒸餾續(xù)蒸餾1min，然后用少量水沖洗冷凝管出口，然后用少量水沖洗冷凝管出口端外部，再取下接收瓶。在沖洗蒸餾裝置時，端外部，再取下接收瓶。在沖洗蒸餾裝置時，要特別注意防止堿液污染冷凝器和吸收瓶。要特別注意防止堿液污染冷凝器和吸收瓶。凱氏定氮法適用于食品中蛋白質(zhì)的測定，凱氏定氮法適用于食品中蛋白質(zhì)的測定，但不適用于添加無機含氮物質(zhì)、有機非蛋白但不適用于添加無機含氮物質(zhì)、有機非蛋白質(zhì)含氮物質(zhì)的食品中蛋白質(zhì)的測定。質(zhì)含氮物質(zhì)的食品中蛋白質(zhì)的測定。凱氏定氮法凱氏定氮法試樣的處理：采用凱氏燒瓶，試

22、樣的處理：采用凱氏燒瓶，使全部樣品浸泡于消化液中，在通風(fēng)櫥中進(jìn)使全部樣品浸泡于消化液中，在通風(fēng)櫥中進(jìn)行消化。測定蛋白質(zhì)時只能用硫酸消化。對行消化。測定蛋白質(zhì)時只能用硫酸消化。對于難消化的樣品可加入少量過氧化氫，但不于難消化的樣品可加入少量過氧化氫，但不得使用高氯酸，以免生成氮氧化物。得使用高氯酸，以免生成氮氧化物。硼酸吸收液溫度較高時會影響對氨的吸收硼酸吸收液溫度較高時會影響對氨的吸收作用，應(yīng)將吸收瓶置冷水浴中冷卻。作用，應(yīng)將吸收瓶置冷水浴中冷卻。二、二、 常量凱氏定氮法常量凱氏定氮法原理及適用范圍同微量原理及適用范圍同微量法相同。法相同。2.操作方法操作方法1）樣品消化）樣品消化 準(zhǔn)確稱取均

23、勻的固體樣品準(zhǔn)確稱取均勻的固體樣品0.2002.00g，或半固，或半固體樣品體樣品2.005.00g，或吸取溶液樣品，或吸取溶液樣品10.0025.00mL(約相當(dāng)于約相當(dāng)于30-40mg氮氮)。小心移入干燥潔凈。小心移入干燥潔凈的的500mL凱氏燒瓶中凱氏燒瓶中(勿粘附在瓶壁上勿粘附在瓶壁上)。加入。加入0.g硫硫酸銅、酸銅、g硫酸鉀及硫酸鉀及2mL濃硫酸，小心搖勻后，于濃硫酸，小心搖勻后，于瓶口放一小漏斗，瓶頸瓶口放一小漏斗，瓶頸45角傾斜置電爐上，在通角傾斜置電爐上，在通風(fēng)櫥內(nèi)加熱消化。先以小火緩慢加熱，待內(nèi)容物完風(fēng)櫥內(nèi)加熱消化。先以小火緩慢加熱，待內(nèi)容物完全炭化、泡沫消失后，加大火力，

24、保持瓶內(nèi)液體微全炭化、泡沫消失后，加大火力，保持瓶內(nèi)液體微沸，消化至溶液呈透明藍(lán)綠色。繼續(xù)加熱沸，消化至溶液呈透明藍(lán)綠色。繼續(xù)加熱0.5h，冷卻，冷卻至室溫。至室溫。 小心加入小心加入200mL蒸餾水，待完全冷卻后，加入數(shù)蒸餾水，待完全冷卻后，加入數(shù)粒玻璃珠以防蒸餾時暴沸。粒玻璃珠以防蒸餾時暴沸。儀器：儀器：消化裝置消化裝置2）蒸餾、吸收）蒸餾、吸收 將凱氏燒瓶按蒸餾裝置圖連接好，塞緊瓶將凱氏燒瓶按蒸餾裝置圖連接好，塞緊瓶口，冷凝管下端插入吸收瓶液面之下（瓶口，冷凝管下端插入吸收瓶液面之下（瓶內(nèi)預(yù)先裝有內(nèi)預(yù)先裝有50mL，40g/L硼酸溶液及混合指硼酸溶液及混合指示劑示劑2-3滴）。滴）。 從

25、安全漏斗中慢慢加入從安全漏斗中慢慢加入70mL，400g/L氫氧氫氧化鈉溶液，并搖動凱氏瓶，至瓶內(nèi)溶液呈化鈉溶液，并搖動凱氏瓶，至瓶內(nèi)溶液呈深藍(lán)色，或產(chǎn)生黑色沉淀（溶液若呈藍(lán)色深藍(lán)色，或產(chǎn)生黑色沉淀（溶液若呈藍(lán)色不生成沉淀，應(yīng)再增加氫氧化鈉用量），不生成沉淀，應(yīng)再增加氫氧化鈉用量），再加入再加入100mL蒸餾水，夾緊夾子，用直火加蒸餾水，夾緊夾子，用直火加熱蒸餾熱蒸餾30min，至氨全部蒸出，將冷凝管下，至氨全部蒸出，將冷凝管下端提離液面，繼續(xù)蒸餾端提離液面，繼續(xù)蒸餾1min，用蒸餾水淋，用蒸餾水淋洗尖端后停止蒸餾。洗尖端后停止蒸餾。 “以奈氏試以奈氏試 劑劑”檢查氨是否全部蒸完：檢查氨是否全

26、部蒸完：奈氏試劑奈氏試劑Nessler試劑，試劑，K2（HgI4） 檢驗檢驗NHNH4 4+ +離子，遇銨根，離子析出黃色或紅棕色沉淀。離子，遇銨根，離子析出黃色或紅棕色沉淀。配制配制方法方法1 1、 3.5 g KI + 1.3 g HgCl3.5 g KI + 1.3 g HgCl2 2 溶于溶于70 70 毫升水。加毫升水。加3030毫升毫升4 4 mol/Lmol/L氫氧化鈉（或氫氧化鉀）溶液，必要時過濾，并存于玻璃氫氧化鈉（或氫氧化鉀）溶液，必要時過濾，并存于玻璃瓶中蓋緊口。瓶中蓋緊口。方法方法2 2、 溶解溶解11.5 g HgI11.5 g HgI2 2 + KI 10 g+ K

27、I 10 g于適量少許水，后加水稀于適量少許水，后加水稀釋至釋至50 ml,50 ml,靜置后，取其澄清液，棄去沉淀，儲存于棕色瓶中。靜置后，取其澄清液，棄去沉淀，儲存于棕色瓶中。3）滴定）滴定 將接受瓶內(nèi)的硼酸液用將接受瓶內(nèi)的硼酸液用0.1000mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至終點。同時做一試劑空白（除不加樣品，從消化開至終點。同時做一試劑空白（除不加樣品，從消化開始操作完全相同）。始操作完全相同）。3.計算計算 %1001000)(21FmMVVc蛋白質(zhì)含量與微量法不同點：與微量法不同點： 吸收硼酸液量吸收硼酸液量：10 mL（20g/L） 50 mL （40g/L）；）； 加

28、入氫氧化鈉（加入氫氧化鈉（400g/L ）量：）量： 10 mL 70 mL 滴定用鹽酸濃度由滴定用鹽酸濃度由0.0500 mol/L 0.1000 mol/L ； 蒸餾裝置：蒸餾裝置： 操作方法操作方法 消化：微量法要將消化完全后的消化液定容消化：微量法要將消化完全后的消化液定容100mL容量瓶。容量瓶。 裝置的安裝裝置的安裝 蒸餾、吸收：與微量法不同的是蒸餾、吸收：與微量法不同的是 微量法取樣品定容液微量法取樣品定容液10mL，1/10；常量法為所；常量法為所有有 直接加熱蒸出氨直接加熱蒸出氨注意問題：注意問題： 加堿量要足，操作要迅速，漏斗要采用加堿量要足，操作要迅速，漏斗要采用水封防氨

29、逸出；水封防氨逸出； 注意控制熱源使蒸汽產(chǎn)生穩(wěn)定，不能太注意控制熱源使蒸汽產(chǎn)生穩(wěn)定，不能太猛或太弱；猛或太弱； 要注意蒸汽控制夾子的操作，以防蒸汽要注意蒸汽控制夾子的操作，以防蒸汽受阻爆炸或吸收液倒吸。受阻爆炸或吸收液倒吸。三、三、 自動凱氏定氮法自動凱氏定氮法1 1、原理及適用范圍同前原理及適用范圍同前 2 2、特點：特點：（1）消化裝置用優(yōu)質(zhì)玻璃制成的凱氏消化瓶，紅）消化裝置用優(yōu)質(zhì)玻璃制成的凱氏消化瓶，紅外線加熱的消化爐。外線加熱的消化爐。（2）快速：一次可同時消化）快速：一次可同時消化8個樣品，個樣品，30分鐘可消分鐘可消化完畢?；戤?。（3）自動：自動加堿蒸餾，自動吸收和滴定，自）自動

30、：自動加堿蒸餾，自動吸收和滴定，自動數(shù)字顯示裝置?？捎嬎憧偟俜趾坎⒂涗?，動數(shù)字顯示裝置?？捎嬎憧偟俜趾坎⒂涗?，12分鐘完成分鐘完成1個樣。個樣。北京福德泰和科技有限公司北京福德泰和科技有限公司產(chǎn)品名稱：產(chǎn)品名稱： 凱氏定氮儀凱氏定氮儀 二、分光光度法二、分光光度法1.原理原理 蛋白質(zhì)是含氮的有機化合物。食品與硫蛋白質(zhì)是含氮的有機化合物。食品與硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，分解產(chǎn)生的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸氨。在分解產(chǎn)生的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸氨。在pH4.8的乙酸鈉的乙酸鈉-乙酸緩沖溶液中，氨與乙酰乙酸緩沖溶液中，氨與乙酰丙酮和甲醛反應(yīng)生成黃色

31、的丙酮和甲醛反應(yīng)生成黃色的3,5-二乙酰二乙酰-2,6-二二甲基甲基-1,4-二氫化吡啶化合物。在波長二氫化吡啶化合物。在波長400nm下測定吸光度值，與標(biāo)準(zhǔn)系列比較定量，結(jié)下測定吸光度值，與標(biāo)準(zhǔn)系列比較定量，結(jié)果乘以換算系數(shù)，即為蛋白質(zhì)含量。果乘以換算系數(shù)，即為蛋白質(zhì)含量。2.試劑與材料試劑與材料 硫酸銅、硫酸鉀、硫酸硫酸銅、硫酸鉀、硫酸 氫氧化鈉溶液氫氧化鈉溶液(300g/L):稱取稱取30g氫氧化鈉加水溶解后，氫氧化鈉加水溶解后，放冷，并稀釋至放冷，并稀釋至100mL。 對硝基苯酚指示劑溶液對硝基苯酚指示劑溶液(1g/L):稱取稱取0.1g對硝基苯酚指示對硝基苯酚指示劑溶于劑溶于20mL

32、95%乙醇中，加水稀釋至乙醇中，加水稀釋至100mL。 乙酸溶液乙酸溶液(1mol/L):量取量取5.8mL冰乙酸，加水稀釋至冰乙酸，加水稀釋至100mL。 乙酸鈉溶液乙酸鈉溶液(1mol/L):稱取稱取41g無水乙酸鈉或無水乙酸鈉或68g乙酸鈉乙酸鈉(CH3COONa3H2O) ，加水溶解后并稀釋至，加水溶解后并稀釋至500mL。 乙酸鈉乙酸鈉-乙酸緩沖溶液乙酸緩沖溶液:量取量取60mL乙酸鈉溶液與乙酸鈉溶液與40mL乙乙酸溶液混合，該溶液酸溶液混合，該溶液PH4.8。 顯色劑：顯色劑：15mL甲醛與甲醛與7.8mL乙酰丙酮混合，乙酰丙酮混合，加水稀釋至加水稀釋至100mL，劇烈振搖，混勻，

33、劇烈振搖，混勻(室溫室溫下放置穩(wěn)定下放置穩(wěn)定3d)。 氨氮標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液氨氮標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液(以氮計以氮計)(1.0g/L):精密稱精密稱取取105干燥干燥2h的硫酸銨的硫酸銨0.4720g，加水溶解，加水溶解后移入后移入100mL容量瓶中，并稀釋至刻度，容量瓶中，并稀釋至刻度，混勻，此溶液每混勻，此溶液每mL相當(dāng)于相當(dāng)于1.0mg氨。氨。 氨氮標(biāo)準(zhǔn)使用溶液氨氮標(biāo)準(zhǔn)使用溶液 (0.1g/L):用移液管吸取用移液管吸取10.00mL氨氮標(biāo)準(zhǔn)貯備液于氨氮標(biāo)準(zhǔn)貯備液于100mL容量瓶內(nèi)，容量瓶內(nèi)，加水定容至刻度，混勻，此溶液每加水定容至刻度，混勻，此溶液每mL相當(dāng)相當(dāng)于于0.1mg氮。氮。3.儀器與設(shè)備儀

34、器與設(shè)備 分光光度計分光光度計 電熱恒溫水浴鍋電熱恒溫水浴鍋 10mL具塞玻璃比色管具塞玻璃比色管4.分析步驟分析步驟 試樣消解：試樣消解： 稱取經(jīng)粉碎混勻過稱取經(jīng)粉碎混勻過40目篩的固體試樣目篩的固體試樣0.1g0.5g(精確至精確至0.001g)或半固體試樣或半固體試樣0.2-1.0g或吸取液體試樣或吸取液體試樣1-5mL，移入干燥的，移入干燥的100mL或或250mL定氮瓶中，加入定氮瓶中，加入0.1g硫酸銅、硫酸銅、1g硫酸鉀及硫酸鉀及5mL硫酸，搖勻后于瓶口放一小硫酸，搖勻后于瓶口放一小漏斗，將定氮瓶以漏斗，將定氮瓶以45角斜支于有小孔的石角斜支于有小孔的石棉網(wǎng)上。緩慢加熱，待內(nèi)容物

35、完全炭化、泡棉網(wǎng)上。緩慢加熱，待內(nèi)容物完全炭化、泡沫完全停止后，加強火力，并保持瓶內(nèi)液體沫完全停止后，加強火力，并保持瓶內(nèi)液體微沸，至溶液呈藍(lán)綠色澄清透明后，繼續(xù)加微沸，至溶液呈藍(lán)綠色澄清透明后，繼續(xù)加熱熱0.5h，取下放冷。，取下放冷。4.分析步驟分析步驟 慢慢加入慢慢加入20mL蒸餾水，放冷后移入蒸餾水，放冷后移入50mL或或100mL容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，并加水至刻度，混勻備用。液并入容量瓶中，并加水至刻度，混勻備用。按同一方法做試劑空白試驗。按同一方法做試劑空白試驗。 試樣溶液的制備：試樣溶液的制備： 吸取吸取2.005.00m

36、L試樣或試劑空白消化試樣或試劑空白消化液于液于50mL或或100mL容量瓶內(nèi)，加容量瓶內(nèi)，加12滴對硝滴對硝基苯酚指示劑，搖勻后滴加氫氧化鈉溶液基苯酚指示劑，搖勻后滴加氫氧化鈉溶液中和至黃色，再滴加乙酸溶液至溶液無色，中和至黃色，再滴加乙酸溶液至溶液無色，用水稀釋至刻度，混勻。用水稀釋至刻度，混勻。 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制： 吸取吸取0.00、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和和1.0mL氨氮標(biāo)準(zhǔn)使用溶液氨氮標(biāo)準(zhǔn)使用溶液(相當(dāng)于相當(dāng)于0.00、5.0、10.0、20.0、40.0、60.0、80.0和和100.0g氮氮) ，分別置于，分別置于10mL比色管中。加比色管中

37、。加4.0mL乙乙酸鈉酸鈉-乙酸緩沖溶液及乙酸緩沖溶液及4.0mL顯色劑，加水稀顯色劑，加水稀釋至刻度，混勻。置于釋至刻度，混勻。置于100 水浴中加熱水浴中加熱15min。取出用水冷卻至室溫后，移入。取出用水冷卻至室溫后，移入1cm比色皿內(nèi)，以零管為參比，于波長比色皿內(nèi)，以零管為參比，于波長400nm處處測量吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)各點吸光度值繪制測量吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)各點吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線或計算線性回歸方程。標(biāo)準(zhǔn)曲線或計算線性回歸方程。試樣測定：試樣測定： 吸取吸取0.502.00mL(約相當(dāng)于氮約相當(dāng)于氮100g) 試樣溶液和同量的試劑空白溶液，分別于試樣溶液和同量的試劑空白溶液，分別于10

38、mL比色皿比色皿 中。以下按標(biāo)準(zhǔn)曲線自中。以下按標(biāo)準(zhǔn)曲線自“加加4mL乙酸鈉乙酸鈉-乙酸緩沖溶液乙酸緩沖溶液”起操作。試起操作。試樣吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較定量或代入線樣吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較定量或代入線性回歸方程求出含量。性回歸方程求出含量。5.分析結(jié)果分析結(jié)果: X:試樣中蛋白質(zhì)的含量，試樣中蛋白質(zhì)的含量，g/100g c :試樣測定液中氮的含量，試樣測定液中氮的含量，g c0 :試劑空白測定液中氮的含量，試劑空白測定液中氮的含量，g V1 :試樣消化液定容體積，試樣消化液定容體積，mL V2 :制備試樣溶液的消化液體積，制備試樣溶液的消化液體積，mL V3 :試樣溶液總體積，試樣溶液總體積

39、，mL V4 :測定用試樣溶液體積，測定用試樣溶液體積，mL m :試樣質(zhì)量，試樣質(zhì)量，g F :氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)。氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)。FVVVVmccX10010001000)(341206.注意事項注意事項 配制試劑所用水均為無氨水。配制試劑所用水均為無氨水。 該法檢出線為該法檢出線為0.070 g/mL。 線性范圍為線性范圍為0-10.0 g/mL三、燃燒法（杜馬斯法）三、燃燒法（杜馬斯法） 樣品在高溫下燃燒，釋放的氮氣由樣品在高溫下燃燒，釋放的氮氣由帶熱導(dǎo)檢測器的氣相色譜儀測定。測得帶熱導(dǎo)檢測器的氣相色譜儀測定。測得的氮含量轉(zhuǎn)換成樣品中的蛋白質(zhì)含量。的氮含量轉(zhuǎn)換成樣品中的蛋白質(zhì)含

40、量。四、雙縮脲法四、雙縮脲法 傳統(tǒng)的凱氏定氮法應(yīng)用范圍廣，靈敏度高、準(zhǔn)傳統(tǒng)的凱氏定氮法應(yīng)用范圍廣，靈敏度高、準(zhǔn)確，不要大儀器，但費時間，有環(huán)境污染。確，不要大儀器，但費時間，有環(huán)境污染。新開發(fā)的：雙縮脲法、新開發(fā)的：雙縮脲法、 紫外分光光度法、紫外分光光度法、 染料結(jié)合法、染料結(jié)合法、 水楊酸比色法等。水楊酸比色法等。1.原理原理 脲（尿素）脲（尿素）NH2CONH2加熱至加熱至150160時，時，兩分子縮和成雙縮脲。兩分子縮和成雙縮脲。 雙縮脲能和硫酸銅的堿性溶液生成紫色絡(luò)和物，雙縮脲能和硫酸銅的堿性溶液生成紫色絡(luò)和物，這種反應(yīng)叫雙縮脲反應(yīng)。（縮二脲反應(yīng)）這種反應(yīng)叫雙縮脲反應(yīng)。（縮二脲反應(yīng)）

41、 蛋白質(zhì)分子中含有肽鍵蛋白質(zhì)分子中含有肽鍵 CONH，與雙縮，與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似。在同樣條件下也有呈色反應(yīng)，在一定脲結(jié)構(gòu)相似。在同樣條件下也有呈色反應(yīng)，在一定條件下，其顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比，可用分條件下，其顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比，可用分光光度計來測其吸光度，確定含量。（光光度計來測其吸光度，確定含量。（560nm）NH2CONHCONH2 + NH3NH2CONH2 + NH2CONH2注：測蛋白質(zhì)時叫雙縮脲法，并不另加雙縮脲。注：測蛋白質(zhì)時叫雙縮脲法，并不另加雙縮脲。樣品不用消化。樣品不用消化。2. 方法特點及應(yīng)用范圍方法特點及應(yīng)用范圍 本法靈敏度較低，但操作簡單快速，故在生物化本法

42、靈敏度較低，但操作簡單快速，故在生物化學(xué)領(lǐng)域中測定蛋白質(zhì)含量時常用此法。本法亦適用于學(xué)領(lǐng)域中測定蛋白質(zhì)含量時常用此法。本法亦適用于豆類、油料、米谷等作物種子及肉類等樣品測定。豆類、油料、米谷等作物種子及肉類等樣品測定。 3.主要儀器：主要儀器： 分光光度計，離心機（分光光度計，離心機（4000 r/min） 4. 試劑：試劑： (1) 堿性硫酸銅溶液堿性硫酸銅溶液 (2) 四氯化碳四氯化碳5操作方法：操作方法：采用凱氏法測出的蛋白質(zhì)樣品為標(biāo)準(zhǔn)樣繪采用凱氏法測出的蛋白質(zhì)樣品為標(biāo)準(zhǔn)樣繪標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品的測定樣品的測定6.6.計算計算7.7.注意事項注意事項五紫外吸收法五紫外吸收法 1 1原理

43、：利用蛋白質(zhì)的特有基團，原理：利用蛋白質(zhì)的特有基團，R R（ NHCHCO NHCHCO）對紫外光有吸收作用在對紫外光有吸收作用在280 nm280 nm下，吸光度與蛋白下，吸光度與蛋白質(zhì)濃度成直線關(guān)系，求含量。質(zhì)濃度成直線關(guān)系，求含量。2 2適用范圍：常用于生物化學(xué)工作，因為干擾因適用范圍：常用于生物化學(xué)工作，因為干擾因素多，故在食品分析領(lǐng)域應(yīng)用不廣泛。素多，故在食品分析領(lǐng)域應(yīng)用不廣泛。3 3主要儀器：主要儀器： 紫外分光光度計紫外分光光度計 離心機（離心機（3000 5000 r/min3000 5000 r/min）4 4操作：用凱氏法測定作標(biāo)樣做標(biāo)準(zhǔn)曲線操作：用凱氏法測定作標(biāo)樣做標(biāo)準(zhǔn)曲

44、線六、福林六、福林-酚比色法酚比色法 蛋白質(zhì)與福林蛋白質(zhì)與福林-酚試劑反應(yīng)，產(chǎn)生藍(lán)色復(fù)合酚試劑反應(yīng)，產(chǎn)生藍(lán)色復(fù)合物。呈色強度與蛋白質(zhì)含量成正比，是檢測可溶物。呈色強度與蛋白質(zhì)含量成正比，是檢測可溶性蛋白質(zhì)含量最靈敏的經(jīng)典方法之一。性蛋白質(zhì)含量最靈敏的經(jīng)典方法之一。七、考馬斯亮藍(lán)染料比色法七、考馬斯亮藍(lán)染料比色法 考馬斯亮藍(lán)考馬斯亮藍(lán)G-250，蛋白質(zhì)染料，與蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)染料，與蛋白質(zhì)通過范德華力引力結(jié)合，使蛋白質(zhì)染色，在通過范德華力引力結(jié)合，使蛋白質(zhì)染色，在620nm處有最大吸收值。處有最大吸收值。八、染料結(jié)合法八、染料結(jié)合法 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)+染料染料沉淀物沉淀物 剩余染料剩余染料 分光光度計

45、測定分光光度計測定九、水楊酸比色法九、水楊酸比色法 硫酸硫酸 溫度酸度溫度酸度 樣品樣品 銨鹽銨鹽 藍(lán)色絡(luò)合物（藍(lán)色絡(luò)合物（660nm） 消化消化 次氯酸鈉次氯酸鈉十、紅外光譜法十、紅外光譜法 利用多肽鍵在中外紅和近紅外波段的特征利用多肽鍵在中外紅和近紅外波段的特征吸收測定蛋白質(zhì)含量。吸收測定蛋白質(zhì)含量。十一、比濁法十一、比濁法 低濃度的三氯乙酸、磺基水楊酸和乙低濃度的三氯乙酸、磺基水楊酸和乙酸中的鐵氰化鉀能使蛋白質(zhì)沉淀形成蛋白酸中的鐵氰化鉀能使蛋白質(zhì)沉淀形成蛋白質(zhì)顆粒的懸浮液，其濁度可由輻射光傳送質(zhì)顆粒的懸浮液，其濁度可由輻射光傳送過程中的衰減而確定，輻射光衰減的程度過程中的衰減而確定，輻射

46、光衰減的程度與溶液中蛋白質(zhì)濃度成正比。與溶液中蛋白質(zhì)濃度成正比。第五節(jié)第五節(jié) 氨基酸的定性測定氨基酸的定性測定 利用各種顯色反應(yīng)。利用各種顯色反應(yīng)。第六節(jié)第六節(jié) 氨基酸定量測定氨基酸定量測定一氨基酸的一般定量測定一氨基酸的一般定量測定（一）甲醛滴定法（一）甲醛滴定法 1.1.原理：氨基酸本身有堿性原理：氨基酸本身有堿性 NHNH2 2 基，又有基，又有 酸性酸性 COOH COOH 基，成中性內(nèi)鹽，加入甲醛基，成中性內(nèi)鹽，加入甲醛 溶液后，甲醛與溶液后，甲醛與 NHNH2 2 結(jié)合，從而使堿結(jié)合，從而使堿性消失，再用強堿來滴定性消失，再用強堿來滴定COOH COOH 基，并用基，并用間接的方法

47、測定氨基酸總量。間接的方法測定氨基酸總量。2 2特點：適用于發(fā)酵工業(yè)，如發(fā)酵液中含氮量，其特點：適用于發(fā)酵工業(yè)，如發(fā)酵液中含氮量，其發(fā)酵過程中氮量減少情況等。（適于食品發(fā)酵過程中氮量減少情況等。（適于食品中游離氨基酸的測定）中游離氨基酸的測定） 3 3雙指示劑：雙指示劑： 40% 40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示劑，用氫氧化鈉將劑，用氫氧化鈉將40%40%甲醛中和至淡藍(lán)色。甲醛中和至淡藍(lán)色。 1g/L 1g/L百里酚酞乙醇溶液，百里酚酞乙醇溶液， 1g/L 1g/L中性紅中性紅50%50%乙醇溶液，乙醇溶液， 0.1 mol/L 0.1 mol/L 氫氧化鈉標(biāo)

48、準(zhǔn)溶液。氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液。4 4操作：吸取含操作：吸取含20-30mg20-30mg氨基酸的樣品溶液氨基酸的樣品溶液2 2份，分別置于份，分別置于250mL250mL錐形瓶中，各加入錐形瓶中，各加入50mL50mL蒸蒸餾水，餾水， 其中一份加入其中一份加入3 3滴中性紅指示劑，用氫氧化滴中性紅指示劑，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至終點，鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至終點，中和樣液中其它酸性中和樣液中其它酸性物質(zhì)。物質(zhì)。 另一份樣液中加入另一份樣液中加入3 3滴百里酚酞指示劑和中滴百里酚酞指示劑和中性甲醛性甲醛20mL20mL，搖勻，靜置，搖勻，靜置1min1min，用標(biāo)準(zhǔn)，用標(biāo)準(zhǔn)NaOHNaOH滴滴定至終點。定至

49、終點。中和樣液中氨基酸的羧基與其它酸中和樣液中氨基酸的羧基與其它酸性物質(zhì)的總和。性物質(zhì)的總和。 二者之差可計算氨基酸含量二者之差可計算氨基酸含量說明：說明： 此法適用于測定食品中的游離氨基酸。此法適用于測定食品中的游離氨基酸。 固體樣品應(yīng)先粉碎，準(zhǔn)確稱樣后用水萃取，測固體樣品應(yīng)先粉碎，準(zhǔn)確稱樣后用水萃取，測定萃取液，液體試樣可直接測定。萃取在定萃取液，液體試樣可直接測定。萃取在50水水浴中進(jìn)行浴中進(jìn)行0.5h。 若樣品顏色較深，可加適量活性炭脫色，或用若樣品顏色較深，可加適量活性炭脫色，或用電位滴定法測定。電位滴定法測定。 與本法類似的還有單指示劑與本法類似的還有單指示劑(百里酚酞百里酚酞)甲

50、醛滴定甲醛滴定法，此法用標(biāo)準(zhǔn)堿完全中和法，此法用標(biāo)準(zhǔn)堿完全中和COOH時的時的pH值值為為8.59.5，但分析結(jié)果稍偏低。，但分析結(jié)果稍偏低。（二）電位滴定法（二）電位滴定法1.原理原理2.試劑試劑 甲醛（甲醛（36%）：應(yīng)不含有聚合物）：應(yīng)不含有聚合物 氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液（氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液（0.050mol/L）3.儀器儀器酸度計酸度計 磁力攪拌器磁力攪拌器 10mL微量滴定管微量滴定管4.分析步驟分析步驟 吸取吸取5.0mL試樣，置于試樣，置于100mL容量瓶中，加入容量瓶中，加入至刻度，混勻后吸取至刻度，混勻后吸取20.0mL，置于，置于200mL燒杯燒杯中，加中，加60mL水，開

51、動磁力攪拌器，用氫氧化水，開動磁力攪拌器，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至酸度計指示鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至酸度計指示pH8.2，記下消，記下消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的毫升數(shù)，可計算總耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的毫升數(shù)，可計算總酸含量。酸含量。 加入加入10.0mL甲醛溶液，混勻。再用氫氧化鈉標(biāo)甲醛溶液，混勻。再用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液繼續(xù)滴定至準(zhǔn)滴定溶液繼續(xù)滴定至pH9.2，記下消耗氫氧，記下消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的毫升數(shù)。化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的毫升數(shù)。 同時取同時取80mL水，先用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至水，先用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至pH為為8.2，再加入，再加入10.0mL甲醛溶液，用氫氧化鈉甲醛溶液，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定

52、溶液繼續(xù)滴定至標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液繼續(xù)滴定至pH9.2，同時做試劑，同時做試劑空白試驗。空白試驗。5.結(jié)果計算結(jié)果計算 X試樣中氨基酸態(tài)氮的含量，試樣中氨基酸態(tài)氮的含量，g/100mL V1 測定用試樣稀釋液加入甲醛后消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)測定用試樣稀釋液加入甲醛后消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn) 滴定液的體積，滴定液的體積，mL V2 試劑空白試驗加入甲醛后消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴試劑空白試驗加入甲醛后消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴 定液的體積，定液的體積，mL V 3試樣稀釋液取用量，試樣稀釋液取用量， mL C 氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度，氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度，mol/L 0.014 與與1.00 mL氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液相當(dāng)?shù)?/p>

53、氮氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液相當(dāng)?shù)牡?的質(zhì)量，的質(zhì)量，g計算結(jié)果保留兩位有效數(shù)字計算結(jié)果保留兩位有效數(shù)字1001005014. 0)(321VcVVX 適用于混濁和色深樣液，終點顏色難以適用于混濁和色深樣液，終點顏色難以觀察的樣品。觀察的樣品。（三）比色法（三）比色法 同蛋白質(zhì)測定中的分光光度法同蛋白質(zhì)測定中的分光光度法（四）茚三酮的比色法（四）茚三酮的比色法 原理：氨基酸在一定條件下與茚三酮起反應(yīng)，生成原理：氨基酸在一定條件下與茚三酮起反應(yīng)，生成藍(lán)紫色化合物，可比色定量。藍(lán)紫色化合物，可比色定量。GB/T5009.39-2003GB/T5009.39-2003醬油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法醬油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分

54、析方法4.24.2氨基酸態(tài)氮氨基酸態(tài)氮甲醛值法甲醛值法比色法比色法第七節(jié)第七節(jié) 氨基酸的分離與測定氨基酸的分離與測定 一薄層色譜法（薄層層析法（一薄層色譜法（薄層層析法（TLC TLC 法）法）Thin Layer ChromatographyThin Layer Chromatography簡介：簡介： 近年來發(fā)展起來的一種微量而快速的層析近年來發(fā)展起來的一種微量而快速的層析方法，它把吸附劑或支持劑均勻的鋪在玻璃板方法，它把吸附劑或支持劑均勻的鋪在玻璃板上成一薄層，把樣品點在薄層上，然后用合適上成一薄層，把樣品點在薄層上，然后用合適的溶劑展開，從而達(dá)到分離、鑒定和定量的目的溶劑展開，從而達(dá)到

55、分離、鑒定和定量的目的。因為層析在薄層上進(jìn)行，所以稱為薄層層的。因為層析在薄層上進(jìn)行，所以稱為薄層層析。它的應(yīng)用范圍比紙上層析更廣泛，常用來析。它的應(yīng)用范圍比紙上層析更廣泛，常用來分析氨基酸、農(nóng)藥殘留量、黃曲霉毒素等。分析氨基酸、農(nóng)藥殘留量、黃曲霉毒素等。（一）原理：（一）原理： 取一定量經(jīng)水解的樣品溶液，滴在制好的薄層取一定量經(jīng)水解的樣品溶液，滴在制好的薄層板上，在溶劑系統(tǒng)中進(jìn)行雙向上行法展開，板上，在溶劑系統(tǒng)中進(jìn)行雙向上行法展開，樣品各樣品各組分在薄層板上經(jīng)過多次的被吸附、解吸、交換等組分在薄層板上經(jīng)過多次的被吸附、解吸、交換等作用，同一物質(zhì)具有相同的作用，同一物質(zhì)具有相同的Rf值，不同成

56、分則有不值，不同成分則有不同的同的Rf值，因而各種混合物可達(dá)到彼此被分離的目值，因而各種混合物可達(dá)到彼此被分離的目的。然后用茚三酮顯色，與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸進(jìn)行對比，的。然后用茚三酮顯色，與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸進(jìn)行對比，鑒別各種氨基酸種類，從顯色斑點顏色的深淺可以鑒別各種氨基酸種類，從顯色斑點顏色的深淺可以大致確定其含量。大致確定其含量。 R Rf f = a / b = a / bab樣點樣點溶劑前沿溶劑前沿點樣原點點樣原點優(yōu)點：優(yōu)點： 展開時間短，一般在展開時間短，一般在20302030分鐘，展開距離分鐘，展開距離通常只需通常只需10 cm10 cm，且分離效果好。，且分離效果好。 層析后得到的斑點小而清晰

57、。層析后得到的斑點小而清晰。 能夠使用多種顯色劑。能夠使用多種顯色劑。 點樣量少，靈敏度高。（比紙層析高點樣量少，靈敏度高。（比紙層析高1010010100倍）倍） 精確到精確到0.01ug0.01ug。 也可用于大量分離也可用于大量分離500 mg500 mg，作為樣品制備，作為樣品制備層析。層析。缺點：缺點：R Rf f值重現(xiàn)性比紙上層析差。值重現(xiàn)性比紙上層析差。分類：按層析的原理可分為：吸附、分配、分類：按層析的原理可分為：吸附、分配、離子交換、凝膠等。離子交換、凝膠等。（三）操作方法：（三）操作方法： 薄層板制備薄層板制備 樣品液制備樣品液制備 點樣：距薄板底端點樣：距薄板底端2cm2

58、cm處，用針畫一標(biāo)記作為處，用針畫一標(biāo)記作為 原點。再以點樣距扳子寬窄可點幾個點同時原點。再以點樣距扳子寬窄可點幾個點同時 展開，點與點之間間隔展開，點與點之間間隔1 12cm2cm。a.a.可用毛細(xì)玻璃管、微量吸管或微量注射器。注可用毛細(xì)玻璃管、微量吸管或微量注射器。注 意要等一個點干了再點另一個點。意要等一個點干了再點另一個點。b.b.用一小直徑用一小直徑3 mm 3 mm 濾紙片，浸入樣液，埋到濾紙片，浸入樣液，埋到 板子上先挖好一個小洞穴。板子上先挖好一個小洞穴。 展開：點樣完了，放入密閉容器中（展開展開：點樣完了，放入密閉容器中（展開槽），傾斜一定角度槽），傾斜一定角度1010303

59、0，下端浸入展，下端浸入展開劑開劑1cm1cm，千萬別讓溶劑浸過了樣點。到離，千萬別讓溶劑浸過了樣點。到離頂端一部分，取出樣板、晾干、顯色。頂端一部分，取出樣板、晾干、顯色。a.a.展開劑的有關(guān)情況：主要是低沸點的展開劑的有關(guān)情況：主要是低沸點的2 23 3種有種有機溶劑組成的溶劑系統(tǒng)，分離效果主要決定于展機溶劑組成的溶劑系統(tǒng)，分離效果主要決定于展開劑的選擇，因為吸附劑在一定情況下是恒定的，開劑的選擇，因為吸附劑在一定情況下是恒定的，吸附劑的選擇余地遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于展開劑的選擇吸附劑的選擇余地遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于展開劑的選擇。b.b.展開劑的選擇方法：展開劑的選擇方法：.微量圓環(huán)法。微量圓環(huán)法。.用小載波片試驗，微量展開劑展開用小載波片試驗，微量展開劑展開5cm5cm。.圖解法：圖解法：樣品極性小，選吸附劑活性高，展開劑極性低的。樣品極性小，選吸附劑活性高，展開劑極性低