環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)-南開大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院TheCol

1、環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)一實(shí)驗(yàn)一培養(yǎng)基的制備培養(yǎng)基的制備 培養(yǎng)基是用人工的辦法將多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)按微生物生長(zhǎng)代謝的需要配制成的一種營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。培養(yǎng)基中均應(yīng)含有滿足微生物生長(zhǎng)發(fā)育且比例合適的水分、碳源、氮源、無機(jī)鹽、生長(zhǎng)因素以及某些特需的微量元素外還應(yīng)具有適宜的酸堿度pH值、緩沖能力、氧化還原電位和滲透壓。 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)和掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟 二、實(shí)驗(yàn)器材 (1)藥品和試劑：牛肉膏、蛋白陳、NaCl、10NaOH溶液、l0鹽酸溶液?？扇苄缘矸邸2HPO4、MgSO47H2O、KNO3、NaCl、FeSO47H2O、瓊脂、10NaOH溶液、10鹽酸。(2)器材：

2、小燒杯、小鋁鍋、天平、牛角匙、1000mL刻度燒杯、玻棒、pH試紙、試管、分裝漏斗、棉花。 三、方法與步驟1、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配制 (1)培養(yǎng)基配方： 牛肉膏5.0g 蛋白胨10.0g、NaCl5.0g、瓊脂20.0g、自來水1000mL、pH7.0。 (2)操作步驟： 1）稱藥品 按實(shí)際用量計(jì)算后，按配方稱取各種藥品放入大燒杯中。牛肉膏可放在小燒杯或表面皿中稱量，用熱水溶解后倒入大燒杯；也可放在稱量紙上稱量，隨后放人熱水中，牛肉膏便與稱量紙分離，立即取出紙片。蛋白胨極易吸潮，故稱量時(shí)要迅速。 2）加熱溶解 在燒杯中加入少于所需要的水量，小火加熱，并用玻棒攪拌，待藥品完全溶解后再補(bǔ)充水分至

3、所需量。若配制固體培養(yǎng)基，則將稱好的瓊脂放入已溶解的藥品中，再加熱融化，此過程中需不斷攪拌，以防瓊脂糊底或溢出，最后補(bǔ)足所失的水分。3）調(diào)pH 檢測(cè)培養(yǎng)基的pH，若pH偏酸，可滴加1滴1molL-1NaOH，邊加邊攪拌，并隨時(shí)用pH試紙檢測(cè)，直至達(dá)到所需pH范圍。若偏堿，則用1molL-1HCl進(jìn)行調(diào)節(jié)。pH的調(diào)節(jié)通常放在加瓊脂之前。應(yīng)注意pH值不要調(diào)過頭，以免回調(diào)而影響培養(yǎng)基內(nèi)各離子的濃度。4）過濾 液體培養(yǎng)基可用濾紙過濾，固體培養(yǎng)基可用4層紗布趁熱過濾，以利結(jié)果的觀察。但是供一般使用的培養(yǎng)基，該步可省略。5）分裝 披實(shí)驗(yàn)要求，可將配制的培養(yǎng)基分裝入試管或三角瓶?jī)?nèi)。分裝時(shí)可用漏斗以免使培養(yǎng)基

4、沾在管口或瓶口上面造成污染(見圖41)。分裝量：固體培養(yǎng)基約為試管高度的15，滅菌后制成斜面（圖42）。分裝入三角瓶?jī)?nèi)以不超過其容積的一半為宜。半固體培養(yǎng)基以試管高度的1/3為宜滅菌后垂直待凝。 6）加棉塞 試管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脫脂棉)制作的棉塞，棉塞制作方法如圖43。棉塞的形狀、大小和松緊度要合適，四周緊貼管壁，不留縫隙，才能起到防止雜菌侵入和有利通氣的作用。要使棉塞總長(zhǎng)約35塞入試管口或瓶口內(nèi)，以防棉塞脫落。有些微生物需要更好的通氣，則可用8層紗布制成通氣塞。有時(shí)也可用試管帽或塑料塞代替棉塞。7）包扎 加塞后，將三角瓶的棉塞外包一層牛皮紙，以防滅菌時(shí)冷凝水沾濕棉塞。8）培養(yǎng)基

5、的滅菌時(shí)間和溫度，需按照各種培養(yǎng)基的規(guī)定進(jìn)行，以保證滅菌效果和不損培養(yǎng)基的必要成份。培養(yǎng)基經(jīng)滅菌后，必須放37溫室培養(yǎng)24h，無菌生長(zhǎng)者方可使用。 圖 例 圖41 培養(yǎng)基分裝 圖42 斜面制作 圖43 棉塞制作方法2、高氏一號(hào)培養(yǎng)基的制備、高氏一號(hào)培養(yǎng)基的制備(1)培養(yǎng)基配方：可溶性淀粉培養(yǎng)基配方：可溶性淀粉20g、KNO3 1.0g、K2HPO4 0.5g、MgSO47H2O 0.5g、NaCl 0.5g、FeSO47H2O 0.01g、瓊脂、瓊脂 20g、蒸、蒸餾水餾水1000mL、pH 7.27.4。 (2)操作步驟：1）稱量和溶解 先計(jì)算后稱量，按用量先稱取可溶性淀粉，放入小燒杯中，并

6、用少量冷水將其調(diào)成糊狀，再加少于所需水量的沸水中，繼續(xù)加熱，邊加熱邊攪拌，至其完全溶解。再加入其他成分依次溶解。對(duì)微量成分FeSO47H2O可先配成高濃度的貯備液后再加入，方法是先在100mL水中加入1g的FeSO47H2O，配成濃度為0.01gL-1的貯備液，再在1000mL培養(yǎng)基中加入以上貯備液1mL即可。待所有藥品完全溶解后補(bǔ)充水分到所需的總體積。如要配制固體培養(yǎng)基，其瓊脂溶解過程同牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配制。 2）pH調(diào)節(jié)、分裝、包扎、滅菌及無菌檢查同牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配制。3常用的真菌培養(yǎng)基配方（1）馬鈴薯培養(yǎng)基：用以分離培養(yǎng)霉菌、酵母菌 馬鈴薯(去皮) 200g 葡萄糖(或蔗糖) 20

7、g 瓊脂 20g 水 1000mL pH自然 121滅菌30min上述培養(yǎng)基中加入1的酵母粉或蛋白胨，則能促進(jìn)孢子的大量增加。 （2）蔗糖硝酸鈉培養(yǎng)基（察氏培養(yǎng)基）：適合于鑒定多數(shù)霉菌蔗糖 30gK2HPO4 1gKCl 1gNaNO4 2gMgSO47H2O 0.5gFeSO47H2O 0.01g水 1000mL pH 6.7如用以分離霉菌時(shí)可加乳酸調(diào)節(jié)成pH5.05.5，制成酸性培養(yǎng)基。 （3）馬丁(Martin)孟加拉紅一鏈霉素培養(yǎng)基： 葡萄糖 10g 蛋白胨 7g K2HPO4 1.0g MgSO47H2O 0.5g 孟加拉水溶液(13000)100mL 水 800mL121滅菌30分

8、鐘使用時(shí)加鏈霉素： 取國產(chǎn)1g裝鏈霉素一瓶用無菌注射器注入無菌蒸餾水5mL。溶解后，吸取出0.5mL鏈霉素溶液，移注入330mL無菌蒸餾水即得0.03鏈霉素。 上述基礎(chǔ)培養(yǎng)基在沸水鍋中融化后冷卻至5560，每10mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基加1mL0.03鏈霉素溶液(含鏈霉素30L mL-1)（4）麥芽汁培養(yǎng)基： 麥芽汁 20g 蛋白胨 1g 葡萄糖 20g 水 1000mL 瓊脂 20g pH 5（5）豆芽汁培養(yǎng)基，適用于酵母和霉菌。）豆芽汁培養(yǎng)基，適用于酵母和霉菌。 黃豆芽（或綠豆芽）黃豆芽（或綠豆芽） 100g 白糖（或蔗糖）白糖（或蔗糖） 1030g 瓊脂瓊脂 20g 水水 1000mL 先將洗凈的

9、豆芽放在水中煮沸先將洗凈的豆芽放在水中煮沸30min，用，用2層紗布濾去豆芽，將豆芽汁補(bǔ)足水分，加層紗布濾去豆芽，將豆芽汁補(bǔ)足水分，加糖（培養(yǎng)酵母時(shí)糖量要高）糖（培養(yǎng)酵母時(shí)糖量要高）pH自然。自然。四、注意事項(xiàng)稱藥品用的牛角匙不要混用；稱完藥品應(yīng)及時(shí)蓋緊瓶蓋。調(diào)pH時(shí)要小心操作，避免回調(diào)，不同培養(yǎng)基各有配制特點(diǎn)，要注意具體操作。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告記錄本實(shí)驗(yàn)配制培養(yǎng)第的名稱、數(shù)量，并圖解說明其配制過程，指明要點(diǎn)。六、問題和思考1配制培養(yǎng)基有哪幾個(gè)步驟?在操作過程中應(yīng)注意些什么問題?為什么?2培養(yǎng)基配制完成后，為什么必須立即滅菌?若不能及時(shí)滅菌應(yīng)如何處理？已滅菌的培養(yǎng)基進(jìn)行無菌檢查？3牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基

10、屬何種培養(yǎng)基？它除了培養(yǎng)細(xì)菌外，能培養(yǎng)真菌和放線菌嗎？高氏培養(yǎng)基屬何種培養(yǎng)基?除培養(yǎng)放線菌外高氏培養(yǎng)基還能培養(yǎng)細(xì)菌和真菌嗎?為什么? 采用強(qiáng)烈的理化因素使任何物體內(nèi)外所有的微生物永遠(yuǎn)喪失其生長(zhǎng)繁殖能力的措施稱之為滅菌。滅菌是要進(jìn)行微生物純培養(yǎng)的需要。 實(shí)驗(yàn)室最常用的滅菌方法是利用高溫處理達(dá)到殺菌效果。高溫主要是使微生物的蛋白質(zhì)和核酸等重要生物大分子發(fā)生變性。高溫滅菌分為干熱滅菌和濕熱滅菌兩大類。濕熱滅菌的效果比優(yōu)于干熱滅菌。濕熱下熱量易于傳遞，更容易破壞保持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的氫鍵等結(jié)構(gòu)，加速其變性。此外，過濾除菌、射線滅菌和消毒、化學(xué)藥物滅菌和消毒等也是微生物學(xué)操作中不可缺少的常用方法。 實(shí)驗(yàn)二實(shí)

11、驗(yàn)二 消毒和滅菌消毒和滅菌 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛢?nèi)容目的：了解消毒和滅菌的原理并掌握各種滅菌方法的操作步驟。內(nèi)容：1高壓蒸汽滅菌法。2干熱滅菌法。3過濾除菌法。 二、實(shí)驗(yàn)材料和用具待滅菌的培養(yǎng)基和鏈霉素溶液。高壓蒸汽滅菌鍋、電熱烘箱、過濾除菌器、培養(yǎng)皿、試管 三、操作步驟()高壓蒸汽滅菌法高壓蒸汽滅菌法適用于培養(yǎng)基、無菌水、工作服等物品的滅菌。1加水 將內(nèi)層滅菌桶取出，再向外層鍋內(nèi)加入適量的水，以水面與三角架相平為至。2裝料 將裝料桶放回鍋內(nèi)，裝入待滅菌的物品。裝有培養(yǎng)基的容器放置時(shí)要防止液體溢出，瓶塞不要緊貼桶壁，以防冷凝水沾濕棉塞。3加蓋 將蓋上與排氣孔相連接的排氣軟管插人內(nèi)層滅菌桶的排氣槽內(nèi)，

12、擺正鍋蓋，對(duì)齊螺口，然后以同時(shí)旋緊相對(duì)的兩個(gè)螺栓的方式擰緊所有螺栓，并打開排氣閥；4排氣 加熱待水煮沸后，水蒸汽和空氣一起從排氣孔排出。一般認(rèn)為，當(dāng)水沸后約5min，表明鍋內(nèi)空氣已排凈。5升壓 當(dāng)鍋內(nèi)空氣排凈時(shí)，即可關(guān)閉排氣閥，壓力開始上升。6保壓保壓 當(dāng)壓力表指針達(dá)到所需壓力刻度時(shí)，當(dāng)壓力表指針達(dá)到所需壓力刻度時(shí)，控制熱源。開始計(jì)時(shí)并維持壓力至所需時(shí)控制熱源。開始計(jì)時(shí)并維持壓力至所需時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)用間。本實(shí)驗(yàn)用121，20min滅菌。滅菌。7降壓降壓 達(dá)到所需滅菌時(shí)間后，關(guān)閉熱源，達(dá)到所需滅菌時(shí)間后，關(guān)閉熱源，讓壓力自然下降到零后，打開排氣閥。放讓壓力自然下降到零后，打開排氣閥。放凈余下的蒸汽

13、后，再打開鍋蓋，取出滅菌凈余下的蒸汽后，再打開鍋蓋，取出滅菌物品，倒掉鍋內(nèi)剩水。物品，倒掉鍋內(nèi)剩水。8無菌檢查無菌檢查 將已滅菌培養(yǎng)基于將已滅菌培養(yǎng)基于37培養(yǎng)培養(yǎng)24h，無雜菌生長(zhǎng)，即可待用。無雜菌生長(zhǎng)，即可待用。(二)干熱滅菌法干熱滅菌法適用于玻璃器皿，如試管、培養(yǎng)皿、三角瓶、移液管等的滅菌；1 裝入待滅菌物品 預(yù)先將各種器皿用紙包好或裝入金屬制的培養(yǎng)皿筒、移液管筒內(nèi)，然后放人電熱烘箱中。2升溫 關(guān)好電烘箱門，打開電源開關(guān)，旋動(dòng)恒溫調(diào)節(jié)器至所需溫度刻度(本實(shí)驗(yàn)所需為160170)，此時(shí)烘箱紅燈亮，表明烘箱已開始加熱，當(dāng)溫度上升至所設(shè)定溫度后則烘箱綠燈亮，表示已停止加溫。3恒溫恒溫 當(dāng)溫度升

14、到所需溫度后，維持此溫當(dāng)溫度升到所需溫度后，維持此溫度度2h。4降溫降溫 切斷電源，自然降溫。切斷電源，自然降溫。5.取出滅菌物品取出滅菌物品 待電烘箱內(nèi)溫度降到待電烘箱內(nèi)溫度降到70以以下后，才能打開箱門，取出滅菌物品。下后，才能打開箱門，取出滅菌物品。(三)過濾除菌法有些物質(zhì)，如抗生素、血清、維生素等易受熱分解，因而要采用過濾除菌法。1過濾器的種類(1)濾膜過濾器：由醋酸纖維素、硝酸纖維素等制成，有孔徑大小不同的多種規(guī)格(如0.1m、0. 22m、0.3m、0. 45m等)，過濾細(xì)菌常用0.45m孔徑。其優(yōu)點(diǎn)是吸附性小，即溶液中的物質(zhì)損耗少，濾速快，每張濾膜只使用1次，不用清洗。 (2)蔡

15、氏濾器：是一種金屬制成的過濾漏斗，蔡氏濾器：是一種金屬制成的過濾漏斗，其過濾部分是一種用石棉纖維和其他填充其過濾部分是一種用石棉纖維和其他填充物壓制成的片狀結(jié)構(gòu)。溶液中的細(xì)菌通過物壓制成的片狀結(jié)構(gòu)。溶液中的細(xì)菌通過石棉纖維的吸附和過濾而被去除，但對(duì)溶石棉纖維的吸附和過濾而被去除，但對(duì)溶液中其他物質(zhì)的吸附性也大。每張纖維板液中其他物質(zhì)的吸附性也大。每張纖維板只能使用只能使用1次。次。(3)玻璃濾器：是一種由玻璃制成的過濾漏斗，玻璃濾器：是一種由玻璃制成的過濾漏斗，其過濾部分是由細(xì)玻璃粉燒結(jié)成的板狀構(gòu)其過濾部分是由細(xì)玻璃粉燒結(jié)成的板狀構(gòu)造。玻璃濾器規(guī)格很多，造。玻璃濾器規(guī)格很多，5號(hào)號(hào)(孔徑孔徑2

16、5m)和和6號(hào)號(hào)(孔徑小于孔徑小于2m)適用于過濾細(xì)菌。其適用于過濾細(xì)菌。其優(yōu)點(diǎn)是吸附量少，但每次使用后要洗凈再優(yōu)點(diǎn)是吸附量少，但每次使用后要洗凈再用。清洗方法是：用水充分沖洗，然后浸用。清洗方法是：用水充分沖洗，然后浸于含于含1KNO3的濃硫酸中的濃硫酸中24h，再用蒸餾水，再用蒸餾水抽洗數(shù)次。在抽洗液中加人數(shù)滴抽洗數(shù)次。在抽洗液中加人數(shù)滴BaCl2，至，至不出現(xiàn)不出現(xiàn)BaSO4沉淀時(shí)，即表示已洗凈。沉淀時(shí)，即表示已洗凈。 2過濾裝置（1）按圖4-4進(jìn)行安裝，為阻止空氣中細(xì)菌進(jìn)人濾瓶而在接管處塞入棉花、外用紙包好進(jìn)行121濕熱滅菌20min。(2)為加快過濾速度，一般用負(fù)壓抽氣過濾，可接真空

17、泵進(jìn)行抽濾。 四、注意事項(xiàng)1使用滅菌鍋應(yīng)嚴(yán)格按照操作程序進(jìn)行，避免發(fā)生事故；滅菌時(shí)，操作者切勿擅自離開，務(wù)必待壓力下降到零后，才可打開鍋蓋。2干熱滅菌時(shí)電烘箱中物品不要擺得太擁擠，以免阻礙空氣流通而影響滅菌效果；滅菌物品不要與電烘箱內(nèi)壁的鐵板接觸以免包裝紙烤焦起火。3過濾除菌時(shí)應(yīng)注意檢查過濾裝置各連接處是否漏氣，以防污染。 五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告1記錄各種不同物品所用的滅菌方法及滅菌條件(溫度、壓力等)。2試述高壓蒸汽滅菌的操作過程及注意事項(xiàng)。六、問題和思考 1比較各種滅菌方法的原理及適用范圍。2高壓蒸汽滅菌中為什么要把冷空氣排凈，為什么在滅菌后不能驟然快速降壓，并要再放盡鍋內(nèi)蒸汽才能打開鍋蓋? 微生物

18、接種技術(shù)是進(jìn)行微生物實(shí)驗(yàn)和相關(guān)研究的基本操作技能。 無菌操作是微生物接種技術(shù)的關(guān)鍵。斜面接種、液體接種、固體接種和穿刺接種操作均以獲得生長(zhǎng)良好的純種微生物為目的。 由于接種方法不同，采用的接種工具也有區(qū)別，如固體斜面培養(yǎng)體轉(zhuǎn)接時(shí)用接種環(huán)；穿刺接種時(shí)用接種針，液體轉(zhuǎn)接用移液管等。實(shí)驗(yàn)三實(shí)驗(yàn)三 微生物的接種技術(shù)微生物的接種技術(shù) 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模毫私飧鞣N微生物接種方法。二、實(shí)驗(yàn)材料和用具：已滅菌培養(yǎng)基、接種環(huán)、接種針、酒精燈、移液管、記號(hào)筆 三、實(shí)驗(yàn)步驟：1、斜面接種技術(shù)斜面接種是從已生長(zhǎng)好的菌種斜面上挑取少量菌種移植至另一新鮮斜面培養(yǎng)基上的一種接種方法。具體操作如下：(1)貼標(biāo)簽 接種前在試管上貼上

19、標(biāo)簽，注明菌名、接種日期、接種人姓名等。貼在距試管口約23cm的位置。(若用記號(hào)筆標(biāo)記則不需標(biāo)簽)。 。(2)點(diǎn)燃酒精燈。(3)接種 用接種環(huán)將少許菌種移接到貼好標(biāo)簽的試管斜面上。操作必須按無菌操作法進(jìn)行。簡(jiǎn)述如下：1)手持試管 將菌種和待接斜面的兩支試管用大姆指和其他四指握在左手中使中指位于兩試管之間部位。斜面面向操作者，并使它們位于水平位置。 2)旋松管塞 先用有于松動(dòng)棉塞或塑料管蓋，以便接種時(shí)拔出。3)取接種環(huán) 右手拿接種環(huán)，在火焰上將環(huán)端灼燒滅菌然后將有可能伸入試管中的其余部分均灼燒滅菌，重復(fù)此操作再灼燒一次。4)拔管塞 用右手的無名指、小指和手掌邊先后取下菌種管和待接試管的管塞，然后

20、讓試管口緩緩過火滅菌(切勿燒得過燙)。見圖46(a)所示。 圖46 試管拔塞后過火滅菌和取菌 8)塞管塞 取出接種環(huán)，灼燒試管口，并在火焰旁將管塞旋上。不要用試管去迎棉塞，以免試管在移動(dòng)時(shí)納入不潔空氣。9)將接種環(huán)灼燒滅菌。放下接種環(huán)，再將棉花塞旋緊。 2、液體接種技術(shù) (1)用斜面菌種接種液體培養(yǎng)基時(shí)，有下面兩種情況：如接種量小，可用接種環(huán)取少量菌體移入培養(yǎng)基容器(試管或三角瓶等)中，將接種環(huán)在液體表面振蕩或在器壁上輕輕摩擦把菌苔散開，抽出接種環(huán)，塞好棉塞，再將液體搖動(dòng)，菌體即均勻分布在液體中。如接種量大，可先在斜面菌種管中注入定量無菌水接種環(huán)把菌苔刮下研開，再把菌懸液倒入液體培養(yǎng)基中，倒前

21、需將試管口在火焰上滅菌。(2)用液體培養(yǎng)物接種液體培養(yǎng)基時(shí)，可用無菌的吸管或移液管吸取菌液接種。 3、固體接種技術(shù)固體接種最普遍的形式是接種固體菌制劑。因所用菌種或種子菌來源不同分為：1)用菌液接種固體料 可用菌苔刮洗制成的懸液。接種時(shí)可按無菌操作法將菌液直接例入固體培養(yǎng)基中，攪拌均勻。注意接種所用菌液量要計(jì)算在固體料總加水量之內(nèi)，否則往往在用液體種子菌接種后含水量加大，影響培養(yǎng)效果。2)用固體種子接種固體料 包括用孢子粉、菌絲孢子混合種子菌或其他固體培養(yǎng)的種子菌，直接把接種材料混入滅菌的固體料。接種后必須充分?jǐn)嚢枋怪旌暇鶆颉?4、穿刺接種技術(shù)、穿刺接種技術(shù)穿刺接種技術(shù)是一種用接種針從菌種斜

22、面上穿刺接種技術(shù)是一種用接種針從菌種斜面上挑取少量菌體并把它穿刺到固體或半固體挑取少量菌體并把它穿刺到固體或半固體的深層培養(yǎng)基中的接種方法。經(jīng)穿刺接種的深層培養(yǎng)基中的接種方法。經(jīng)穿刺接種后的菌種常作為保藏菌種的一種形式，同后的菌種常作為保藏菌種的一種形式，同時(shí)也是檢查細(xì)菌運(yùn)動(dòng)能力的一種方法，它時(shí)也是檢查細(xì)菌運(yùn)動(dòng)能力的一種方法，它只適宜于細(xì)菌和酵母的接種培養(yǎng)。具體操只適宜于細(xì)菌和酵母的接種培養(yǎng)。具體操作如下作如下(1)貼標(biāo)簽。貼標(biāo)簽。(2)點(diǎn)燃酒精燈。點(diǎn)燃酒精燈。 (3)穿刺接種，方法如下1)手持試管。2)旋松棉塞。3)右手拿接種針在火焰上將針端灼燒滅菌，接著把在穿刺中可能伸入試管的其他部位也灼

23、燒滅菌；4)用右手的小指和手掌邊拔出棉塞。接種針先在培養(yǎng)基部分冷卻再用接種針的針尖沾取少量菌種。 5)接種有兩種手持操作法。一種是水平法，它類似于斜面接種法。一種則稱垂直法，如圖48所示。盡管穿刺時(shí)手持方法不同，但穿刺時(shí)所用接種針都必須挺直，將接種針自培養(yǎng)基中心垂直地刺入培養(yǎng)基中。穿刺時(shí)要做到手穩(wěn)、動(dòng)作輕巧快速，并且要將接種針穿刺到接近試管的底部，然后沿著接種線將針拔出。最后，塞上棉塞，再將接種針上殘留的菌在火焰上燒掉。(4)將接種過的試管直立于試管架上，放在37或28恒溫箱中培養(yǎng)。24h后觀察結(jié)果(注意：若具有運(yùn)動(dòng)能力的細(xì)菌，它能沿著接種線向外運(yùn)動(dòng)而彌散，故形成的穿刺線較粗而散、反之則細(xì)而密

24、)。 圖圖47斜面劃線法（斜面劃線法（a）和不同細(xì)菌直線接種長(zhǎng)出的菌苔形態(tài)（）和不同細(xì)菌直線接種長(zhǎng)出的菌苔形態(tài)（b）圖48 穿刺接種：（a）水平穿刺接種；（b）垂直穿刺接種 四、實(shí)驗(yàn)報(bào)告四、實(shí)驗(yàn)報(bào)告列表比較各種接種方法及注意事項(xiàng)。列表比較各種接種方法及注意事項(xiàng)。五、問題和討論五、問題和討論1、 斜面接種取菌前為什么要將灼燒過的接斜面接種取菌前為什么要將灼燒過的接種針在無菌培養(yǎng)基上沾一下？種針在無菌培養(yǎng)基上沾一下？穿刺接種時(shí)能否將接種針直接穿透培養(yǎng)基？穿刺接種時(shí)能否將接種針直接穿透培養(yǎng)基？ 微生物都是個(gè)體微小的生物，用肉眼不能看到它們微生物都是個(gè)體微小的生物，用肉眼不能看到它們的個(gè)體，所以觀察它

25、們的形態(tài)必須在顯微鏡下進(jìn)的個(gè)體，所以觀察它們的形態(tài)必須在顯微鏡下進(jìn)行，另外微生物細(xì)胞具有較高的透明性，所以有行，另外微生物細(xì)胞具有較高的透明性，所以有些微生物（尤其是細(xì)菌和放線菌）需要經(jīng)過染色些微生物（尤其是細(xì)菌和放線菌）需要經(jīng)過染色后才能觀察清楚，細(xì)菌個(gè)體很小，其大小以微米后才能觀察清楚，細(xì)菌個(gè)體很小，其大小以微米計(jì)，所以需要在油鏡下觀察。放線菌和霉菌的個(gè)計(jì)，所以需要在油鏡下觀察。放線菌和霉菌的個(gè)體一般呈絲狀，并且明顯地分為基質(zhì)菌絲和氣生體一般呈絲狀，并且明顯地分為基質(zhì)菌絲和氣生菌絲。成熟地個(gè)體還具有各種形態(tài)的孢子。菌絲。成熟地個(gè)體還具有各種形態(tài)的孢子。實(shí)驗(yàn)四實(shí)驗(yàn)四 微生物形態(tài)的觀察微生物形

26、態(tài)的觀察 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛢?nèi)容目的：通過實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)觀察微生物形態(tài)的基本方法，了解細(xì)菌、放線菌和霉菌的形態(tài)特征。內(nèi)容：1. 觀察細(xì)菌的基本形態(tài)和結(jié)構(gòu)染色裝片。 2觀察放線菌形態(tài)裝片。3觀察霉菌染色裝片，仔細(xì)觀察基質(zhì)菌絲、氣生菌絲和孢子形態(tài)。4掌握細(xì)菌制片方法。 二、實(shí)驗(yàn)材料和用具 葡萄球菌、大腸桿菌、棒桿菌、螺菌的斜面菌種，放線菌平板培養(yǎng)物，霉菌平板培養(yǎng)物。 香柏油、二甲苯、無菌水。 顯微鏡、擦鏡紙、接種環(huán)、酒精燈、載玻片。 三、操作步驟 1、觀察細(xì)菌的基本形態(tài) 用低倍鏡、高倍鏡和油鏡觀察球菌、桿菌、螺菌，并分別在油鏡下繪圖。 2、觀察細(xì)菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)用低倍鏡、高倍鏡和油鏡觀察巨大芽孢桿菌(示細(xì)胞壁)

27、、巨大芽孢桿菌(示異染粒)、蘇云金芽孢桿菌(示伴胞晶體)、普通變形菌(示鞭毛)、丙酮丁醇梭菌(示芽孢)、褐球固氮菌(示莢膜)等細(xì)菌，并繪圖。3、觀察放線菌、霉菌染色裝片。用低倍鏡觀察放線菌、霉菌菌絲形態(tài)，包括基質(zhì)菌絲、氣生菌絲；放線菌孢子絲；根霉假根，孢子囊；曲霉、青霉分生孢子梗及分生孢子。4、觀察枯草芽孢桿菌活菌常用壓滴法。如圖4-9所示。 圖49 壓滴法制片示意圖 1）將潔凈無油膩的載片放于自己右邊前方，在中央放小滴無菌水。 （2）將酒精燈放于自己正前方，點(diǎn)燃。 （3）用無菌操作方法從枯草芽孢桿菌斜面中沾取少量菌體，與載片上的水滴充分混勻，把接種環(huán)上殘留的菌體殺滅后，放回試管架。 （4）用

28、鑷子夾一潔凈的蓋玻片，使其一邊先接觸菌液然后將整個(gè)蓋玻片慢慢放下，注意不要產(chǎn)生氣泡。如菌液過多，可用吸水紙適當(dāng)吸去一部分。 （5）先用低倍鏡然后轉(zhuǎn)用高倍鏡觀查，觀察時(shí)光線要適當(dāng)調(diào)暗些。 四、注意事項(xiàng) 1、注意擦鏡頭時(shí)，只能用擦鏡紙。 2、觀察完畢，必須將鏡筒上升，才能取下裝片放入另一裝片后，要按使用油鏡要求，重新操作不能在油鏡下直接取下和替換裝片，切記！ 3、無菌操作過程中，接種環(huán)滅菌后不能觸及其他物品，挑菌不能過多。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告1、給出你所觀察到的幾種細(xì)菌的個(gè)體形態(tài)視野圖。2、繪出你所觀察到的細(xì)菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)視野圖，并注明各部分。六、問題和討論1、出在制備活菌裝片時(shí)，應(yīng)注意什么問題?2、用明視野

29、顯微鏡觀察細(xì)菌的形態(tài)時(shí)，你認(rèn)為用染色裝片好，還是用非染色的活體裝片好？為什么？觀察活體裝片與染色裝片，光線調(diào)節(jié)各有什么不同?3、無菌操作過程中，可否將棉塞放在桌面上?為什么?4、試設(shè)計(jì)一個(gè)準(zhǔn)備本實(shí)驗(yàn)的工作方案。 用于生物染色的染料主要有堿性染料、酸性染料和中性染料三大類。堿性染料的離子帶正電荷，能和帶負(fù)電荷的物質(zhì)結(jié)合。因細(xì)菌蛋電質(zhì)等電點(diǎn)較低，當(dāng)它生長(zhǎng)于中性、堿性或弱酸性的溶液中時(shí)常帶負(fù)電荷，所以通常采用堿性染料(如美藍(lán)、結(jié)晶紫、堿性復(fù)紅或孔雀綠等)使其著色。酸性染料的離子帶負(fù)電荷，能與帶正電荷的物質(zhì)結(jié)合。當(dāng)細(xì)菌分解糖類產(chǎn)酸使培養(yǎng)基pH值下降時(shí)，細(xì)菌所帶正電荷增加，因此易被伊紅、酸性復(fù)紅或剛果紅

30、等酸性染料著色。中性染料是前兩者的結(jié)合物又稱復(fù)合染料如伊紅美藍(lán)、伊紅天青等。 實(shí)驗(yàn)五實(shí)驗(yàn)五 細(xì)菌染色法及微生物的觀察細(xì)菌染色法及微生物的觀察 簡(jiǎn)單染色法是只用一種染料使細(xì)菌著色以顯示其形態(tài)的方法難于辨別細(xì)菌細(xì)胞的構(gòu)造。 革蘭氏染色法法可將所有的細(xì)菌區(qū)分為革蘭氏陽性菌(G)和革蘭氏陰性菌(G)兩大類，是細(xì)菌學(xué)上是常用的鑒別染色法。該染色法所以能將細(xì)菌分為G菌和G菌，是由這兩類菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和成分的不同所決定的。G菌的細(xì)胞壁中含有較多易被乙醇溶解的類脂質(zhì)，而且肽聚糖層較薄、交聯(lián)度低，故用乙醇或丙酮脫色時(shí)溶解了類脂質(zhì)，增加了細(xì)胞壁的通透性，使初染的結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物易于滲出，結(jié)果細(xì)菌就被脫色，再經(jīng)番

31、紅復(fù)染后就成紅色。G菌細(xì)胞壁中肽聚糖層厚且交聯(lián)度高，類脂質(zhì)含量少，經(jīng)脫色劑處理后反而使肽聚糖層的孔徑縮小，通透性降低，因此細(xì)菌仍保留初染時(shí)的顏色。 細(xì)菌莢膜染色的原理是因?yàn)榍v膜和染料間的親和力弱，不易著色，通常采用負(fù)染色法染莢膜，即設(shè)法使菌體和背景著色而莢膜不著色，從而使莢膜在菌體周圍呈一透明圈。由于莢 膜的含水量在90以上，固染色時(shí)一般不加熱固定，以免莢膜皺縮變形。 細(xì)菌的芽胞具有厚而致密的壁，透性低，不易著色，若用一般染色法只能使菌體著色而芽胞不著色(芽胞呈無色透明狀)。芽胞染色法就是根據(jù)芽胞既難以染色而一旦染上色后又難以脫色這一特點(diǎn)而設(shè)計(jì)的。所有的芽胞染色法都基于同一個(gè)原則：除了用著色力

32、強(qiáng)的染料外，還需要加熱，以促進(jìn)芽胞著色。當(dāng)染芽胞時(shí)，菌體也會(huì)著色，然后水洗，芽胞染上的顏色難以滲出，而菌體會(huì)脫色。然后用對(duì)比度強(qiáng)的染料對(duì)菌體復(fù)染，使菌體和芽胞呈現(xiàn)出不同的顏色，因而能更明顯地襯托出芽胞，便于觀察。 細(xì)菌的鞭毛極細(xì)，直徑一般為1020nm，只有用電子顯微鏡才能觀察到。但是，如采用特殊的染色法，則在普通光學(xué)顯微鏡下也能看到它。鞭毛染色的方法很多但其基本原理相同，即在染色前充用媒染劑處理，讓它沉積在鞭毛上使鞭毛直徑加粗。然后再進(jìn)行染色。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛢?nèi)容目的：鞏固無菌操作技求，掌握細(xì)菌及其結(jié)構(gòu)的染色技術(shù)。內(nèi)容：1、學(xué)習(xí)細(xì)菌單染色操作技術(shù)。 2、學(xué)習(xí)革蘭氏染色技術(shù)。3、學(xué)習(xí)細(xì)菌的莢膜、

33、芽孢及鞭毛染色方法。 二、實(shí)驗(yàn)材料和用具 1、單染色法：（1）大腸桿菌(E.coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的斜面菌種。（2）呂氏美藍(lán)染色液、石炭酸復(fù)紅染色液、黑色素液或碳素墨水、香柏油、二甲苯、無菌水（3）顯微鏡、擦鏡紙、接種環(huán)、酒精燈、載玻片、吸水紙、無菌牙簽。 2、革蘭氏染色：（1） 黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸桿菌（E.coli）菌液，待測(cè)菌菌液l2種；（2） 革蘭氏染色液(結(jié)晶紫染液、盧戈氏碘液、95乙醇、石炭酸復(fù)紅液等)、（3） 香柏油、二甲苯；顯微鏡、擦鏡紙、接種環(huán)、載玻片、吸水紙、試管、小滴管、酒精燈。

34、3、莢膜染色：、莢膜染色： (l)在阿須貝在阿須貝(Ashby)無氮培養(yǎng)基上培養(yǎng)無氮培養(yǎng)基上培養(yǎng)35天天的團(tuán)褐固氮菌的團(tuán)褐固氮菌(Azotobacter chroococcum)或或者培養(yǎng)者培養(yǎng)23天的硅酸鹽細(xì)菌天的硅酸鹽細(xì)菌(Bacillus mucilaginosus subsp silicus) (2)李夫森氏染色液、硼酸鈉美蘭染色液、石李夫森氏染色液、硼酸鈉美蘭染色液、石炭酸復(fù)紅染色液、黑色液。炭酸復(fù)紅染色液、黑色液。(3)載玻片、接種環(huán)、洗瓶。載玻片、接種環(huán)、洗瓶。 (4)顯微鏡。顯微鏡。4、鞭毛染色：(1) 在牛內(nèi)膏蛋白胨斜面上培養(yǎng)1924小時(shí)的假單孢菌(Pseudomonas.s

35、p)，此培養(yǎng)體在取用前經(jīng)過每日移植代，連續(xù)移植57代。(2)新配制的費(fèi)氏及康氏鞭毛染色液A和B。(3)無菌水、無菌空試管、凹玻片。蓋玻片、潔凈載玻片、接種環(huán)、洗瓶。(4)顯微鏡5、芽孢染色：、芽孢染色：(1)在牛肉膏蛋白胨斜面上培養(yǎng)在牛肉膏蛋白胨斜面上培養(yǎng)2436小時(shí)的小時(shí)的枯草桿菌或者蘇云金桿菌?？莶輻U菌或者蘇云金桿菌。(2)載玻片、接種環(huán)、酒精燈、洗瓶、鑷子。載玻片、接種環(huán)、酒精燈、洗瓶、鑷子。(3)顯微鏡。顯微鏡。 (4)香柏油、二甲苯、擦鏡紙香柏油、二甲苯、擦鏡紙(5)孔雀綠染色液、蕃紅染色液?？兹妇G染色液、蕃紅染色液。三、操作步驟 1、單染色法 （1）涂片 在潔凈無脂的載玻片中央滴一

36、小滴無菌水（圖410a），用無菌操作方法從菌種斜面挑取少量菌體與水滴充分混勻，涂成薄膜，涂布面積約11.5cm2（圖410b）。 （2）干燥 將涂片于室溫中自然干燥。 （3）固定 手執(zhí)載片端，使涂菌的一面向上，將載片通過微火23次。在火上固定時(shí)，用手摸涂片反面，以不燙手為宜。不能將載片在火上烤，否則細(xì)菌形態(tài)毀壞(圖410c)。（4）染色 將涂片置于水平位置，滴加染色液覆蓋于涂菌處，染色約2min(圖410d)。 （5）水洗 傾去染色液，斜置載片，用自來水的細(xì)水流由載片上端流下，不得直接沖在涂菌處，直洗至從載片上流下的水中無染色液的顏色為止(圖410e)。 （6）干燥 自然晾干或用吸水紙輕輕地吸

37、干，注意不要擦掉菌體(圖410f)。（7）待標(biāo)本完全干燥后，先用低倍鏡和高倍鏡觀察，將典型部位移至視野中央，再用油鏡觀察。 圖410 單染色方法 （二） 革蘭氏染色法 1、制片 （1 ） 涂菌 用無菌操作方法從試管中沾取菌液一環(huán)，用接種環(huán)在潔凈無脂的載玻片上做一薄而均勻、直徑約1cm的菌膜。涂菌后將接種環(huán)火焰滅菌。 （2）干燥 于空氣中自然干燥。亦可把玻片置于火焰上部略加溫加速干燥(溫度不宜過高)。 （3）固定 目的是殺死細(xì)菌并使細(xì)菌粘附在玻片上，便于染料著色，常用加熱法，即將細(xì)菌涂片面向上，通過火焰3次，以熱而不燙為宜，防止菌體燒焦、變形。此制片可用于染色。2、染色（1）初染：于制片上滴加結(jié)

38、晶紫染液，染1min后，用水洗去剩余染料。（2）滴加盧戈氏碘液，1min后水洗：（3）滴加95乙醇脫色，搖動(dòng)玻片至紫色不再為乙醇脫退為止(根據(jù)涂片之厚薄需時(shí)30s至1min)。（4）復(fù)染 滴加石炭酸復(fù)紅液復(fù)染1min，水洗。（5）用濾紙吸干，油鏡鏡檢。 3、結(jié)果革蘭氏陽性菌染成籃紫色，革蘭氏陰性菌染成淡紅色。4、檢測(cè)未知菌用以上方法對(duì)未知面進(jìn)行革蘭氏染色，并繪圖、記錄染色結(jié)果。 （三）莢膜染色法1石炭酸復(fù)紅染色(1)取培養(yǎng)了72h的褐球固氮菌制成涂片，自然干燥(莢膜是多糖類物質(zhì)，不可用火焰烘干)。(2)滴入12滴95乙醇固定(不可加熱固定)。(3)加石炭酸復(fù)紅染液染色12min，水洗，自然干燥

39、。(4)在載玻片一端加一滴墨汁，另取一塊邊緣光滑的載玻片與墨汁接觸，在以勻速推向另一端，涂成均勻的一薄層，自然干燥。(5)干燥后用油鏡觀察。菌體紅色，莢膜無色，背景黑色。 2背景染色(1)先加1滴墨水于潔凈的玻片上，并挑少量褐球固氮菌與之充分混合均勻。(2)放一清潔蓋玻片于混合液上，然后在蓋玻片上放一張濾紙，向下輕壓，吸收多余的菌液。(3)干燥后用油鏡觀察。背景灰色，菌體較暗在其周圍呈現(xiàn)一明亮的透明圈即莢膜。 3李夫森氏硼酸鈉美蘭染色（1）取在阿須貝氏無氮培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天的硅酸鹽細(xì)菌少許，制成干燥涂片(不要加熱固定)。（2）加李夫森氏染色液染色l0min，傾之染液(勿用水洗)。（3）加硼酸鈉美

40、蘭染色液染色5min，水洗，晾干。（4）油鏡視察可見莢膜被染成紅色，菌體處成藍(lán)色。 （四）鞭毛染色法 1方法一：（1）用接種環(huán)由培養(yǎng)1820h的斜面上取假單胞菌菌體少許，用菌滴制片法檢查細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性。如果菌體的運(yùn)動(dòng)性很強(qiáng)，則可作鞭毛染色。（2）用34mL無菌水，將培養(yǎng)體洗下，移入另一無菌試管中，適溫培養(yǎng)10min，再檢查運(yùn)動(dòng)性。（3）用無菌吸管由懸液上部取一小滴，置于一清潔載玻片的一端，將玻片傾斜。使菌液由一端流向另外一端。于是在玻片上做成23條菌液帶。待水膜自然干燥（切勿用火焰烘）。（4）用剛剛過濾的鞭毛染色液A染色5min(不要加熱)。（5）傾去A液，加鞭毛染色液B染色10min。用蒸餾水

41、輕輕沖洗，晾干。（6）用齊氏石炭酸復(fù)紅染色23min。輕輕沖洗，晾干(不能用吸水紙吸干)。（7）先用低倍鏡，再用高倍鏡，最后用油鏡檢查。 2方法二：（1）制涂片：先加少量無菌蒸餾水于凹載玻片的凹窩中再從培養(yǎng)10h左右的斜面菌苔上取菌一環(huán)，輕放在凹窩水面上(不要攪動(dòng))，放30度溫箱靜置510min取出，從凹窩水面上輕輕取菌液一環(huán)，輕放在干凈的載玻片上(不要涂抹)，放回溫箱，讓其自然干燥(不要加熱固定)。（2）染色：在自然干燥的涂片上，滴加含石炭酸的鞭毛染色液一滴，染色5min，用水輕輕沖洗，讓其自然干燥。（3）鏡檢：用油鏡觀察。 五）芽孢染色法1方法一：(1)取37培養(yǎng)1824h的枯草芽孢桿菌作

42、涂片，并干燥，固定。(2)于載片上滴人35滴5孔雀綠水溶液。(3)用試管夾夾住載玻片在火焰上用微火加熱，自載玻片上出現(xiàn)蒸汽時(shí)，開始計(jì)算時(shí)間約45min。加熱過程中切勿使染料蒸干，必要時(shí)可添加少許染料。(4)傾去染液，待玻片冷卻后，用自來水沖洗至孔雀綠不再褪色為止。(5)用0.5沙黃水溶液(或0.05堿性復(fù)紅)復(fù)染1min，水洗。(6)制片干燥后用油鏡觀察。芽孢呈綠色，菌體紅色。2方法二：(1)加12滴自來水于小試管中，用接種環(huán)從斜面上挑取23環(huán)培養(yǎng)1824h的枯草芽孢桿菌菌苔于試管中，并充分均勻打散，制成濃稠的菌液。 (2)加5孔雀綠水溶液23滴于小試管中用接種環(huán)攪拌使染料與菌液充分混合。 (

43、3)將此試管浸干沸水浴(燒杯)中，加熱1520min。(4)用接種環(huán)從試管底部挑數(shù)環(huán)菌于潔凈的載玻片上，并涂成薄膜，將涂片經(jīng)過微火3次固定。(5)水洗，至流出的水中無孔雀綠顏色為止。(6)加沙黃水溶液，染23min后，傾去染液，不用水洗。(7)干燥后用油鏡觀察。芽孢綠色，菌體紅色。 四、注意事項(xiàng)1載玻片要潔凈無脂，否則菌液涂不開。涂片時(shí)，滴水不要過多，挑菌量宜少，菌膜宜薄，切忌過厚。2在染色過程中，不可使染液干涸。3在革蘭氏染色過程中脫色時(shí)間十分重要，過長(zhǎng)，則脫色過度，會(huì)使陽性菌被染成陰性菌，另外，老齡菌因體內(nèi)核酸減少，會(huì)使陽性菌被染成陰性菌，故不能選用。3 莢膜染色涂片不要用加熱固定，以免莢

44、膜皺縮變形。4 鞭毛染色液最好當(dāng)日配置，次日使用則鞭毛染色淺，觀察效果差。染色時(shí)一定要充分洗凈A液后再加B液，否則背景不清晰。5供芽孢染色用的菌種應(yīng)控制菌齡，使大部分芽孢仍保留在菌體上為宜。 五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告(一)繪圖1單染色后觀察到的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的形態(tài)圖。2大腸桿菌革蘭氏染色視野圖。3金黃色葡萄球菌革蘭氏染色視野圖。4褐球固氮菌菌體及莢膜的形態(tài)。4繪出你所觀察到的細(xì)菌的形態(tài)及鞭毛著生情況。6枯草芽孢桿菌及巨大芽孢桿菌的菌體及芽孢形態(tài)，芽孢的著生位置。(二)單染色法操作要點(diǎn)。(三)記錄革蘭氏染色法法步驟，并進(jìn)行結(jié)果分析。 六、問題和思考1涂片在染色前為什么要先進(jìn)行固定?固定時(shí)應(yīng)注意什么

45、問題?2制備染色裝片時(shí)應(yīng)注意哪些事項(xiàng)，為什么?制片為什么要完全干燥后才能用油鏡觀察？3什么是革蘭氏染色法?染色過程應(yīng)注意什么?4試分析革蘭氏染色法在細(xì)菌分類中的意義。5組成莢膜的成分是什么?涂片一般用什么固定方法，為什么?6鞭毛染色的菌種為什么要先連續(xù)傳幾代，并且要采用幼齡菌種?7根據(jù)你的實(shí)驗(yàn)體會(huì)，哪些因素影響鞭毛染色的效果?如何控制?水中細(xì)菌總數(shù)往往同水體受有機(jī)物污染的程度呈正相關(guān)。因此，它是評(píng)價(jià)水質(zhì)污染程度的個(gè)重要指標(biāo)之一。由于重金屬及某些其它的有毒物質(zhì)對(duì)細(xì)菌有殺滅或抑制作用，在總細(xì)菌數(shù)少的水樣中并不能排除這些物質(zhì)的污染。實(shí)驗(yàn)六實(shí)驗(yàn)六 水中細(xì)菌總數(shù)的檢測(cè)水中細(xì)菌總數(shù)的檢測(cè) 本試驗(yàn)采用標(biāo)準(zhǔn)平

46、皿法對(duì)水樣中細(xì)菌作計(jì)數(shù)，這是測(cè)定水中好氧和兼性厭氧異養(yǎng)細(xì)菌密度的方法。由于細(xì)菌在水體個(gè)能以單獨(dú)個(gè)體、成對(duì)、鏈狀、成簇或成團(tuán)的形式存在，此外沒有單獨(dú)的一種培養(yǎng)基或其一環(huán)境條件能滿足個(gè)水樣中所有細(xì)菌的生理要求，所以由此法所得的菌落數(shù)實(shí)際上要低于被測(cè)水樣中真正存在的活細(xì)菌的數(shù)目。細(xì)菌總數(shù)是指1mL水樣在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，3724h培養(yǎng)后所生長(zhǎng)的菌落數(shù)。一般規(guī)定，1mL自來水的總菌數(shù)不得超過100個(gè)。 一、目的和內(nèi)容了解水中細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定方法。二、材料和器皿 ()下列固體培養(yǎng)基 1、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 22216E培養(yǎng)基 蛋白胨 50g 酵母膏 1.0g FePO4 0.01g 瓊脂 18.0g 蒸餾水

47、1000mL pH 7.67.8 (二)無菌采樣瓶，滅菌移液管，滅菌培養(yǎng)皿，盛有4.5mL滅菌蒸餾水的試管。 三、方法和步驟 (一)采集水樣，注意采集水樣的代表性和數(shù)量，詳見第2.9節(jié)。(二)吸取0.5mL水樣(河水、污水、游泳池水或港灣水等)，注入盛有4.5mL無菌水的試管中，混勻成10-1稀釋液，注意在吸水樣前，水樣及稀釋水應(yīng)徹底攪動(dòng)均勻。 (三)吸稀釋液0.5ml按10倍稀釋法稀釋成10-2、10-3、10-4等連續(xù)的稀釋度（圖411）。 (四)根據(jù)水樣的潔凈程度，污染嚴(yán)重者選取10-2、10-3、10-4三個(gè)連續(xù)稀釋度，中等的選取10-1、10-2、10-3三個(gè)連續(xù)稀釋度。稀釋度的選擇

48、是本試驗(yàn)精確度的關(guān)鍵，選擇適宜者，平皿上菌落總數(shù)介于30和300之間。(五)吸取由高倍至低倍的稀釋液，每個(gè)稀釋液分別注入兩個(gè)培養(yǎng)皿，每皿1mL。(六)注入徹底融化，然后冷卻到45的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（用于河水樣）或2216E培養(yǎng)基(用于海水、港灣水樣)約15mL，立即旋搖培養(yǎng)皿，充分混勻。方法是握住平皿，先往一個(gè)方向畫圓，再朝相反方向回轉(zhuǎn)；或一面畫圓，一面適當(dāng)傾斜。小心勿使這個(gè)混合液體濺到培養(yǎng)皿的邊緣。讓平皿培養(yǎng)基于水平位置放置至固化。 (七)接種河水樣的培養(yǎng)皿，倒置于37培養(yǎng)24h，接種海水樣、港灣水樣的培養(yǎng)皿，應(yīng)倒置后于1820下培養(yǎng)到長(zhǎng)出明顯菌落(5天左右)。 四、結(jié)果與分析 取同稀釋度的平

49、板培養(yǎng)物，依菌落計(jì)算原則進(jìn)行計(jì)算。 (一一)菌落計(jì)算原則菌落計(jì)算原則 平皿菌落的計(jì)算可用肉眼觀察，必要時(shí)用放大鏡檢查，平皿菌落的計(jì)算可用肉眼觀察，必要時(shí)用放大鏡檢查，防止遺漏，也可借助于菌落計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。對(duì)那些看來相似，防止遺漏，也可借助于菌落計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。對(duì)那些看來相似，并且長(zhǎng)得相當(dāng)接近，但并不相觸的菌落，只要它們之間的并且長(zhǎng)得相當(dāng)接近，但并不相觸的菌落，只要它們之間的距離至少相當(dāng)于最小菌落的直徑，便應(yīng)該距離至少相當(dāng)于最小菌落的直徑，便應(yīng)該一予以計(jì)數(shù)。一予以計(jì)數(shù)。對(duì)鏈狀菌落看來似乎是由于一團(tuán)細(xì)菌在瓊脂培養(yǎng)基和水對(duì)鏈狀菌落看來似乎是由于一團(tuán)細(xì)菌在瓊脂培養(yǎng)基和水樣的混合中被崩解所致，應(yīng)把這樣的一條鏈

50、當(dāng)做一個(gè)菌落樣的混合中被崩解所致，應(yīng)把這樣的一條鏈當(dāng)做一個(gè)菌落來計(jì)數(shù)，不可去數(shù)鏈上各個(gè)單來計(jì)數(shù)，不可去數(shù)鏈上各個(gè)單的菌鏈。若同的菌鏈。若同個(gè)稀釋度個(gè)稀釋度中一個(gè)平皿有較大片狀菌落生長(zhǎng)時(shí)，則不宜采用，而應(yīng)以中一個(gè)平皿有較大片狀菌落生長(zhǎng)時(shí)，則不宜采用，而應(yīng)以無片狀菌落生長(zhǎng)的平皿計(jì)數(shù)該稀釋度的平均菌落數(shù)。若片無片狀菌落生長(zhǎng)的平皿計(jì)數(shù)該稀釋度的平均菌落數(shù)。若片狀菌落少于平皿的一半時(shí)，而另狀菌落少于平皿的一半時(shí)，而另半中菌落分布又均勻，半中菌落分布又均勻，則可將其菌落數(shù)的則可將其菌落數(shù)的2倍作為全皿的數(shù)目。在記下各平皿菌倍作為全皿的數(shù)目。在記下各平皿菌落數(shù)后，應(yīng)算出同一稀釋度的平均菌數(shù)，供下落數(shù)后，應(yīng)算

51、出同一稀釋度的平均菌數(shù)，供下步計(jì)算時(shí)步計(jì)算時(shí)用。用。 (二)計(jì)算方法 l、首先選擇平均菌落效在30300者進(jìn)行計(jì)算，當(dāng)只有一個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)符合此范圍時(shí)，即可用它作為平均值乘其稀釋倍數(shù)。 2、若有兩個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)都在30300之間，則應(yīng)按兩者的比值來決定。若其比值小于2，應(yīng)報(bào)告兩者的平均數(shù)；若大于2，則報(bào)告其中較小的數(shù)字(見表4l例2和例3)。 3、如果所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300，則應(yīng)按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之(見表41例4)。 4、若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之(見表41例5)。 5、如果全部稀釋度的平均菌

52、落數(shù)均不在30300之間，則以最接近300或30的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之(見表4l例6)。 6、菌落計(jì)數(shù)的報(bào)告，菌落在100以內(nèi)時(shí)按實(shí)有數(shù)報(bào)告；大于100時(shí)，采用二位有效數(shù)字；在二位有效數(shù)字后面的數(shù)值，以四舍五入方法計(jì)算。為了縮短數(shù)字后面的零數(shù)也可用10的指數(shù)來表示，（見表41的“報(bào)告方式”欄）。在所需報(bào)告的菌落數(shù)多至無法計(jì)算時(shí)，應(yīng)注明水樣的稀釋倍數(shù)。 表41 稀釋度選擇及菌落報(bào)告方式例次不同稀釋度的平均菌落數(shù)兩個(gè)稀釋度菌落數(shù)之比菌落總數(shù)（個(gè)/mL）報(bào)告方式（個(gè)/mL）10-110-210-311360164201640016000或1.610422760295461.637750380

53、00或3.810432890271602.22710027000或2.71044無法計(jì)數(shù)4651513513000510000或5.1105527115270270或2.71026無法計(jì)數(shù)305123050031000或3.1104圖411 菌液逐級(jí)稀釋過程示意圖 五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告1、闡述細(xì)菌計(jì)數(shù)原則。2、報(bào)告樣品中細(xì)菌總數(shù)。六、問題與討論 微生物應(yīng)考慮哪些原則？ 培養(yǎng)時(shí)，為什么要把已接種的培養(yǎng)基倒置保溫培養(yǎng)？ 實(shí)驗(yàn)七實(shí)驗(yàn)七 水中大腸菌群水中大腸菌群(Coliform group)細(xì)菌的檢測(cè)細(xì)菌的檢測(cè) 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?了解大腸菌群的檢測(cè)方法。 二、材料與器皿 ()培養(yǎng)基 1、普通乳糖蛋白胨培養(yǎng)液蛋白

54、胨 10g牛肉膏 3g乳糖 5g氯化鈉 5g1.6溴甲酚紫乙醇液 1.0mL蒸餾水 1000mLpH 7.27.4 將蛋白胨、牛肉膏、乳糖、氯化鈉加熱溶解于1000mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH為7.27.4，再加入1.6溴甲酚紫乙醇液1.0mL，充分混勻，分裝于有杜漢氏小管的試管中，每管10mL，115滅菌20min。 2、三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液 按上述普通乳糖蛋白胨培養(yǎng)液濃縮三倍配制，分裝于有杜漢氏小管的試管中，每管5mL。 3、品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基（供平板分離用） 蛋白胨 10g 乳糖 10g K2HPO4 3.5g 瓊脂 1520g 蒸餾水 1000mL 無水亞硫酸鈉 5g左右 5的堿性品紅乙

55、醇溶液 20mL pH 7.27.44、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基（EMB培養(yǎng)基）（供發(fā)酵法平板分離用，3和4可任選一種）蛋白胨 10g乳糖 10gK2HPO4 2.0g瓊脂 20g蒸餾水 1000mL2伊紅（曙紅）水溶液 20mL5美藍(lán)（亞甲藍(lán)）水溶液 13mL pH 7.27.4(二)滅菌移液管、滅菌稀釋水、試管、杜漢氏小管、革蘭氏染色液、滅菌培養(yǎng)皿。三、方法與步驟(一)水樣的采集供細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)的水樣，必須按一般無菌操作的基本要求采集，并保證再運(yùn)送、貯存過程中不受污染。水樣從采集到檢驗(yàn)不應(yīng)超過4小時(shí)，在04下保存不應(yīng)超過24小時(shí)，如不能在4小時(shí)內(nèi)分析，應(yīng)在檢驗(yàn)報(bào)告上注明保存時(shí)間和條件。 （1）自來水取樣

56、：應(yīng)在水龍頭打開放水5分鐘，再用無菌容器接取水樣，待分析。如水樣內(nèi)含有余氯，則采樣瓶滅菌后按每500mL水樣加3Na2S2O3.5H2O溶液1mL。 江、河、湖、池自然水體取樣：可用采樣器，采樣瓶應(yīng)先滅菌。采樣后，瓶?jī)?nèi)應(yīng)留有空隙。如果與其他化驗(yàn)項(xiàng)目聯(lián)合取樣，細(xì)菌學(xué)分析水樣應(yīng)采在其他樣品之前。 （二）初發(fā)酵試驗(yàn)水樣稀釋：制備水樣10-1、10-2的稀釋液，方法為用無菌移液管吸取水樣10mL放于盛有90mL無菌水和若干玻璃珠的錐形瓶中，充分振蕩使混合均勻，并使其中的細(xì)菌盡量呈單個(gè)存在，即為10-1稀釋液；再從10-1制備10-2稀釋液。以此類推，稀釋到所需倍數(shù)。 （2）接種和培養(yǎng)：以無菌操作于5支

57、三倍濃縮培養(yǎng)基（接種前一定應(yīng)先檢查杜漢氏小管內(nèi)有無氣泡）中各加入水樣10mL，5支普通培養(yǎng)基試管中加入水樣1mL，5支普通培養(yǎng)基試管中加入10-1稀釋液1mL， 小心混勻放入37培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。此即5管法。 （3） 結(jié)果觀察：37中培養(yǎng)24h后取出觀察，觀察有無氣體（杜漢氏小管內(nèi)有無氣體）和酸產(chǎn)生（培養(yǎng)基有無變色）。在48h之間，培養(yǎng)管內(nèi)倒置的杜漢氏小管內(nèi)有任何量的氣體積累，或培養(yǎng)基顏色從紫色變?yōu)辄S色，便可初步斷定為陽性反應(yīng)。 若實(shí)驗(yàn)所測(cè)定的15支管中均為陽性反應(yīng)，說明濃水樣污染嚴(yán)重，可將樣品進(jìn)一步稀釋后，再按上述方法接種、培養(yǎng)和觀察。 (三)平板培養(yǎng)試驗(yàn) 將初發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)酸產(chǎn)氣的后只產(chǎn)

58、酸或只產(chǎn)氣的試管中的培養(yǎng)物用接種環(huán)取少許，劃線接種在品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基或伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基平板上，為了確保獲得分離的單菌落，須注意以下事項(xiàng)： （1）劃線間距至少相隔0.5厘米；（2）接種釘尖端要稍彎；（3）先對(duì)試管輕擊并使之傾斜，以免接種針挑取到任何膜狀物或浮渣；（4）劃線時(shí)要用針尖的彎曲部分接觸瓊脂培養(yǎng)基平面以免刮傷或戳破培養(yǎng)基。劃線后培養(yǎng)皿倒置，于37培養(yǎng)1824h。 24h后，觀察在平板上出現(xiàn)的單個(gè)菌落，其核心有深綠色金屬光澤者為較典型的大腸菌群菌落。盡可能挑取典型的或接近典型的大腸菌群菌落，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上劃線，置37培養(yǎng)24h。挑取斜面培養(yǎng)物制成涂片，進(jìn)行革蘭氏染色，凡屬革蘭氏陰性桿菌，

59、即確認(rèn)了大腸菌群細(xì)菌的存在 (四)復(fù)發(fā)酵驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 經(jīng)上述經(jīng)染色為革蘭氏陰性的典型菌落，用接種環(huán)刮取部分接種于盛有乳糖培養(yǎng)基的試管中，在37培養(yǎng)24h，陽性反應(yīng)者即確認(rèn)為大腸菌群細(xì)菌。 四、結(jié)果計(jì)算在初發(fā)酵試驗(yàn)中，可能有極少數(shù)能發(fā)酵乳糖產(chǎn)氣的非大腸菌群細(xì)菌混在陽性可疑反應(yīng)管中，通過對(duì)初發(fā)酵中的陽性可疑管進(jìn)行平板和復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)，并進(jìn)行革蘭氏染色和細(xì)菌形態(tài)的觀察，可將那些少量的非大腸菌群細(xì)菌(“假陽性管”)刪除去，故在記錄時(shí)只能把三步試驗(yàn)都呈陽性的試管計(jì)入陽性反應(yīng)管。如果初發(fā)酵接種水樣量為10mL、1mL、0.1mL，可直接查表42求出原水樣100mL中大腸菌群指數(shù)（MPN）。如果接種水樣量低于上述水

60、樣量，則經(jīng)下面的換算式計(jì)算。目前我國系以1L水樣中的菌數(shù)為報(bào)告值，即為MPN10。10mLMPNMPN（）指數(shù)接種量最大的一管的水樣量（mL）目前我國系以1L水樣中的菌數(shù)為報(bào)告值，即為MPN10。 表42水樣的總大腸菌群檢索表出現(xiàn)陽性反應(yīng)的試管數(shù)每100ml中的細(xì)菌的MPN出現(xiàn)陽性反應(yīng)的試管數(shù)每100ml中的細(xì)菌的MPN10ml管中1ml管中0.1ml管中10ml管中1ml管中0.1ml管中0000000000000123450245790000002222220123454679111300000011111101234524679110000003333330123456791113150