分子生物學(xué)基本技術(shù) —PCR (Polymerase Chain Reaction)

1、分子生物學(xué)基本技術(shù)分子生物學(xué)基本技術(shù) PCR (Polymerase Chain Reaction)PCR(Polymerase Chain Reaction)n一、歷史及其發(fā)展一、歷史及其發(fā)展n二、二、PCR的基本原理的基本原理n三、三、Primer design引物常規(guī)設(shè)計(jì)原則引物常規(guī)設(shè)計(jì)原則n四、四、PCR反應(yīng)體系反應(yīng)體系n五、五、PCR反應(yīng)條件優(yōu)化（反應(yīng)條件優(yōu)化（ PCR optimization)n六、六、PCR反應(yīng)特點(diǎn)反應(yīng)特點(diǎn)n七、七、PCR產(chǎn)物的分析產(chǎn)物的分析n八、八、Molecular markern九、九、PCR技術(shù)的應(yīng)用技術(shù)的應(yīng)用 分子生物學(xué)技術(shù)體系分子生物學(xué)技術(shù)體系n 基

2、本技術(shù)基本技術(shù)n基因及產(chǎn)物基因及產(chǎn)物 分子檢測(cè)技術(shù)分子檢測(cè)技術(shù)n基因及產(chǎn)物基因及產(chǎn)物 獲取技術(shù)獲取技術(shù)n基因基因 功能研究技術(shù)功能研究技術(shù) 基本技術(shù)基本技術(shù) 1. 瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳 2. SDS-PAGE 電泳電泳 3. PCR技術(shù)技術(shù) 4. 細(xì)菌轉(zhuǎn)化細(xì)菌轉(zhuǎn)化聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-PCR(Polymerase Chain Reaction)一、歷史及其發(fā)展：一、歷史及其發(fā)展：n1971年，Khorana提出：經(jīng)過DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆tRNA基因。n但由于測(cè)序和引物合成的困難，以及70年代基因工程技術(shù)的發(fā)明使克隆基因成為

3、可能，所以，Khorana的設(shè)想被人們遺忘了n1985年，美國PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）n基本原理是在試管中模擬細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制n最初采用E-coli DNA聚合酶進(jìn)行PCR，由于該酶不耐熱，使這一過程耗時(shí)，費(fèi)力，且易出錯(cuò)n耐熱DNA聚合酶的應(yīng)用使得PCR能高效率的進(jìn)行，隨后PE-Cetus公司推出了第一臺(tái)PCR自動(dòng)化熱循環(huán)儀1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶進(jìn)行PCR，其擴(kuò)增的DNA片段很均一，真實(shí)性也較高，只有所期望的一種DNA片段。但每循環(huán)一次，仍需加入新酶。n1988年Saiki 等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌(thermu

4、s aquaticus) 中提取到一種耐熱DNA聚合酶。n1993年：年：Mullis與開創(chuàng)了與開創(chuàng)了“寡核苷酸基因定點(diǎn)誘寡核苷酸基因定點(diǎn)誘變變”加拿大籍英國科學(xué)家加拿大籍英國科學(xué)家Michael Smith共獲諾共獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)貝爾化學(xué)獎(jiǎng) Kary Mullis & Michael Smith 穆利斯（穆利斯（Kary Mullis）美國化學(xué)家1944史密斯（史密斯（Michael Smith）加拿大化學(xué)家1932 二、PCR的基本原理PCR的基本原理：的基本原理：變性、復(fù)性、半保留復(fù)制變性、復(fù)性、半保留復(fù)制 PCR三步曲三步曲 Three steps： Denaturation 變

5、性變性 9097 Primer annealing 退火退火 4555 Polymerization 延伸延伸 72原原 理理 5 3 3 5 類似于類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制。首先的體內(nèi)復(fù)制。首先待擴(kuò)增待擴(kuò)增DNA 模板加熱模板加熱變性變性解鏈，解鏈，隨之將反應(yīng)混合物冷卻至某一溫度，隨之將反應(yīng)混合物冷卻至某一溫度，這一溫度可使引物與它的靶序列發(fā)這一溫度可使引物與它的靶序列發(fā)生生退火退火，再將溫度升高使退火引物，再將溫度升高使退火引物在在DNA聚合酶作用下得以聚合酶作用下得以延伸延伸。 這種熱變性這種熱變性-復(fù)性復(fù)性-延伸的過程就是一延伸的過程就是一個(gè)個(gè)PCR循環(huán)，循環(huán)，PCR就是在合適條件就是在

6、合適條件下的這種循環(huán)的不斷重復(fù)。下的這種循環(huán)的不斷重復(fù)?；貞洠夯貞洠篋NA 的復(fù)制的復(fù)制DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35解旋酶解鏈酶回憶：回憶：DNA 的復(fù)制的復(fù)制RNA引物RNA引物ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35引物酶引物酶DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長回憶：回憶：DNA 的復(fù)制的復(fù)制ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG

7、35DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長TAGCGCTATCGCATCGACGCT3ATAGCGTAGCTGCGACCTAGC3DNA聚合酶DNA聚合酶回憶：回憶：DNA 的復(fù)制的復(fù)制變性延伸退火90 9540 6070 75PCR簡(jiǎn)要過程圖解簡(jiǎn)要過程圖解PCR詳細(xì)過程圖解詳細(xì)過程圖解1234522557294時(shí)間（min）溫度（）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)13步2530輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍模板DNA95150引物1引物2DNA引物2引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶3第1輪結(jié)束95第2輪開始472

8、TaqTaqTaqTaq5PCR的基本原理nPCR反應(yīng)條件nPCR過程nPCR的特點(diǎn)模板DNA第1輪擴(kuò)增第2輪擴(kuò)增第3輪擴(kuò)增第4輪擴(kuò)增第5輪擴(kuò)增第6輪擴(kuò)增三、三、Primer design引物常規(guī)設(shè)計(jì)原則引物常規(guī)設(shè)計(jì)原則1. 長度：長度：15-37 nt, 一般一般20nt左右左右; (僅僅binding , 不含接頭不含接頭)2. G + C 含量含量4060，而且四種堿基的分布最好隨機(jī)。，而且四種堿基的分布最好隨機(jī)。3. 避免聚嘌呤或聚嘧啶或有回文對(duì)稱結(jié)構(gòu)；避免聚嘌呤或聚嘧啶或有回文對(duì)稱結(jié)構(gòu)；4. 引物自身不能互補(bǔ)（引物自身不能互補(bǔ)（3個(gè)）個(gè)）5. 引物之間不能互補(bǔ)（引物之間不能互補(bǔ)（5

9、個(gè)）個(gè)）6. 引物端不能錯(cuò)配引物端不能錯(cuò)配, 不能修飾，盡量不用不能修飾，盡量不用T, 不能超過個(gè)連續(xù)的不能超過個(gè)連續(xù)的G或或C；7. 端可變化修飾，附加酶切位點(diǎn)；端可變化修飾，附加酶切位點(diǎn)；8. 兩引物的兩引物的Tm值應(yīng)比較接近；值應(yīng)比較接近；9. 正鏈引物：正鏈引物：mRNA序列照抄；序列照抄； 負(fù)鏈引物：先寫出負(fù)鏈引物：先寫出mRNA序列的互補(bǔ)序列，然后翻轉(zhuǎn)重寫。序列的互補(bǔ)序列，然后翻轉(zhuǎn)重寫。10解鏈溫度解鏈溫度 Tm = 4 (G+C) +2 (A+T) = 20nt Tm一般一般最佳最佳 PCR反應(yīng)中結(jié)合溫度（反應(yīng)中結(jié)合溫度（anneaning temperature）T = Tm

10、- 5vP+、P-的設(shè)計(jì)方法的設(shè)計(jì)方法四、四、PCRPCR反應(yīng)體系反應(yīng)體系標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)的PCRPCR反應(yīng)體系：反應(yīng)體系：10擴(kuò)增緩沖液 10ul4種dNTP混合物 各200umol/L引物 各10100pmol模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶 2.5uMg2+ 1.5mmol/L加雙或三蒸水至 100ulnTemplate（模板）：（模板）：ssDNA, dsDNA mRNA needed to be RT as cDNA模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。nPrimes（引物）：（引物）：每條引物的濃度0.11umol或10100pmol，以最低引物量產(chǎn)生所需

11、要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，增加二聚體的機(jī)會(huì)。純化引物在25乙腈溶液中4；凍干引物于-20可保存1-2年，液體狀態(tài)于-20可保存6個(gè)月。不用時(shí)應(yīng)-20保存。ndNTPs：dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系，多次凍融會(huì)使dNTP降解。在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等( 等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí)(偏高或偏低)，就會(huì)引起錯(cuò)配。濃度過低又會(huì)降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低。nMg2+ ： for Taq polymerase activity Mg2

12、+對(duì)PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200umol/L時(shí)，Mg2+濃度為1.52.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過低會(huì)降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。nBuffer： 10-50mmol/L Tris-HCl(pH8.3-8.8, 20)。nTaq DNA polymerase（ Taq DNA 聚合酶）：聚合酶）：濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。分離分離: 1969年，美國黃石國家公園溫泉分子量分子量: 94KDa活性：活性：在幾種水生棲熱菌中活性最高，200 00

13、0U/mg離子需要：離子需要：對(duì)Mg2+、單價(jià)離子性質(zhì)和濃度較敏感。最適濃度50mmol/L。忠實(shí)性忠實(shí)性: 沒有校正單核苷酸錯(cuò)配功能-致命弱點(diǎn)。一般出錯(cuò)率為210-4核苷酸/每輪循環(huán)，利用PCR克隆、測(cè)序時(shí)尤應(yīng)注意。40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40 20五、五、PCRPCR反應(yīng)條件優(yōu)化（反應(yīng)條件優(yōu)化（ PCR optimizationPCR optimization) )1、變性溫度和時(shí)間、變性溫度和時(shí)間n一般情況下，9295 l-5min足以使模板DNA變性，若低于93則需延長時(shí)間，但溫度不能過高，因?yàn)楦邷丨h(huán)境對(duì)酶的活性有影響。富含G和C的序列，可適當(dāng)提高

14、，但過高或時(shí)間過長都會(huì)導(dǎo)致酶活性損失。2、退火、退火(復(fù)性復(fù)性)溫度與時(shí)間溫度與時(shí)間n引物中G、C含量高、 長度長并與模板完全配對(duì)時(shí)，應(yīng)提高溫度。溫度越高，產(chǎn)物特異性越高。通常37-55、1-2分鐘。變性后溫度快速冷卻至4060，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DNA 比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機(jī)會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞。退火溫度與時(shí)間，取決于引物的長度引物的長度、堿基組堿基組成及其濃度濃度，還有靶基序列的長度靶基序列的長度。引物的復(fù)性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)2(A+T)復(fù)性溫度=Tm值值-(510)3、延伸溫度和時(shí)間、延伸溫度

15、和時(shí)間溫度溫度：72，接近Taq酶的最適75，高于90時(shí)， DNA合成幾乎不能進(jìn)行Taq DNA聚合酶的生物學(xué)活性聚合酶的生物學(xué)活性：7080 150核苷酸/S/酶分子70 60核苷酸/S/酶分子55 24核苷酸/S/酶分子時(shí)間時(shí)間：過長會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物非特異性增加。但對(duì)低濃度的目的序列，則可適當(dāng)增加時(shí)間。一般： 1Kb以內(nèi)的DNA片段，延伸時(shí)間1min是足夠 的 34kb的靶序列需34min 10Kb需延伸至15min。 延伸進(jìn)間過長會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。對(duì)低濃度模板的擴(kuò)增，延伸延伸進(jìn)間過長會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。對(duì)低濃度模板的擴(kuò)增，延伸時(shí)間要稍長些。時(shí)間要稍長些。4、循環(huán)次數(shù)、循環(huán)次數(shù)

16、 PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。一般的循環(huán)次數(shù)選在3040次之間，循環(huán)過多，非特異性產(chǎn)物大量增加，循環(huán)次數(shù)決定PCR擴(kuò)增程度。六、六、PCRPCR反應(yīng)特點(diǎn)反應(yīng)特點(diǎn)n1.1.特異性強(qiáng)：特異性強(qiáng)： 引物與模板DNA特異正確的結(jié)合；堿基配對(duì)原則；Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性；靶基因的特異性與保守性。n2.2.靈敏度高：靈敏度高：PCR產(chǎn)物的生成量以指數(shù)方式增加n3.3.簡(jiǎn)便、快速：簡(jiǎn)便、快速：PCR反應(yīng)一般在24 小時(shí)完成擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。n4.4.對(duì)標(biāo)本的純度要求低：對(duì)標(biāo)本的純度要求低： DNA 粗制品及總RNA均可作為擴(kuò)

17、增模板?？芍苯佑门R床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等粗制的DNA擴(kuò)增檢測(cè)。七、PCR產(chǎn)物的分析 1、凝膠電泳分析、凝膠電泳分析 通常應(yīng)用12%的瓊脂糖凝膠，供檢測(cè)用。聚丙烯酰胺凝膠電泳：610%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離效果比瓊脂糖好，條帶比較集中。 2、PCR產(chǎn)物電泳產(chǎn)物電泳 EB溴乙錠染色紫外儀下觀察，初步判斷產(chǎn)物的特異性。目前可用SYBR的新型熒光熒光染料染料來替代EB，從而減少了對(duì)環(huán)境的污染，并可有效保護(hù)實(shí)驗(yàn)操作者。 3、酶切分析、酶切分析 根據(jù)PCR產(chǎn)物中限制性內(nèi)切酶的位點(diǎn)，用相應(yīng)的酶切、電泳分離后，獲得符合理論的片段，此法既能進(jìn)行產(chǎn)物的鑒定，又能對(duì)靶基因分型，還能進(jìn)行變

18、異性研究。 4、分子雜交、分子雜交 分子雜交是檢測(cè)PCR產(chǎn)物特異性的有力證據(jù)，也是檢測(cè)PCR 產(chǎn)物堿基突變的有效方法。 在兩引物之間另合成一條寡核苷酸鏈(內(nèi)部寡核苷酸)標(biāo)記后做探針，與PCR產(chǎn)物雜交。此法既可作特異性鑒定，又可以提高檢測(cè)PCR產(chǎn)物的靈敏度，還可知其分子量及條帶形狀。 5、核酸序列分析、核酸序列分析 是檢測(cè)PCR產(chǎn)物特異性的最可靠方法。 八、八、Molecular marker1、傳統(tǒng)水平、傳統(tǒng)水平：形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、生化標(biāo)記2、分子水平：、分子水平： 第一類第一類：電泳、分子雜交為核心 代表代表：RFLP 第二類第二類：電泳、PCR為核心 代表代表：RAPD、SSR、AFLP 第三類：第三類：DNA序列為核心 代表：代表：?jiǎn)螇A基多態(tài)性（SNP），DNA序列的單個(gè)核苷酸的差別3、應(yīng)用、應(yīng)用n種質(zhì)資源研究n品質(zhì)純度鑒定（包括DNA指紋鑒定）n構(gòu)建遺傳連鎖圖n基因定位（QTL）n標(biāo)記輔助選擇n比較基因組研究n基因克?。▓D位克?。﹏生物起源、進(jìn)化、醫(yī)學(xué)及法醫(yī)學(xué)（一）（一） RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)n物種的基因組DNA在限制性內(nèi)切酶作用下，產(chǎn)生相當(dāng)多的