反義核酸技術(shù)及其在寄生蟲學(xué)中的應(yīng)用進展

1、反義核酸技術(shù)及其在寄生蟲學(xué)中的應(yīng)用進展 反義核酸是指能與特定mRNA精確互補、特異阻斷其翻譯的RNA或DNA分子。利用反義核酸特異地封閉某些基因表達，使之低表達或不表達，這種技術(shù)即為反義核酸技術(shù)1-3。它包括反義RNA、反義DNA和核酶(ribozymes)三大技術(shù)。反義核酶作為一種基因下向調(diào)節(jié)作用因子，在抑制一些有害基因的表達和失控基因的過度表達上發(fā)揮著重要作用。隨著反義核酶技術(shù)的發(fā)展和成熟，已逐漸應(yīng)用于抗某些人體寄生蟲病的研究。本文擬就反義核酸技術(shù)的作用原理和特點作一簡要概述，著重闡述其在寄生蟲領(lǐng)域中的應(yīng)用進展。1反義核酸的作用原理反義核酸目前有三種來源：一是利用固相亞磷酰胺法人工合成的短

2、小反義寡聚核苷酸(antisense oligodeoxyncleotides，AON)，這是反義核酸最普遍的應(yīng)用方式，包括未修飾AON和硫代磷酸酯化(PS)、磷酸二酯化(PO)和甲基化等修飾AON二類，其中以PSAON應(yīng)用最廣泛。ANO設(shè)計合成簡單，只要其順序與靶mRNA部分順序互補即可，而對基因的讀碼框無要求；二是更具有實用價值的工人表達載體，包括單個基因和多個基因的聯(lián)合反義表達載體3，它是利用基因重組技術(shù)將靶基因序列反向持插入到載體的啟動子和終止子之間，通過轉(zhuǎn)錄可源源不斷產(chǎn)生反義RNA分子；三是天然存在的反義核酸分子，但目前分離純化尚存在困難。1.1反義RNA和反義DNA反義RNA是指能

3、和mRNA完全互補的一段小分子RNA或寡聚核苷酸片段，反義DNA是指能與基因DNA雙鏈中的有義鏈互補結(jié)合的短小DNA分子。反義RNA和反義DNA主要是通過mRNA的翻譯和基因DNA的轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮作用10：1)抑制翻譯。反義核酸一方面通過與靶mRNA結(jié)合形成空間位阻效應(yīng)，阻止核糖體與mRNA結(jié)合，另一方面其與mRNA結(jié)合后激活內(nèi)源性RNase或ribozyme，降解mRNA3；2)抑制轉(zhuǎn)錄。反義DNA與基因DNA雙螺旋的調(diào)控區(qū)特異結(jié)合形成DNA三聚體(triplex),或與DNA編碼區(qū)結(jié)合，終止正在轉(zhuǎn)錄的mRNA鏈延長3。此外，反義核酸還可抑制轉(zhuǎn)錄后mRNA的加工修飾，如5'端加帽、3&#

4、39;端加尾(poly a)、中間剪接和內(nèi)部堿基甲基化等，并阻止成熟mRNA由細胞核向細胞漿內(nèi)運輸。1.2核酶Cech等發(fā)現(xiàn)四膜蟲核糖體RNA前體在成熟過程中，可精確地自我切除某些片段并重新連接，這種具有酶催化活性的RNA稱之為核酶11,12。核酶廣泛存在于生物細胞中，有錘頭狀和發(fā)夾二種結(jié)構(gòu)。酶活性中心由兩個臂和中間的功能區(qū)組成13。兩個臂序列高度保守，與靶RNA特異互補結(jié)合，相當(dāng)于一種反義RNA，而功能區(qū)則可通過降解RNA的磷酸二酯鍵而分解消化靶RNA，而核酶本身在作用過程中并不消耗。核酶裂解分子依賴嚴格的空間結(jié)構(gòu)形成，裂解部位總是位于靶RNA分子中GUX三聯(lián)體(X：C、U、A)下游方向即3

5、'端12。核酶除天然存在外，也可人工合成。根據(jù)核酶的作用位點、靶mRNA周圍的序列和核酶本身高度保守序列，可方便地人工設(shè)計合成核酶的特異性序列。此外，利用基因工程將核酶的編碼基因克隆在SP6或T7等啟動子下游，通過轉(zhuǎn)錄合所需核酶。核酶能特異切割RNAA分子，使阻斷基因表達，特別是阻斷有害基因的表達成為可能。如果已知靶mRNA中GUX三聯(lián)體的位置，可將核酶的編碼基因插入反義表達載體的適當(dāng)位置，這樣轉(zhuǎn)錄所產(chǎn)生的含有核酶的反義RNA具有雙重功能：一方面具有反義抑制作用，另一方面具有切割靶mRNA的催化作用。核酶在抗腫瘤、抗病毒方面具有十分誘人的前景，第一個應(yīng)用核酶進行艾滋病基因治療的臨床計劃

6、已獲準(zhǔn)，核酶作為一種遺傳信息藥物，在腫瘤基因治療中必將日益受到重視。2反義核酸的作用特點反義核酸作為基因治療藥物之一，與傳統(tǒng)藥物相比具有諸多優(yōu)點。1)高度特異性：反義核酸藥物通過特異的堿基互補配對作用于靶RNA或DNA，猶如“生物導(dǎo)彈”。2)高生物活性、豐富的信息量；反義核酸是一種攜帶特定遺傳信息的信息體，堿基排列順序可千變?nèi)f化，不可窮盡。3)高效性：直接阻止疾病基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。4)最優(yōu)化的藥物設(shè)計：反義核酸技術(shù)從本質(zhì)上是應(yīng)用基因的天然順序信息，實際上是最合理的藥物設(shè)計。5)低毒、安全：反義核酸尚未發(fā)現(xiàn)其有顯著毒性，盡管其在生物體內(nèi)的存留時間有長有短，但最終都將被降解消除，這避免了如轉(zhuǎn)基因療

7、法中外源基因整合到宿主染色體上的危險性。3反義核酸技術(shù)在寄生蟲學(xué)中的應(yīng)用反義核酸技術(shù)的飛速發(fā)展和成熟，使其逐漸滲透并應(yīng)用到寄生蟲學(xué)領(lǐng)域，豐富和發(fā)展了寄生蟲病的基因治療策略。反義核酸技術(shù)在抗寄生蟲病研究的應(yīng)用主要集中于原蟲類，如瘧原蟲、錐蟲和利什曼原蟲等，而且反義核酸中又以AON方面的報道最多。下面著重就AON在寄生蟲方面的研究應(yīng)用作用一簡要闡述。3.1瘧原蟲 瘧原蟲嘌呤核苷酸合成具有特殊性，即無從頭合成途徑，依靠補救合成途徑利用體內(nèi)游離的嘌呤或嘌呤核苷。瘧原蟲的二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase，DHFR)和胸苷酸合酶(thymidylate synthase，TS

8、)結(jié)合形成雙功能蛋白(DHFR-TS)，這對于維持瘧原蟲四氫葉酸水平和DNA合成極為重要14，此酶也是瘧原蟲脫氧胸苷酸生物合成唯一通路中必不可少的酶?？汞懰幹械目谷~酸代謝藥如乙胺嘧啶，就是通過競爭性抑制DHFR-TS來阻斷蟲體脫氧胸苷酸生物合成15。然而，隨著惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)多藥抗性株的出現(xiàn)和廣為傳播，瘧疾的化療面臨重大挑戰(zhàn)，促使人們尋求新的抗瘧療法。目前，DHFR-TS是AON抗瘧作用首選靶基因。生物大分子進入感染紅細胞中的瘧原蟲，必需穿透三層膜，即紅細胞膜、納蟲泡膜和蟲體的胞質(zhì)膜。研究表明，不能穿透紅細胞膜和納蟲泡膜的大分子和葡聚糖、IgG2a抗體和

9、蛋白A等，可經(jīng)過納蟲微管(parasitophorous duct)進入蟲體，蟲體通過胞吞作用直接從細胞外攝入大分子物質(zhì)16。因此，對于小分子的AON而言，作用于感染紅細胞中的蟲體完全成為可能，下述眾多研究已充分證明了這一點。Rapaport等(1992)研究發(fā)現(xiàn)17，以DHFR-TS為靶21 nt PS AON能選擇性地進入惡性瘧原蟲感染紅細胞，對體外培養(yǎng)的氯喹敏感株和耐藥株蟲體具有同等的抑制效果，而未感染瘧原蟲的紅細胞則完全為不攝入AON，因此這對應(yīng)用反義核酸于抗瘧治療非常有利。諸多研究表明，AON越長，對轉(zhuǎn)譯的抑制作用就越強；AON濃度越高，非特異性抑制作用越明顯，在低濃度時則呈特異性抑

10、制。Sartorius和Franklin(1991)以DHFR-TS的mRNA為靶合成系列AON，利用兔網(wǎng)織紅細胞翻譯系統(tǒng)，探討AON對體外轉(zhuǎn)譯的抑制作用18。在DHFR翻譯起始位點處合成了6條2149nt不等長的AON，在TS編碼區(qū)全成的30nt、39nt和49nt三條AON。當(dāng)AON長度為30nt或更長時，呈明顯轉(zhuǎn)譯抑制作用，抑制率可高達50以上。其中，TS編碼區(qū)的49nt aON(OTS49)抑制效果最高，當(dāng)濃度在45mlo/L時的抑制率幾乎達90，主要是因為OTS49與DHFR-TS靶mRNA結(jié)合抑制TS合成，這從翻譯產(chǎn)物的分子量(55 kDa)要比天然DHFR-TS(71 kDa)小

11、且無TS活性可看出。Ramasamy等和Clark等研究表明，在較高濃度下，無論DHFR-TS正義還是反義的寡聚核苷酸(M1K，M2K)，均能抑制裂殖子入侵紅細胞19,20。究其原因，可能與高濃度的AON帶有較多的負電荷有關(guān)。Kanagaratnam等(1998)分析了瘧原蟲裂殖子表面蛋白基因的反義和正義寡聚核苷酸對瘧原蟲體外生長的影響21，無論AON單獨使用抑或與脂質(zhì)體混合使用，均未觀察到特異抑制效應(yīng)。但在相同濃度范圍內(nèi)，反義和正義寡核苷酸以及具有多聚陰離子的硫酸葡聚糖，均可抑制裂殖子入侵紅細胞。當(dāng)寡聚核苷與陽離子脂質(zhì)體結(jié)合后負電荷被中和時，則對裂殖子入侵紅細胞的抑制作用被取消。由此推測，寡

12、聚核苷酸有可能借助其多聚陰離子特性干擾裂殖子與細胞上受體結(jié)合，多聚陰離子可能對瘧疾病治療有幫助。3.1.2AON不同修飾物對抗瘧作用影響最近，Barker等以DHFR-TS基因為靶，比較了硫代磷酸酯化(PS)、磷酸二酯化(PO)和甲基化修飾AON，以及不同空間結(jié)構(gòu)AON對體外培養(yǎng)蟲體生長抑制作用22。結(jié)果顯示，5'和3'端至少含有3個PS基因的PO-PS雜合體AON、全部為PS修飾的AON，與部分PS修飾的AON抑制作用相同。在低濃度下(1mol/L)，PO-PS aON和PS AON比PS-甲基化AON抑制率高25。此外，通過延長AON序列增加干-環(huán)結(jié)構(gòu)形成，提高AON的自我

13、穩(wěn)定性，結(jié)果獲得2個有干-環(huán)結(jié)構(gòu)的AON(RB39、RB41)，其抑蟲生長率比序列未延長的AON約要高20。3.1.3AON不同靶基因?qū)汞懽饔糜绊慉ON對不同基因的抑制作用不一致，這和該基因在蟲體代謝過程中是否起舉足輕重作用密切相關(guān)14。AON的抗瘧研究主要集中在DHFR-TS基因，這固然與其在瘧原蟲核苷酸代謝中的特殊地位有關(guān)(見前述)。Barker等(1996)對惡性瘧原蟲耐藥株多個靶基因的AON作用進行了比較研究23，方法是將PS aON加入到瘧原蟲體外培養(yǎng)液中，培養(yǎng)48小時后，通過鏡檢和3氚-次黃嘌呤摻入試驗觀察AON對蟲體的生長抑制作用。結(jié)果表明，抑制作用與AON濃度密切相關(guān)。當(dāng)AO

14、N濃度為1mol/L時，AON呈非特異性抑制；當(dāng)濃度在0.50.005mol/L范圍時，以DHFR-TS、二氫喋呤合成酶、核苷酸還原酶、裂殖體多基因家族和紅細胞結(jié)合抗原-175為靶的PS aON與對照組相比，均能特異地顯著抑制蟲體生長(P0.0001)，而DNA聚合酶的PS aON抑制作用更弱，磷酸丙糖異構(gòu)酶的PS AON抑制作用則與對照組相同。瘧原蟲感染紅細胞中，近75血紅蛋白被滋養(yǎng)體降解而形成大量對蟲體有害的血紅素，必須在消化泡中聚集成對蟲體無毒的瘧色素24,25。研究表明，惡性瘧原蟲組氨酸富集蛋白(HRP)家族中，HRP和HRP有明顯的促進瘧色素形成功能26。因此，如能特異阻斷這些基因表

15、達，抑制瘧色素的形成，有可能使之成為一種抗瘧新途徑。HRP與HRP從同一祖先基因分化而來，二者高度同源，翻譯起始位點附核苷酸序列則完全相同27,28。3.2錐蟲屬于動基體目的布氏錐蟲(Trypanosoma burcei)通過抗原不斷變異逃避宿主的免疫力，抗原變異是由于不同的變異體專一表面糖蛋白(variant-specific surface glycoprotein，VSG)基因呈間斷表達所致，VSG基因表達產(chǎn)物在錐蟲表面形成外膜，覆蓋蟲體29,30。研究表明，VSG mRNA可分為二部分31,32：一部分是各種變異體特有的主外顯子序列，占主要部分；另一部分是共同的5'端小外顯子序

16、列，通常為35個核苷酸長，幾乎所有的VSG mRNA均含有此序列。實際上，除VSG外，錐蟲的鈣調(diào)蛋白、微管蛋白和磷酸丙糖異構(gòu)酶mRNA中也存在共同的5'端小外顯子序列，這似乎是動基體目寄生原蟲編碼基因的共同結(jié)構(gòu)特征32。由于宿主mRNA無這種小外顯子序列，以小外顯子序列為靶的AON就很容易實現(xiàn)抑制眾多基因表達的效果，使反義核酸抗錐蟲感染成為可能。Cornelissen等應(yīng)用麥胚提取物轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)、35S-甲硫氨酸摻入試驗和蛋白質(zhì)SDS-PAGE方法33，對與錐蟲小外顯子序列不同位點互補和不同長度的AON體外轉(zhuǎn)譯抑制作用進行了比較分析。結(jié)果所有AON均能抑制轉(zhuǎn)錄，且抑制程度與AON長度和濃度

17、有關(guān)，AON越長，濃度越高則抑制作用越強。如3個12nt和AON抑制率達3560，而22nt和34nt aON在濃度為1530mol/L時對錐蟲總RNA轉(zhuǎn)錄抑制率高達95100。在同一轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)中，BMV病毒(Brome mosaic Virus)和無小外顯子序列的錐蟲磷酸甘油酸激酶mRNA卻完全不受34 nt AON的抑制，與錐蟲小外顯子序列不互補的18 nt AON對錐蟲轉(zhuǎn)譯則無任何影響。上述發(fā)現(xiàn)充分證明，以錐蟲5'端小外顯子mRNA序列為靶的AON對轉(zhuǎn)譯具有特異抑制作用。Walder等用兔網(wǎng)織紅細胞轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)，也獲得上述相類似的結(jié)果31。Verspieren等研究表明34，小外顯子A

18、ON的二級結(jié)構(gòu)和堿基的修飾會直接影響其與靶mRNA的親和性，從而間接影響AON的轉(zhuǎn)譯抑制效果。如上述與小外顯子第2位至第13位堿基互補的12nt aON，雖然抑制布氏錐蟲轉(zhuǎn)譯，但不能抑制活動錐蟲(Trypanosoma vivax)mRNA轉(zhuǎn)譯，這顯然與二種蟲體的小外顯子第3位和第7位堿基不同有關(guān)。Verspieren等首次嘗試用吖啶衍生物(acridine derivative)修飾布氏錐蟲5'端小外顯子序列的AON，觀察其對培養(yǎng)蟲體的殺傷作用35。結(jié)果表明，連接有吖啶分子的9nt aON與相同長度但未連接吖啶分子的AON相比，能更為有效地抑制錐蟲蛋白質(zhì)的體外合成，且能有效地殺死體外

19、培養(yǎng)蟲體。無論如何，未連接吖啶的9nt aON和雖連接吖啶但不與錐蟲5'端小外顯子序列互補的9nt AON，均不能殺死培養(yǎng)蟲體。AON經(jīng)吖啶修飾后能提高其殺錐蟲作用，推測可能與下述因素有關(guān)：一是通過吖啶修飾增加AON與靶mRNA間的親和力，二是提高對3'端核酸外切酶的抗性，延長其作用半衰期，三是促進AON對活細胞膜的穿透。因此，對AON進行吖啶修飾提高其作用效率值得研究借鑒。3.3 利什曼原蟲利什曼原蟲(Leishmania)屬動基體目寄生原蟲，其所有mRNA的5´端也均含有一共同的由35個核苷酸組成的小外顯子(5'-AC-CGCUAUAUAAGUA

20、UCAGUUUCUGUACUUUAUUG-3')，這為AON提供了極好的作用靶位37。Ramazeilles等研究表明38，以小外顯子為靶的16 nt PS AON(5'-CTGAT-GCTTATATAGC-3')能選擇性地殺死培養(yǎng)鼠巨噬細胞中無鞭毛體，而對宿主巨噬細胞無損害。當(dāng)16nt pS AON濃度為10mol/L時，約30感染巨噬細胞在培養(yǎng)后24小時好轉(zhuǎn)。為進一步提高細胞對AON的攝入，將16nt pS AON與軟脂酸連接，并與人的低密度脂蛋白(LDL)混合，用于體外感染巨噬細胞測試。結(jié)果表明，當(dāng)濃度約為10mol/L時，與LDL結(jié)合的16nt pS AON使4

21、1±5細胞治愈，而未結(jié)合LDL的16 nt PS AON只有25±4細胞治愈，推測LDL可能有利于細胞對AON的內(nèi)吞作用。與上述結(jié)果相似，Chaudhuri等報道以5'端小外顯子序列為靶的17nt pS AON(5'-CTGATACTTATATAGCG-3')同樣能選擇性地高效殺死培養(yǎng)鼠感染巨噬細胞中的無鞭毛體，須對巨噬細胞無任何損傷38。為促進宿主細胞對17nt pS AON的攝取，Chaudhuri很巧妙地利用受體介導(dǎo)技術(shù)將AON特異呈遞到靶作用位點。由于哺乳動物巨噬細胞豐富的凈化受體(scavenger receptor)39,40，這些受體能

22、特異結(jié)合并降解經(jīng)修飾的LDL，且與牛血清白蛋白(MBSA)人工配體有很高的親和力，災(zāi)樣為AON特異作用于巨噬細胞創(chuàng)造了條件41。首先是用MBSA覆蓋已包裹17nt pS AON的脂質(zhì)體，后者通過MBSA配體與巨噬細胞上凈化受體特異結(jié)合，攝入巨噬細胞內(nèi)后，隨著脂質(zhì)體的降解，AON即被釋放出來。利用這種受體介導(dǎo)呈遞技術(shù)，大大提高了AON作用效果。在17nt pS AON濃度為10mol/L時，有MBSA和脂體包裹的AON能在5小時內(nèi)殺死90以上培養(yǎng)巨噬細胞的蟲體，而未進行上述包裹的AON殺蟲率只有20。不難看出，這種由受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用為反義RNA定向轉(zhuǎn)運提供了可靠運載工具，它可將反義RNA定向、

23、高效、低毒和安全地運送到靶細胞中充分發(fā)揮作用，避免了細胞外降解、非特異性攝入和安全性等問題，無疑是非常有前景的發(fā)展方向41,42。Hoerauf等成功地應(yīng)用反義核酸技術(shù)分析環(huán)孢多肽A(cyclosporin a，CsA)與環(huán)孢多肽A結(jié)合蛋白(cyclophilin)二者在利什曼原蟲感染中相互作用機制43。在此之前，CsA對利什曼原蟲的作用是通過宿主細胞中cyclophilin還是蟲體是的cyclophilin介導(dǎo)，始終未能明了。為此，Hoerauf首先從利什曼原蟲分離純化了2個分子量分另為20kDa和22kDa的cycolphilin，并進行了N'端測序。有趣的是，盡管它們的酶活性均受

24、到CsA抑制，但用CsA預(yù)處理后的利什曼原蟲對巨噬細胞感染率并未降低，由此看來CsA不能與利什曼原蟲自身cyclophilin結(jié)合。為此，作者利用反義核酸技術(shù)和動物模型，首先合成針對鼠宿主巨噬細胞cyclophilin的AON，并在感染蟲體前加入到巨噬細胞培養(yǎng)基中，結(jié)果巨噬細胞cyclophilin的表達和細胞內(nèi)無鞭毛體的增殖均受到明顯抑制，充分證明宿主細胞cyclophilin在蟲體的細胞內(nèi)增殖機制中發(fā)揮重要作用，首次闡明宿主細胞cyclophilin對細胞內(nèi)利什曼原蟲存活具有重要意義。3.4其它原蟲Ankri等利用反義RNA抑制溶組織內(nèi)阿米巴(entamoeba histolytica)半

25、胱氨酸蛋白酶基因表達44，結(jié)果篩選并獲得一穩(wěn)定轉(zhuǎn)化蟲株，其半胱氨酸蛋白酶活性90被抑制。該轉(zhuǎn)化蟲株在Diamond培養(yǎng)基中生長速率正常，致細胞病變效應(yīng)和溶組織活性與對照組轉(zhuǎn)化蟲株相同，但其吞噬作用則明顯被抑制。4展 望反義核酸在寄生蟲學(xué)領(lǐng)域中應(yīng)用還剛剛起步，不可避免地碰地許多有待解決的問題：1)目前的實驗結(jié)果僅限于體外實驗，多數(shù)處于體外培養(yǎng)水平，動物模型和體內(nèi)的作用尚不得而知；2)現(xiàn)有研究多為AON，畢竟依賴人工合成，開展反義表達載體和ribozyme于抗寄生蟲研究甚為必要；3)定向打靶問題。反義核酸如能專一地定向進入靶細胞發(fā)揮作用，必將提高其作用效果，開展諸如受體介導(dǎo)的定向轉(zhuǎn)移技術(shù)研究勢在必

26、行?？傊?，由于反義核酯具有許多其它藥物不可比擬的特性，它在寄生蟲學(xué)中的應(yīng)用前景不可估量，特別是對于提示寄生蟲學(xué)中某些長期懸而未決的機制具有很大潛力。隨著研究的不斷深入，當(dāng)人們成功地駕馭這種技術(shù)時，必將造福廣大人類。參考文獻1 Izant JG Weintraub HM.Cell,1984;36(4):1007-10152 Coleman J et al.Cell,1984;37(2):429-4363 Weintraub HM.Sci Am,1990;262(1):39-464 Krol ARV.Gene,1988;72(1-2):45-505 Shibahara S et al.Nuclei

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