細(xì)胞培養(yǎng)體外培養(yǎng)的基本方法和過程

1、2021/3/231實(shí)驗(yàn)課時(shí)間實(shí)驗(yàn)課時(shí)間:第第7 9周周實(shí)驗(yàn)課地點(diǎn)實(shí)驗(yàn)課地點(diǎn):104館四樓館四樓注意事項(xiàng)注意事項(xiàng): :1.1.網(wǎng)上沒有名字的網(wǎng)上沒有名字的 同學(xué)同學(xué)請不要填報(bào)實(shí)請不要填報(bào)實(shí) 驗(yàn)課名單。驗(yàn)課名單。2.2.現(xiàn)在不能確定現(xiàn)在不能確定 自己時(shí)間的同學(xué)自己時(shí)間的同學(xué) 不要填報(bào)不要填報(bào), ,可以可以 下次上課時(shí)再報(bào)。下次上課時(shí)再報(bào)。3.3.一旦填報(bào)就不能一旦填報(bào)就不能 再更改時(shí)間。再更改時(shí)間。2021/3/232體外培養(yǎng)的基本原理與技術(shù)體外培養(yǎng)的基本原理與技術(shù)一、從體內(nèi)生存環(huán)境到體外生長條件一、從體內(nèi)生存環(huán)境到體外生長條件二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程三、體外培養(yǎng)

2、物的生長生物學(xué)三、體外培養(yǎng)物的生長生物學(xué)四、細(xì)胞分離與純化四、細(xì)胞分離與純化五、細(xì)胞系（株）、細(xì)胞克隆五、細(xì)胞系（株）、細(xì)胞克隆六、培養(yǎng)物的觀察檢測方法六、培養(yǎng)物的觀察檢測方法2021/3/233二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程植塊植塊（explantexplant） : :從動(dòng)物體內(nèi)取出從動(dòng)物體內(nèi)取出, ,用于培養(yǎng)的小塊組織一般稱為用于培養(yǎng)的小塊組織一般稱為外植塊外植塊或或簡稱簡稱植塊植塊。分離（散）細(xì)胞分離（散）細(xì)胞isolatedisolated（dissociateddissociated）cellcell: :由組織塊分散后制成的單個(gè)細(xì)胞一般稱之。由組織塊分散后

3、制成的單個(gè)細(xì)胞一般稱之。細(xì)胞懸液細(xì)胞懸液（cell suspensioncell suspension）: :單個(gè)細(xì)胞分散存在于培養(yǎng)液或者其它平衡鹽溶液、緩沖溶單個(gè)細(xì)胞分散存在于培養(yǎng)液或者其它平衡鹽溶液、緩沖溶液中液中, ,就稱之就稱之 。幾個(gè)名詞和概念幾個(gè)名詞和概念:2021/3/234當(dāng)培養(yǎng)物的總體積不斷擴(kuò)大當(dāng)培養(yǎng)物的總體積不斷擴(kuò)大, ,培養(yǎng)過程持續(xù)到一定的時(shí)候培養(yǎng)過程持續(xù)到一定的時(shí)候, ,原先的培養(yǎng)器皿已不能滿足培養(yǎng)物的空間要求原先的培養(yǎng)器皿已不能滿足培養(yǎng)物的空間要求, ,這時(shí)就需要將這時(shí)就需要將培養(yǎng)物分成若干小的部分培養(yǎng)物分成若干小的部分, ,繼續(xù)培養(yǎng)。繼續(xù)培養(yǎng)。因此因此, ,按照培養(yǎng)

4、過程中培養(yǎng)物是否需要被分割后再培養(yǎng)按照培養(yǎng)過程中培養(yǎng)物是否需要被分割后再培養(yǎng), ,而將體外培養(yǎng)分為而將體外培養(yǎng)分為原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)或稱或稱初代培養(yǎng)初代培養(yǎng)（primary cultureprimary culture）和和繼代培養(yǎng)繼代培養(yǎng)（secondary culture)secondary culture)或稱或稱再培養(yǎng)再培養(yǎng)（subculturesubculture）兩大類。兩大類。二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程幾個(gè)名詞和概念幾個(gè)名詞和概念:2021/3/235（二）繼代培養(yǎng)（二）繼代培養(yǎng)（三）體外培養(yǎng)的基本方法和技術(shù)（三）體外培養(yǎng)的基本方法和技術(shù)（四）培養(yǎng)物的凍

5、存與復(fù)蘇（四）培養(yǎng)物的凍存與復(fù)蘇（五）培養(yǎng)物的污染（五）培養(yǎng)物的污染（一）原代培養(yǎng)（一）原代培養(yǎng)二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程2021/3/236（一）原代培養(yǎng)（一）原代培養(yǎng)（primary culture）二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程原代培養(yǎng)原代培養(yǎng),通俗地講通俗地講,就是第一次培養(yǎng)。它是指將培養(yǎng)物放就是第一次培養(yǎng)。它是指將培養(yǎng)物放置在體外生長環(huán)境中持續(xù)培養(yǎng)置在體外生長環(huán)境中持續(xù)培養(yǎng),中途不分割培養(yǎng)物的培養(yǎng)過程。中途不分割培養(yǎng)物的培養(yǎng)過程。原代培養(yǎng)的概念包含以下幾方面含義原代培養(yǎng)的概念包含以下幾方面含義:原代培養(yǎng)的實(shí)質(zhì)就是初次培養(yǎng)原代培養(yǎng)的實(shí)

6、質(zhì)就是初次培養(yǎng),即培養(yǎng)物一經(jīng)接種到培即培養(yǎng)物一經(jīng)接種到培養(yǎng)器皿中就不再分割養(yǎng)器皿中就不再分割,任其生長繁殖而不更換培養(yǎng)物的生長器任其生長繁殖而不更換培養(yǎng)物的生長器皿皿;原代培養(yǎng)中的原代培養(yǎng)中的“代代”并不是指細(xì)胞的并不是指細(xì)胞的“代代”數(shù)數(shù),原代培原代培養(yǎng)物中的細(xì)胞在接種之后并不一定沒有分裂增殖。相反養(yǎng)物中的細(xì)胞在接種之后并不一定沒有分裂增殖。相反,在原在原代培養(yǎng)過程中代培養(yǎng)過程中,培養(yǎng)物中的細(xì)胞也可能經(jīng)歷多次的細(xì)胞分裂活培養(yǎng)物中的細(xì)胞也可能經(jīng)歷多次的細(xì)胞分裂活動(dòng)而產(chǎn)生多個(gè)子代細(xì)胞動(dòng)而產(chǎn)生多個(gè)子代細(xì)胞;2021/3/237原代培養(yǎng)過程中不分割培養(yǎng)物不等于不更換培養(yǎng)液原代培養(yǎng)過程中不分割培養(yǎng)物不

7、等于不更換培養(yǎng)液, ,也不等于不更換培養(yǎng)器皿也不等于不更換培養(yǎng)器皿, ,像蓋玻片培養(yǎng)法和懸滴培養(yǎng)法像蓋玻片培養(yǎng)法和懸滴培養(yǎng)法, ,即即便在換液過程中更換培養(yǎng)器皿便在換液過程中更換培養(yǎng)器皿, ,但不更換培養(yǎng)組織細(xì)胞所附但不更換培養(yǎng)組織細(xì)胞所附著的生長基質(zhì)蓋片著的生長基質(zhì)蓋片, ,仍屬于原代培養(yǎng)仍屬于原代培養(yǎng); ;植塊培養(yǎng)不一定都是原代培養(yǎng)植塊培養(yǎng)不一定都是原代培養(yǎng), ,植塊培養(yǎng)有時(shí)候在培植塊培養(yǎng)有時(shí)候在培養(yǎng)物增長到一定程度后養(yǎng)物增長到一定程度后, ,也需要分割培養(yǎng)物為較小的部分再也需要分割培養(yǎng)物為較小的部分再培養(yǎng)。培養(yǎng)。二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程（一）原代培養(yǎng)（一）原

8、代培養(yǎng)（primary culture）2021/3/238、取材及培養(yǎng)材料的制備、取材及培養(yǎng)材料的制備、分離（散）細(xì)胞的方法、分離（散）細(xì)胞的方法、接種與培養(yǎng)過程、接種與培養(yǎng)過程、更換培養(yǎng)液、更換培養(yǎng)液二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程（一）原代培養(yǎng)（一）原代培養(yǎng)（primary culture）2021/3/239（1 1）準(zhǔn)備工作）準(zhǔn)備工作: :（2 2）制備基本步驟（技術(shù)路線）制備基本步驟（技術(shù)路線）: :主要是主要是取材器具取材器具、用品用品的的滅菌滅菌以及以及實(shí)驗(yàn)者實(shí)驗(yàn)者、實(shí)驗(yàn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物物的的清潔與消毒清潔與消毒。、取材及培養(yǎng)材料的制備、取材及培養(yǎng)材料的制備:二

9、二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程（一）原代培養(yǎng)（一）原代培養(yǎng)（primary culture）2021/3/2310大塊組織大塊組織洗去血污洗去血污 剔除多余成分剔除多余成分切成約切成約1mm3大小的植塊大小的植塊植塊培養(yǎng)植塊培養(yǎng) 將所取組織剪碎將所取組織剪碎 蛋白酶溶液消化蛋白酶溶液消化 機(jī)械方法吹打組織塊機(jī)械方法吹打組織塊 不銹鋼網(wǎng)篩過濾不銹鋼網(wǎng)篩過濾 過濾液離心過濾液離心 用培養(yǎng)液懸浮成細(xì)胞懸液用培養(yǎng)液懸浮成細(xì)胞懸液 計(jì)數(shù)并調(diào)節(jié)細(xì)胞密度計(jì)數(shù)并調(diào)節(jié)細(xì)胞密度 培養(yǎng)分離的細(xì)胞培養(yǎng)分離的細(xì)胞二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程（2 2）基本步驟（技術(shù)路線）基

10、本步驟（技術(shù)路線）: :（一）原代培養(yǎng)（一）原代培養(yǎng)（primary culture）2021/3/2311、取材及培養(yǎng)材料的制備、取材及培養(yǎng)材料的制備:二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程關(guān)于取材關(guān)于取材: :（1)1)取材要準(zhǔn)確取材要準(zhǔn)確: :取材是體外培養(yǎng)工作的開端。如果在取材是體外培養(yǎng)工作的開端。如果在這最初的實(shí)驗(yàn)過程中沒有取到合格、理想的實(shí)驗(yàn)材料這最初的實(shí)驗(yàn)過程中沒有取到合格、理想的實(shí)驗(yàn)材料, ,整個(gè)整個(gè)體外培養(yǎng)過程就很難達(dá)到預(yù)期的目的。體外培養(yǎng)過程就很難達(dá)到預(yù)期的目的。(2)(2)關(guān)于取材及制備培養(yǎng)材料的步驟關(guān)于取材及制備培養(yǎng)材料的步驟: :就動(dòng)物不同組織的就動(dòng)物

11、不同組織的取材而言取材而言, ,取材的步驟大同小異。但在具體操作過程中取材的步驟大同小異。但在具體操作過程中, ,還需還需要根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)情況做一些調(diào)整。要根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)情況做一些調(diào)整。（一）原代培養(yǎng)（一）原代培養(yǎng)（primary culture）2021/3/2312、取材及培養(yǎng)材料的制備、取材及培養(yǎng)材料的制備、分離（散）細(xì)胞的方法、分離（散）細(xì)胞的方法、接種與培養(yǎng)過程、接種與培養(yǎng)過程、更換培養(yǎng)液、更換培養(yǎng)液二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程（一）原代培養(yǎng)（一）原代培養(yǎng)（primary culture）2021/3/2313（1 1）機(jī)械解離細(xì)胞法）機(jī)械解離細(xì)胞法: :

12、1 1）吸管吹打法）吸管吹打法- 2 2）過篩法）過篩法-（2 2）酶學(xué)解離細(xì)胞法）酶學(xué)解離細(xì)胞法: : 1 1）胰蛋白酶離解細(xì)胞法）胰蛋白酶離解細(xì)胞法- 2 2）膠原酶離解細(xì)胞法）膠原酶離解細(xì)胞法-（3 3）螯合劑解離細(xì)胞法）螯合劑解離細(xì)胞法: : 常用螯合劑常用螯合劑: :乙二胺四乙酸鈉（乙二胺四乙酸鈉（EDTA-NaEDTA-Na）、）、 檸檬酸鈉、檸檬酸鈉、 枸櫞酸鈉。枸櫞酸鈉。二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程、分離（散）細(xì)胞的方法、分離（散）細(xì)胞的方法:（一）原代培養(yǎng)（一）原代培養(yǎng)（primary culture）2021/3/2314、取材及培養(yǎng)材料的制備、取

13、材及培養(yǎng)材料的制備、分離（散）細(xì)胞的方法、分離（散）細(xì)胞的方法、接種與培養(yǎng)過程、接種與培養(yǎng)過程、更換培養(yǎng)液、更換培養(yǎng)液二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程（一）原代培養(yǎng)（一）原代培養(yǎng)（primary culture）2021/3/2315、接種與培養(yǎng)過程、接種與培養(yǎng)過程二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程接種接種（seedingseeding）也稱）也稱種植種植(plating)(plating)或或體外移植體外移植(explantation),(explantation),實(shí)際上就是將取材并切割好的組織塊（植實(shí)際上就是將取材并切割好的組織塊（植塊）或者分離

14、好的細(xì)胞懸液加到培養(yǎng)器皿內(nèi)的過程。塊）或者分離好的細(xì)胞懸液加到培養(yǎng)器皿內(nèi)的過程。如果將準(zhǔn)備好的植塊（包括器官型植塊）接種并進(jìn)行培如果將準(zhǔn)備好的植塊（包括器官型植塊）接種并進(jìn)行培養(yǎng)養(yǎng), ,就稱為就稱為植塊培養(yǎng)植塊培養(yǎng)。體外移植體外移植的稱謂較多用于植塊培養(yǎng)的的稱謂較多用于植塊培養(yǎng)的情況。情況。如果將所制備的細(xì)胞懸液用于種植和培養(yǎng)如果將所制備的細(xì)胞懸液用于種植和培養(yǎng), ,就稱為就稱為分離分離（散）細(xì)胞培養(yǎng)（散）細(xì)胞培養(yǎng)。（一）原代培養(yǎng)（一）原代培養(yǎng)（primary culture）2021/3/2316、接種與培養(yǎng)過程、接種與培養(yǎng)過程二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程分離（散）

15、細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞如果屬于分離（散）細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞如果屬于貼壁依賴型細(xì)胞貼壁依賴型細(xì)胞, ,在培養(yǎng)瓶皿中必須黏附于一定的生長基質(zhì)表面才能生長在培養(yǎng)瓶皿中必須黏附于一定的生長基質(zhì)表面才能生長, ,這這樣的細(xì)胞一般只能在培養(yǎng)瓶皿表面長滿一層樣的細(xì)胞一般只能在培養(yǎng)瓶皿表面長滿一層, ,當(dāng)培養(yǎng)物長滿當(dāng)培養(yǎng)物長滿培養(yǎng)器皿的表面時(shí)即會(huì)因?yàn)榻佑|抑制而停止生長培養(yǎng)器皿的表面時(shí)即會(huì)因?yàn)榻佑|抑制而停止生長, ,這種培養(yǎng)這種培養(yǎng)方式就稱為方式就稱為單層細(xì)胞培養(yǎng)（單層細(xì)胞培養(yǎng)（single-layer cell culture)single-layer cell culture)。如果所培養(yǎng)的細(xì)胞沒有貼壁依賴性如果所培養(yǎng)

16、的細(xì)胞沒有貼壁依賴性, ,在懸浮狀態(tài)下即可在懸浮狀態(tài)下即可以生長和繁殖以生長和繁殖, ,這樣的培養(yǎng)方式就稱為這樣的培養(yǎng)方式就稱為懸?。?xì)胞）培養(yǎng)懸?。?xì)胞）培養(yǎng)（suspension culturesuspension culture）。）。（一）原代培養(yǎng)（一）原代培養(yǎng)（primary culture）2021/3/2317、接種與培養(yǎng)過程、接種與培養(yǎng)過程二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程（1 1）植塊培養(yǎng)）植塊培養(yǎng): :植塊培養(yǎng)是比較簡單的培養(yǎng)方法植塊培養(yǎng)是比較簡單的培養(yǎng)方法, ,其技術(shù)要點(diǎn)就是將從其技術(shù)要點(diǎn)就是將從動(dòng)物體內(nèi)所取得的組織切割成一定大小的植塊動(dòng)物體內(nèi)所取得的

17、組織切割成一定大小的植塊, ,再將植塊接再將植塊接種到培養(yǎng)瓶皿內(nèi)種到培養(yǎng)瓶皿內(nèi), ,加入培養(yǎng)液加入培養(yǎng)液, ,然后將培養(yǎng)瓶皿送入培養(yǎng)箱中然后將培養(yǎng)瓶皿送入培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。進(jìn)行培養(yǎng)。植塊培養(yǎng)的目的主要有兩個(gè)植塊培養(yǎng)的目的主要有兩個(gè), ,其一其一是觀察植塊的組織學(xué)是觀察植塊的組織學(xué)生長行為生長行為, ,其二其二是通過植塊培養(yǎng)是通過植塊培養(yǎng), ,讓構(gòu)成植塊的細(xì)胞從植塊內(nèi)讓構(gòu)成植塊的細(xì)胞從植塊內(nèi)遷移出來并在植塊外分裂增殖遷移出來并在植塊外分裂增殖, ,然后將植塊去除然后將植塊去除, ,從而得到細(xì)從而得到細(xì)胞培養(yǎng)物。胞培養(yǎng)物。（一）原代培養(yǎng)（一）原代培養(yǎng)（primary culture）2021/3/

18、2318、接種與培養(yǎng)過程、接種與培養(yǎng)過程二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程（2 2）分離（散）細(xì)胞培養(yǎng)）分離（散）細(xì)胞培養(yǎng): :相對于植塊培養(yǎng)法相對于植塊培養(yǎng)法, ,分離（散）細(xì)胞培養(yǎng)的最大優(yōu)點(diǎn)是分離（散）細(xì)胞培養(yǎng)的最大優(yōu)點(diǎn)是: :解除了植塊內(nèi)細(xì)胞之間的解除了植塊內(nèi)細(xì)胞之間的“組織關(guān)系組織關(guān)系”, ,從而可以反映出單個(gè)從而可以反映出單個(gè)細(xì)胞的生物學(xué)特征。細(xì)胞的生物學(xué)特征。借助分離（散）細(xì)胞培養(yǎng)法借助分離（散）細(xì)胞培養(yǎng)法, ,還可以分離還可以分離(isolate)(isolate)或純或純化某一類型的細(xì)胞化某一類型的細(xì)胞, ,從而實(shí)現(xiàn)對從而實(shí)現(xiàn)對單一細(xì)胞類型（單一細(xì)胞類型（m

19、onotypic monotypic cell culturecell culture）進(jìn)行細(xì)胞生物學(xué)研究。進(jìn)行細(xì)胞生物學(xué)研究。動(dòng)物組織的大多數(shù)細(xì)胞類型都屬于動(dòng)物組織的大多數(shù)細(xì)胞類型都屬于貼壁（錨定）依賴型貼壁（錨定）依賴型細(xì)胞（細(xì)胞（anchorage-dependent cell)anchorage-dependent cell)。（一）原代培養(yǎng)（一）原代培養(yǎng)（primary culture）2021/3/2319、接種與培養(yǎng)過程、接種與培養(yǎng)過程二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程（3 3）生長基質(zhì)）生長基質(zhì): :生長基質(zhì)（生長基質(zhì)（growth substratumgr

20、owth substratum）泛指泛指培養(yǎng)物附著的各種培養(yǎng)物附著的各種介質(zhì)介質(zhì), ,狹義特指狹義特指在塑料或玻璃培養(yǎng)器皿表面上涂布（包被）的一在塑料或玻璃培養(yǎng)器皿表面上涂布（包被）的一層能夠促進(jìn)培養(yǎng)物黏附、貼壁與鋪展的生物活性物質(zhì)。層能夠促進(jìn)培養(yǎng)物黏附、貼壁與鋪展的生物活性物質(zhì)。一般來說一般來說,國際上一些著名廠商生產(chǎn)的塑料或玻璃培養(yǎng)器皿國際上一些著名廠商生產(chǎn)的塑料或玻璃培養(yǎng)器皿,其使用的材質(zhì)能夠適宜大多數(shù)種類的動(dòng)物細(xì)胞體外生長。只有其使用的材質(zhì)能夠適宜大多數(shù)種類的動(dòng)物細(xì)胞體外生長。只有少數(shù)黏附和貼壁能力較差的細(xì)胞少數(shù)黏附和貼壁能力較差的細(xì)胞,需給予提供包被有特殊生長基需給予提供包被有特殊生

21、長基質(zhì)物質(zhì)的生長表面。質(zhì)物質(zhì)的生長表面。（一）原代培養(yǎng)（一）原代培養(yǎng)（primary culture）2021/3/2320、接種與培養(yǎng)過程、接種與培養(yǎng)過程二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程（4 4）懸浮細(xì)胞培養(yǎng)（）懸浮細(xì)胞培養(yǎng)（suspension cell culture）對于有些細(xì)胞來說對于有些細(xì)胞來說, ,其生長不需要黏附在某一固相表面便其生長不需要黏附在某一固相表面便能分裂增殖。例如能分裂增殖。例如, ,某些白血病細(xì)胞、某些腹水瘤細(xì)胞等。某些白血病細(xì)胞、某些腹水瘤細(xì)胞等。體外培養(yǎng)這種細(xì)胞時(shí)體外培養(yǎng)這種細(xì)胞時(shí),可以通過對培養(yǎng)液以及其中的細(xì)胞可以通過對培養(yǎng)液以及其中的

22、細(xì)胞進(jìn)行不斷攪拌進(jìn)行不斷攪拌,或?qū)ε囵B(yǎng)器皿進(jìn)行振蕩、快速旋轉(zhuǎn)而維持細(xì)胞或?qū)ε囵B(yǎng)器皿進(jìn)行振蕩、快速旋轉(zhuǎn)而維持細(xì)胞的懸浮狀態(tài)。也有一些細(xì)胞無須攪拌或用搖床搖動(dòng)的懸浮狀態(tài)。也有一些細(xì)胞無須攪拌或用搖床搖動(dòng),只要在培只要在培養(yǎng)器皿表面涂布一層不利于細(xì)胞粘附的硅脂即可維持懸浮狀態(tài)。養(yǎng)器皿表面涂布一層不利于細(xì)胞粘附的硅脂即可維持懸浮狀態(tài)。這種培養(yǎng)方法就稱為這種培養(yǎng)方法就稱為懸浮細(xì)胞培養(yǎng)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)。（一）原代培養(yǎng)（一）原代培養(yǎng)（primary culture）2021/3/2321、取材及培養(yǎng)材料的制備、取材及培養(yǎng)材料的制備、分離（散）細(xì)胞的方法、分離（散）細(xì)胞的方法、接種與培養(yǎng)過程、接種與培養(yǎng)過程、更換

23、培養(yǎng)液、更換培養(yǎng)液二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程（一）原代培養(yǎng)（一）原代培養(yǎng)（primary culture）2021/3/2322、更換培養(yǎng)液、更換培養(yǎng)液二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程隨著培養(yǎng)的進(jìn)程隨著培養(yǎng)的進(jìn)程, ,營養(yǎng)物被消耗營養(yǎng)物被消耗, ,細(xì)胞的代謝產(chǎn)物愈來愈細(xì)胞的代謝產(chǎn)物愈來愈多多, ,尤其是細(xì)胞呼吸反應(yīng)尤其是細(xì)胞呼吸反應(yīng), ,釋放出的釋放出的COCO2 2及其它酸性代謝產(chǎn)物及其它酸性代謝產(chǎn)物（如乳酸和丙酮酸）越來越多（如乳酸和丙酮酸）越來越多, ,培養(yǎng)液的培養(yǎng)液的p pH H值越來越低值越來越低, ,培養(yǎng)培養(yǎng)液的顏色越來越黃。液的顏

24、色越來越黃。根據(jù)培養(yǎng)液的根據(jù)培養(yǎng)液的顏色變化顏色變化確定換液的間隔時(shí)間是很有確定換液的間隔時(shí)間是很有實(shí)際實(shí)際意義意義的。營養(yǎng)物質(zhì)消耗的快慢還取決于所接種的細(xì)胞數(shù)量。的。營養(yǎng)物質(zhì)消耗的快慢還取決于所接種的細(xì)胞數(shù)量。隨著培養(yǎng)過程的繼續(xù)隨著培養(yǎng)過程的繼續(xù), ,細(xì)胞會(huì)分裂增生細(xì)胞會(huì)分裂增生, ,數(shù)量增加數(shù)量增加, ,換液換液的時(shí)間間隔就可能越來越短。的時(shí)間間隔就可能越來越短。（一）原代培養(yǎng)（一）原代培養(yǎng)（primary culture）2021/3/2323二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程5 5、原代細(xì)胞培養(yǎng)方法的注意事項(xiàng)、原代細(xì)胞培養(yǎng)方法的注意事項(xiàng)（1 1）關(guān)于培養(yǎng)液）關(guān)于培養(yǎng)

25、液: :1)1)培養(yǎng)基的選擇培養(yǎng)基的選擇: :培養(yǎng)某一種細(xì)胞培養(yǎng)某一種細(xì)胞, ,到底選用哪一種培養(yǎng)基到底選用哪一種培養(yǎng)基, ,需要根需要根據(jù)細(xì)胞的生長情況摸索確定。據(jù)細(xì)胞的生長情況摸索確定。2 2）添加物添加物: :選擇好培養(yǎng)基類型以后選擇好培養(yǎng)基類型以后, ,還要摸索需要補(bǔ)加的成分及其還要摸索需要補(bǔ)加的成分及其添加量。添加量。3)3)培養(yǎng)液的酸堿度培養(yǎng)液的酸堿度: :普通動(dòng)物細(xì)胞一般適宜的普通動(dòng)物細(xì)胞一般適宜的p pH H范圍為范圍為7.27.27.47.4當(dāng)當(dāng)p pH H值低于值低于6.86.8時(shí)時(shí), ,會(huì)對細(xì)胞的生長產(chǎn)生抑制作用。會(huì)對細(xì)胞的生長產(chǎn)生抑制作用。4)4)換液換液: :換液時(shí)換

26、液時(shí), ,如果細(xì)胞密度很低或者細(xì)胞的生長較為緩慢如果細(xì)胞密度很低或者細(xì)胞的生長較為緩慢, ,可以可以不完全更換培養(yǎng)液不完全更換培養(yǎng)液, ,只吸出一半的舊培養(yǎng)液只吸出一半的舊培養(yǎng)液, ,補(bǔ)加相同體積的新培補(bǔ)加相同體積的新培養(yǎng)液即可。養(yǎng)液即可。培養(yǎng)液最好經(jīng)事先預(yù)溫至培養(yǎng)液最好經(jīng)事先預(yù)溫至37370 0C C。（一）原代培養(yǎng)（一）原代培養(yǎng)（primary culture）2021/3/2324二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程5 5、原代細(xì)胞培養(yǎng)方法的注意事項(xiàng)、原代細(xì)胞培養(yǎng)方法的注意事項(xiàng)（2 2）關(guān)于培養(yǎng)空間）關(guān)于培養(yǎng)空間: :培養(yǎng)空間是指培養(yǎng)物生存的空間培養(yǎng)空間是指培養(yǎng)物生存的

27、空間, ,包括包括液相環(huán)境液相環(huán)境與與氣相氣相環(huán)境環(huán)境兩方面。兩方面。調(diào)整培養(yǎng)空間的調(diào)整培養(yǎng)空間的主要目的主要目的是改變對培養(yǎng)物的供氧量。是改變對培養(yǎng)物的供氧量。一般來說一般來說, ,培養(yǎng)液與液面上的空間二者之間的體積比例培養(yǎng)液與液面上的空間二者之間的體積比例以以1 1: :1010為宜。加入的培養(yǎng)液液面高度最好維持在為宜。加入的培養(yǎng)液液面高度最好維持在2 25mm5mm的的范圍。范圍。（一）原代培養(yǎng)（一）原代培養(yǎng)（primary culture）2021/3/2325二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程5 5、原代細(xì)胞培養(yǎng)方法的注意事項(xiàng)、原代細(xì)胞培養(yǎng)方法的注意事項(xiàng)（3 3）

28、其它方面）其它方面: : 必須根據(jù)不同必須根據(jù)不同細(xì)胞生命力細(xì)胞生命力的不同以及對環(huán)境轉(zhuǎn)變適應(yīng)的不同以及對環(huán)境轉(zhuǎn)變適應(yīng)能力的不同能力的不同, ,選擇適宜的取材、分散、種植方法和選用適選擇適宜的取材、分散、種植方法和選用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件。當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件。 除了所培養(yǎng)細(xì)胞自身的活力外除了所培養(yǎng)細(xì)胞自身的活力外, ,原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)不成功最大不成功最大的可能性有兩點(diǎn)的可能性有兩點(diǎn): :其一其一是在對組織是在對組織分散分散并并分離分離細(xì)胞的過程細(xì)胞的過程中嚴(yán)重?fù)p傷了細(xì)胞中嚴(yán)重?fù)p傷了細(xì)胞, ,其二其二是給細(xì)胞提供的體外生長環(huán)境是給細(xì)胞提供的體外生長環(huán)境, ,尤尤其是其是生長基質(zhì)生長基質(zhì)與與培養(yǎng)液培養(yǎng)液條件不

29、合適。條件不合適。（一）原代培養(yǎng)（一）原代培養(yǎng)（primary culture）2021/3/2326（二）繼代培養(yǎng)（二）繼代培養(yǎng)（三）體外培養(yǎng)的基本方法和技術(shù)（三）體外培養(yǎng)的基本方法和技術(shù)（四）培養(yǎng)物的凍存與復(fù)蘇（四）培養(yǎng)物的凍存與復(fù)蘇（五）培養(yǎng)物的污染（五）培養(yǎng)物的污染（一）原代培養(yǎng)（一）原代培養(yǎng)二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程2021/3/2327（二）繼代培養(yǎng)（二）繼代培養(yǎng)（secondary culture）二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程將培養(yǎng)物分割成小的部分將培養(yǎng)物分割成小的部分, ,重新接種到另外的培養(yǎng)器皿內(nèi)重新接種到另外的培養(yǎng)器皿內(nèi)

30、, ,再進(jìn)行培養(yǎng)再進(jìn)行培養(yǎng), ,這個(gè)過程就稱為這個(gè)過程就稱為傳代（傳代（passagepassage）或者或者再培養(yǎng)再培養(yǎng)（subculturesubculture）。）。傳代培養(yǎng)的實(shí)質(zhì)就是傳代培養(yǎng)的實(shí)質(zhì)就是分割后再次培養(yǎng)分割后再次培養(yǎng)。只要是將培養(yǎng)物從一個(gè)培養(yǎng)器皿轉(zhuǎn)移到另一個(gè)器皿之內(nèi)只要是將培養(yǎng)物從一個(gè)培養(yǎng)器皿轉(zhuǎn)移到另一個(gè)器皿之內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)就算繼續(xù)培養(yǎng)就算傳代傳代。即便是按。即便是按“一傳一一傳一”的比例進(jìn)行傳代。的比例進(jìn)行傳代。2021/3/23281 1、原代培養(yǎng)物需要傳代的指標(biāo)、原代培養(yǎng)物需要傳代的指標(biāo)2 2、傳代的過程、傳代的過程3 3、傳代培養(yǎng)的注意事項(xiàng)、傳代培養(yǎng)的注意事項(xiàng)二二、體外

31、培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程（二）繼代培養(yǎng)（二）繼代培養(yǎng)（secondary culture）2021/3/2329二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程（1 1）植塊培養(yǎng)物與器官培養(yǎng)物）植塊培養(yǎng)物與器官培養(yǎng)物: :植塊培養(yǎng)物生長一定時(shí)間之后植塊培養(yǎng)物生長一定時(shí)間之后, ,從植塊內(nèi)長出從植塊內(nèi)長出（outgrowingoutgrowing）的細(xì)胞會(huì)越來越多）的細(xì)胞會(huì)越來越多, ,遷移出來的細(xì)胞也會(huì)不斷遷移出來的細(xì)胞也會(huì)不斷分裂繁殖分裂繁殖, ,逐漸長滿所附著的生長基質(zhì)表面逐漸長滿所附著的生長基質(zhì)表面, ,細(xì)胞之間逐漸發(fā)生細(xì)胞之間逐漸發(fā)生接觸性抑制現(xiàn)象。接觸性抑制

32、現(xiàn)象。若不將原代培養(yǎng)物分割再進(jìn)行培養(yǎng)若不將原代培養(yǎng)物分割再進(jìn)行培養(yǎng), ,植塊培養(yǎng)物可能會(huì)停植塊培養(yǎng)物可能會(huì)停止生長。止生長。1 1、原代培養(yǎng)物需要傳代的指標(biāo)、原代培養(yǎng)物需要傳代的指標(biāo)（二）繼代培養(yǎng)（二）繼代培養(yǎng)（secondary culture）2021/3/2330二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程（2 2）分離（散）細(xì)胞培養(yǎng)物）分離（散）細(xì)胞培養(yǎng)物: :對于貼壁依賴型細(xì)胞來講對于貼壁依賴型細(xì)胞來講, ,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長, ,細(xì)胞分細(xì)胞分裂增殖裂增殖, ,數(shù)量愈來愈大數(shù)量愈來愈大, ,逐漸會(huì)在培養(yǎng)瓶皿的底壁形成一完整逐漸會(huì)在培養(yǎng)瓶皿的底壁形成一完整的

33、細(xì)胞層的細(xì)胞層, ,細(xì)胞之間因接觸性抑制作用而停止生長細(xì)胞之間因接觸性抑制作用而停止生長, ,此時(shí)便需此時(shí)便需要進(jìn)行傳代。要進(jìn)行傳代。判斷分離（散）細(xì)胞培養(yǎng)物是否需要傳代的判斷分離（散）細(xì)胞培養(yǎng)物是否需要傳代的主要指標(biāo)主要指標(biāo)就就是觀察培養(yǎng)物是觀察培養(yǎng)物是否已基本長滿培養(yǎng)瓶皿的底壁是否已基本長滿培養(yǎng)瓶皿的底壁。1 1、原代培養(yǎng)物需要傳代的指標(biāo)、原代培養(yǎng)物需要傳代的指標(biāo)（二）繼代培養(yǎng)（二）繼代培養(yǎng)（secondary culture）2021/3/2331二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程（3 3）懸浮培養(yǎng)物）懸浮培養(yǎng)物: :懸浮培養(yǎng)細(xì)胞之間雖然不容易發(fā)生接觸性抑制現(xiàn)象懸浮培

34、養(yǎng)細(xì)胞之間雖然不容易發(fā)生接觸性抑制現(xiàn)象, ,但但隨著培養(yǎng)液中細(xì)胞數(shù)量的增加隨著培養(yǎng)液中細(xì)胞數(shù)量的增加, ,細(xì)胞的生存空間會(huì)越來越小細(xì)胞的生存空間會(huì)越來越小, ,營養(yǎng)供應(yīng)愈趨緊張營養(yǎng)供應(yīng)愈趨緊張, ,代謝產(chǎn)物積聚代謝產(chǎn)物積聚, ,培養(yǎng)環(huán)境逐漸不適應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境逐漸不適應(yīng)細(xì)胞的生長的生長, ,因而需要傳代。因而需要傳代。1 1、原代培養(yǎng)物需要傳代的指標(biāo)、原代培養(yǎng)物需要傳代的指標(biāo)（二）繼代培養(yǎng)（二）繼代培養(yǎng)（secondary culture）2021/3/23321 1、原代培養(yǎng)物需要傳代的指標(biāo)、原代培養(yǎng)物需要傳代的指標(biāo)2 2、傳代的過程、傳代的過程3 3、傳代培養(yǎng)的注意事項(xiàng)、傳代培養(yǎng)的注意事項(xiàng)二

35、二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程（二）繼代培養(yǎng)（二）繼代培養(yǎng)（secondary culture）2021/3/2333二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程2 2、傳代的過程、傳代的過程（1 1）分離（散）細(xì)胞培養(yǎng)物）分離（散）細(xì)胞培養(yǎng)物 : : （貼壁依賴型細(xì)胞）（貼壁依賴型細(xì)胞）1 1）棄去原培養(yǎng)液（吸出或傾倒）棄去原培養(yǎng)液（吸出或傾倒） ; ;2 2）漂洗）漂洗: :1212次次, ,3 3）離解細(xì)胞）離解細(xì)胞: :4 4）終止消化）終止消化: :5 5）吹打分離細(xì)胞）吹打分離細(xì)胞: :6 6）離心）離心: :7 7）重新懸浮、計(jì)數(shù)）重新懸浮、計(jì)數(shù):

36、 :8 8）分裝）分裝: :9 9）送培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。）送培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。（二）繼代培養(yǎng)（二）繼代培養(yǎng)（secondary culture）2021/3/2334（2 2）懸浮培養(yǎng)物）懸浮培養(yǎng)物: :無需分割培養(yǎng)物。無需分割培養(yǎng)物。1 1）離心）離心: :2 2）重新懸浮、計(jì)數(shù)）重新懸浮、計(jì)數(shù): :3 3）分裝）分裝: :4 4）送培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。）送培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程2 2、傳代的過程、傳代的過程（二）繼代培養(yǎng)（二）繼代培養(yǎng)（secondary culture）2021/3/2335二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程2

37、2、傳代的過程、傳代的過程（3 3）植塊培養(yǎng)物）植塊培養(yǎng)物: : 對這種培養(yǎng)物對這種培養(yǎng)物, ,僅在少數(shù)情況下再培養(yǎng)。僅在少數(shù)情況下再培養(yǎng)。由于它們一般是種植在生長基質(zhì)蓋玻片上由于它們一般是種植在生長基質(zhì)蓋玻片上, ,再培養(yǎng)時(shí)一般再培養(yǎng)時(shí)一般不更換生長基質(zhì)蓋玻片不更換生長基質(zhì)蓋玻片, ,只是將培養(yǎng)物分割并舍棄部分培養(yǎng)物只是將培養(yǎng)物分割并舍棄部分培養(yǎng)物, ,而將剩余的培養(yǎng)物繼續(xù)培養(yǎng)而將剩余的培養(yǎng)物繼續(xù)培養(yǎng)（二）繼代培養(yǎng)（二）繼代培養(yǎng)（secondary culture）2021/3/23361 1、原代培養(yǎng)物需要傳代的指標(biāo)、原代培養(yǎng)物需要傳代的指標(biāo)2 2、傳代的過程、傳代的過程3 3、傳代培養(yǎng)的

38、注意事項(xiàng)、傳代培養(yǎng)的注意事項(xiàng)二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程（二）繼代培養(yǎng)（二）繼代培養(yǎng)（secondary culture）2021/3/2337二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程3 3、傳代培養(yǎng)的注意事項(xiàng)、傳代培養(yǎng)的注意事項(xiàng)傳代培養(yǎng)首先必須注意的事項(xiàng)傳代培養(yǎng)首先必須注意的事項(xiàng):根據(jù)不同細(xì)胞的承受能力根據(jù)不同細(xì)胞的承受能力;選擇合適的時(shí)間選擇合適的時(shí)間;采用適當(dāng)?shù)姆椒?。采用適當(dāng)?shù)姆椒?。（二）繼代培養(yǎng)（二）繼代培養(yǎng)（secondary culture）2021/3/2338二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程3 3、傳代培養(yǎng)的注意事項(xiàng)

39、、傳代培養(yǎng)的注意事項(xiàng)（1 1）傳代的時(shí)機(jī)與再培養(yǎng)的細(xì)胞密度）傳代的時(shí)機(jī)與再培養(yǎng)的細(xì)胞密度: :不要急于傳代是對大多數(shù)生命力較為脆弱的細(xì)胞體外培養(yǎng)不要急于傳代是對大多數(shù)生命力較為脆弱的細(xì)胞體外培養(yǎng)的的上策上策。除非需要利用傳代實(shí)現(xiàn)其它的目的除非需要利用傳代實(shí)現(xiàn)其它的目的, ,如通過傳代對培養(yǎng)物如通過傳代對培養(yǎng)物中的混合細(xì)胞進(jìn)行分離。中的混合細(xì)胞進(jìn)行分離。由于在體時(shí)細(xì)胞之間的相互作用有利于細(xì)胞的生存和生命由于在體時(shí)細(xì)胞之間的相互作用有利于細(xì)胞的生存和生命活動(dòng)活動(dòng), ,因而在進(jìn)行體外分離細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)盡量給細(xì)胞提供相互作因而在進(jìn)行體外分離細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)盡量給細(xì)胞提供相互作用的條件。一個(gè)重要的方法就是增大接種

40、的細(xì)胞密度用的條件。一個(gè)重要的方法就是增大接種的細(xì)胞密度, ,使培養(yǎng)使培養(yǎng)的細(xì)胞盡快發(fā)生相互作用。的細(xì)胞盡快發(fā)生相互作用。（二）繼代培養(yǎng)（二）繼代培養(yǎng)（secondary culture）2021/3/2339二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程3 3、傳代培養(yǎng)的注意事項(xiàng)、傳代培養(yǎng)的注意事項(xiàng)（2 2）傳代數(shù)或代數(shù)與培養(yǎng)物的生長）傳代數(shù)或代數(shù)與培養(yǎng)物的生長: :傳代數(shù)或代數(shù)（傳代數(shù)或代數(shù)（passage numberpassage number）是指對培養(yǎng)物傳代的次）是指對培養(yǎng)物傳代的次數(shù)。用它可以相對地衡量某一培養(yǎng)物的數(shù)。用它可以相對地衡量某一培養(yǎng)物的培養(yǎng)年齡培養(yǎng)年齡（cul

41、ture culture ageage）。）。經(jīng)過一次傳代經(jīng)過一次傳代, ,細(xì)胞的生長環(huán)境就發(fā)生一次大的變化。體細(xì)胞的生長環(huán)境就發(fā)生一次大的變化。體外生長的細(xì)胞若處于外生長的細(xì)胞若處于“動(dòng)蕩動(dòng)蕩”的生活環(huán)境中的生活環(huán)境中, ,其生物學(xué)性狀往其生物學(xué)性狀往往容易發(fā)生改變往容易發(fā)生改變, ,尤其是細(xì)胞的遺傳特性可能會(huì)發(fā)生改變。尤其是細(xì)胞的遺傳特性可能會(huì)發(fā)生改變。應(yīng)該認(rèn)識到應(yīng)該認(rèn)識到,傳代對細(xì)胞生長和性狀是有影響的傳代對細(xì)胞生長和性狀是有影響的,在必要性在必要性不強(qiáng)的情況下不強(qiáng)的情況下,少傳代為上。少傳代為上。（二）繼代培養(yǎng)（二）繼代培養(yǎng)（secondary culture）2021/3/2340（

42、二）繼代培養(yǎng)（二）繼代培養(yǎng)（三）體外培養(yǎng)的基本方法和技術(shù)（三）體外培養(yǎng)的基本方法和技術(shù)（四）培養(yǎng)物的凍存與復(fù)蘇（四）培養(yǎng)物的凍存與復(fù)蘇（五）培養(yǎng)物的污染（五）培養(yǎng)物的污染（一）原代培養(yǎng)（一）原代培養(yǎng)二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程2021/3/2341二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程（三）體外培養(yǎng)的基本方法和技術(shù)（三）體外培養(yǎng)的基本方法和技術(shù)這里要介紹的是這里要介紹的是,體外培養(yǎng)這門技術(shù)從創(chuàng)體外培養(yǎng)這門技術(shù)從創(chuàng)立以來所發(fā)展起來的、若干種被普遍運(yùn)用的、立以來所發(fā)展起來的、若干種被普遍運(yùn)用的、具有代表性的基本方法和技術(shù)。具有代表性的基本方法和技術(shù)。這些基

43、本的方法和技術(shù)有的還在使用這些基本的方法和技術(shù)有的還在使用,有有的則已不常使用的則已不常使用,代之以一些改良的方法和技代之以一些改良的方法和技術(shù)。術(shù)。2021/3/2342二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程（三）體外培養(yǎng)的基本方法和技術(shù)（三）體外培養(yǎng)的基本方法和技術(shù)1 1、懸滴培養(yǎng)法、懸滴培養(yǎng)法2 2、培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法3 3、蓋玻片培養(yǎng)法、蓋玻片培養(yǎng)法4 4、旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法、旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法5 5、灌注小室培養(yǎng)法、灌注小室培養(yǎng)法6 6、培養(yǎng)板培養(yǎng)法培養(yǎng)板培養(yǎng)法7 7、二倍體細(xì)胞培養(yǎng)法、二倍體細(xì)胞培養(yǎng)法8 8、克隆培養(yǎng)法克隆培養(yǎng)法9 9、中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、中空纖維細(xì)胞培

44、養(yǎng)技術(shù)1010、微載體細(xì)胞培養(yǎng)法、微載體細(xì)胞培養(yǎng)法1111、微囊培養(yǎng)技術(shù)、微囊培養(yǎng)技術(shù)2021/3/23432 2、培養(yǎng)瓶（培養(yǎng)瓶（culture flaskculture flask）培養(yǎng)法培養(yǎng)法凡是可以用于培養(yǎng)生物結(jié)構(gòu)成分的瓶子都可凡是可以用于培養(yǎng)生物結(jié)構(gòu)成分的瓶子都可以叫做以叫做培養(yǎng)瓶培養(yǎng)瓶。早期的培養(yǎng)瓶主要是早期的培養(yǎng)瓶主要是玻璃玻璃培養(yǎng)瓶培養(yǎng)瓶, ,如今國外主如今國外主要用一次性使用的要用一次性使用的塑料塑料培養(yǎng)瓶。培養(yǎng)瓶。 卡氏瓶卡氏瓶（carlsbergs flask） 北京瓶北京瓶 塑料培養(yǎng)瓶塑料培養(yǎng)瓶 所謂所謂培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法, ,就是將擬培養(yǎng)對象直接接種就是將擬培養(yǎng)

45、對象直接接種在培養(yǎng)瓶內(nèi)在培養(yǎng)瓶內(nèi), ,再放入培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)的方法。這種培再放入培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)的方法。這種培養(yǎng)法只是強(qiáng)調(diào)所用的培養(yǎng)器皿是培養(yǎng)瓶而已。養(yǎng)法只是強(qiáng)調(diào)所用的培養(yǎng)器皿是培養(yǎng)瓶而已。 2021/3/2344卡氏瓶卡氏瓶北京瓶北京瓶經(jīng)典的培養(yǎng)瓶經(jīng)典的培養(yǎng)瓶2021/3/23456 6、培養(yǎng)板培養(yǎng)法培養(yǎng)板培養(yǎng)法培養(yǎng)板培養(yǎng)法培養(yǎng)板培養(yǎng)法過去曾被稱為過去曾被稱為微量培養(yǎng)法微量培養(yǎng)法（microculturemicroculture）: :是現(xiàn)代體外培養(yǎng)技術(shù)中最為普遍應(yīng)用的常規(guī)培養(yǎng)方法之一。是現(xiàn)代體外培養(yǎng)技術(shù)中最為普遍應(yīng)用的常規(guī)培養(yǎng)方法之一。它是將所培養(yǎng)的細(xì)胞接種在培養(yǎng)板的孔內(nèi)它是將所培養(yǎng)的細(xì)胞接種

46、在培養(yǎng)板的孔內(nèi), ,然后在然后在COCO2 2培養(yǎng)箱中進(jìn)培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)的一種培養(yǎng)方法。行培養(yǎng)的一種培養(yǎng)方法。 培養(yǎng)板的應(yīng)用使得細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化培養(yǎng)板的應(yīng)用使得細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化, ,使得細(xì)使得細(xì)胞培養(yǎng)可以微量培養(yǎng)的方式進(jìn)行胞培養(yǎng)可以微量培養(yǎng)的方式進(jìn)行, ,使得科研工作者能夠?qū)ε囵B(yǎng)使得科研工作者能夠?qū)ε囵B(yǎng)物進(jìn)行規(guī)范的、定量的組間比較。物進(jìn)行規(guī)范的、定量的組間比較。培養(yǎng)板一般都是一次性使用的培養(yǎng)器皿培養(yǎng)板一般都是一次性使用的培養(yǎng)器皿, ,有極為規(guī)范的商有極為規(guī)范的商品供應(yīng)。品供應(yīng)。 2021/3/23468 8、克隆培養(yǎng)法（、克隆培養(yǎng)法（cloning culture tech

47、niquecloning culture technique） 克?。寺。╟loneclone）一詞既有名詞意義又有動(dòng)詞含義。一詞既有名詞意義又有動(dòng)詞含義。作名詞講時(shí)作名詞講時(shí), ,意指由同一個(gè)祖細(xì)胞分裂增生而來的一個(gè)子意指由同一個(gè)祖細(xì)胞分裂增生而來的一個(gè)子細(xì)胞群細(xì)胞群, ,體外培養(yǎng)技術(shù)中常用的細(xì)胞克?。w外培養(yǎng)技術(shù)中常用的細(xì)胞克?。╟ell clonecell clone或或colonycolony）即為此意。即為此意。作動(dòng)詞解時(shí)作動(dòng)詞解時(shí), ,克隆一詞主要指從同一個(gè)祖細(xì)胞經(jīng)分裂增殖克隆一詞主要指從同一個(gè)祖細(xì)胞經(jīng)分裂增殖而產(chǎn)生一個(gè)子細(xì)胞群的過程而產(chǎn)生一個(gè)子細(xì)胞群的過程, ,體外培養(yǎng)技術(shù)中的

48、細(xì)胞克隆體外培養(yǎng)技術(shù)中的細(xì)胞克?。╟ell cloningcell cloning）就是這個(gè)意思。就是這個(gè)意思。 克隆培養(yǎng)法也可以稱作克隆培養(yǎng)法也可以稱作單細(xì)胞分離培養(yǎng)法單細(xì)胞分離培養(yǎng)法（single cell single cell cultureculture）, ,就是將從細(xì)胞懸液中獲得的單個(gè)細(xì)胞用于培養(yǎng)就是將從細(xì)胞懸液中獲得的單個(gè)細(xì)胞用于培養(yǎng), ,使使之分裂增殖而產(chǎn)生一個(gè)細(xì)胞群的培養(yǎng)方法。之分裂增殖而產(chǎn)生一個(gè)細(xì)胞群的培養(yǎng)方法。 2021/3/2347克隆培養(yǎng)法克隆培養(yǎng)法最基本的要求是最基本的要求是擬用于培養(yǎng)并分裂增殖的祖細(xì)擬用于培養(yǎng)并分裂增殖的祖細(xì)胞必須是一個(gè)細(xì)胞胞必須是一個(gè)細(xì)胞, ,

49、如此才能獲得具有同一祖先的子細(xì)胞群。如此才能獲得具有同一祖先的子細(xì)胞群。 理論上講理論上講, ,各種生物體細(xì)胞都可以進(jìn)行克隆培養(yǎng)各種生物體細(xì)胞都可以進(jìn)行克隆培養(yǎng), ,但由于細(xì)但由于細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)生長繁殖的環(huán)境、生命力等方面均不如在體時(shí)胞在體外培養(yǎng)時(shí)生長繁殖的環(huán)境、生命力等方面均不如在體時(shí)的情況。所以的情況。所以, ,能夠進(jìn)行克隆培養(yǎng)的細(xì)胞一般只是一些細(xì)胞活能夠進(jìn)行克隆培養(yǎng)的細(xì)胞一般只是一些細(xì)胞活力強(qiáng)、增殖能力強(qiáng)、對體外生長環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)的細(xì)胞力強(qiáng)、增殖能力強(qiáng)、對體外生長環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)的細(xì)胞,如腫瘤如腫瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)化（無限）細(xì)胞系、（胚胎）干細(xì)胞以及微生物細(xì)胞細(xì)胞和轉(zhuǎn)化（無限）細(xì)胞系、（胚胎）干細(xì)胞

50、以及微生物細(xì)胞等。這些細(xì)胞種類即便是單個(gè)細(xì)胞被置于體外培養(yǎng)環(huán)境等。這些細(xì)胞種類即便是單個(gè)細(xì)胞被置于體外培養(yǎng)環(huán)境,也可也可以逐漸適應(yīng)培養(yǎng)環(huán)境并行分裂增殖以逐漸適應(yīng)培養(yǎng)環(huán)境并行分裂增殖,從而形成一群子細(xì)胞。從而形成一群子細(xì)胞。8 8、克隆培養(yǎng)法（、克隆培養(yǎng)法（cloning culture techniquecloning culture technique） 2021/3/2348實(shí)驗(yàn)課時(shí)間實(shí)驗(yàn)課時(shí)間:第第7 9周周實(shí)驗(yàn)課地點(diǎn)實(shí)驗(yàn)課地點(diǎn):104館四樓館四樓注意事項(xiàng)注意事項(xiàng): :1.1.網(wǎng)上沒有名字的網(wǎng)上沒有名字的 同學(xué)同學(xué)請不要填報(bào)實(shí)請不要填報(bào)實(shí) 驗(yàn)課名單。驗(yàn)課名單。2.2.現(xiàn)在不能確定現(xiàn)在不能

51、確定 自己時(shí)間的同學(xué)自己時(shí)間的同學(xué) 不要填報(bào)不要填報(bào), ,可以可以 下次上課時(shí)再報(bào)。下次上課時(shí)再報(bào)。3.3.一旦填報(bào)就不能一旦填報(bào)就不能 再更改時(shí)間。再更改時(shí)間。2021/3/2349（二）繼代培養(yǎng)（二）繼代培養(yǎng)（三）體外培養(yǎng)的基本方法和技術(shù)（三）體外培養(yǎng)的基本方法和技術(shù)（四）培養(yǎng)物的凍存與復(fù)蘇（四）培養(yǎng)物的凍存與復(fù)蘇（五）培養(yǎng)物的污染（五）培養(yǎng)物的污染（一）原代培養(yǎng)（一）原代培養(yǎng)二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程2021/3/2350（四）培養(yǎng)物的凍存與復(fù)蘇（四）培養(yǎng)物的凍存與復(fù)蘇二二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程體外培養(yǎng)的基本方法和過程在體外培養(yǎng)工作中在體外培養(yǎng)工作中, ,

52、為了保種和長期保存培養(yǎng)物的活性為了保種和長期保存培養(yǎng)物的活性, ,常須將培養(yǎng)物進(jìn)行冷凍保存常須將培養(yǎng)物進(jìn)行冷凍保存, ,并在需要的時(shí)候重新復(fù)蘇和培養(yǎng)。并在需要的時(shí)候重新復(fù)蘇和培養(yǎng)。、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理冷凍保存冷凍保存（cryopreservation）:就是將體外培養(yǎng)物懸就是將體外培養(yǎng)物懸 浮在加有或不加冷凍保護(hù)劑的溶液中浮在加有或不加冷凍保護(hù)劑的溶液中, ,以一定的以一定的 冷凍速率降至零下某一溫度（一般是低于冷凍速率降至零下某一溫度（一般是低于-70-70 的超低溫條件）的超低溫條件）, ,并在此溫度下對其長期保存的并在此溫度下對其長期保存的 過程。過程

53、。復(fù)蘇復(fù)蘇（thawing）:就是以一定的復(fù)溫速率將凍存的培養(yǎng)物就是以一定的復(fù)溫速率將凍存的培養(yǎng)物 恢復(fù)到常溫的過程?；謴?fù)到常溫的過程。 2021/3/2351細(xì)胞內(nèi)的冰晶損傷（細(xì)胞內(nèi)的冰晶損傷（intracellular ice-damage）: :是指因細(xì)胞內(nèi)部結(jié)冰而致的細(xì)胞損傷是指因細(xì)胞內(nèi)部結(jié)冰而致的細(xì)胞損傷。 純水純水（細(xì)胞懸浮其中）（細(xì)胞懸浮其中） 低于零度 結(jié)冰結(jié)冰 細(xì)胞內(nèi)外的水分都會(huì)結(jié)冰細(xì)胞內(nèi)外的水分都會(huì)結(jié)冰 冰晶造成細(xì)胞膜和細(xì)胞器的破壞并引起細(xì)胞死亡冰晶造成細(xì)胞膜和細(xì)胞器的破壞并引起細(xì)胞死亡 、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理2021/3/2352溶質(zhì)損傷

54、（溶質(zhì)損傷（solute damagesolute damage）或稱溶液損傷（或稱溶液損傷（solution damagesolution damage）是指因保存細(xì)胞的溶液溶質(zhì)濃度增高而致的細(xì)胞損傷。是指因保存細(xì)胞的溶液溶質(zhì)濃度增高而致的細(xì)胞損傷。溶液溶液（細(xì)胞懸浮其中）（細(xì)胞懸浮其中） 溫度下降 細(xì)胞外的水分先結(jié)冰細(xì)胞外的水分先結(jié)冰 在復(fù)溫時(shí)在復(fù)溫時(shí), ,大量水分就會(huì)滲入細(xì)胞內(nèi)大量水分就會(huì)滲入細(xì)胞內(nèi), ,造成細(xì)胞死亡造成細(xì)胞死亡 未結(jié)冰的溶液中電解質(zhì)濃度升高未結(jié)冰的溶液中電解質(zhì)濃度升高 細(xì)胞在高溶質(zhì)的溶液中時(shí)間過長細(xì)胞在高溶質(zhì)的溶液中時(shí)間過長, ,細(xì)胞膜上脂質(zhì)會(huì)受到損細(xì)胞膜上脂質(zhì)會(huì)受到損

55、壞壞, ,細(xì)胞便會(huì)發(fā)生滲漏。細(xì)胞便會(huì)發(fā)生滲漏。 、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理2021/3/2353在溶液中加入冷凍保護(hù)劑在溶液中加入冷凍保護(hù)劑(cryoprotectant)時(shí)時(shí), ,則可保護(hù)細(xì)則可保護(hù)細(xì)胞免受溶質(zhì)損傷和冰晶損傷。胞免受溶質(zhì)損傷和冰晶損傷。因?yàn)槔鋬霰Ｗo(hù)劑易同溶液中水分子結(jié)合因?yàn)槔鋬霰Ｗo(hù)劑易同溶液中水分子結(jié)合, ,從而降低冰點(diǎn)從而降低冰點(diǎn), ,減減少冰晶的形成少冰晶的形成, ,并且通過其摩爾濃度并且通過其摩爾濃度, ,降低未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)降低未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度的濃度, ,使細(xì)胞免受溶質(zhì)的損傷使細(xì)胞免受溶質(zhì)的損傷, ,細(xì)胞得以在超低溫條件下保存。

56、細(xì)胞得以在超低溫條件下保存。在復(fù)蘇時(shí)在復(fù)蘇時(shí), ,一般以很快的速度升溫一般以很快的速度升溫,1,12 2 minmin內(nèi)恢復(fù)到常溫內(nèi)恢復(fù)到常溫, ,細(xì)胞內(nèi)外不會(huì)重新形成較大的冰晶細(xì)胞內(nèi)外不會(huì)重新形成較大的冰晶, ,也不會(huì)暴露在高濃度溶質(zhì)的也不會(huì)暴露在高濃度溶質(zhì)的溶液中過長時(shí)間溶液中過長時(shí)間, ,從而不會(huì)產(chǎn)生冰晶損傷和溶質(zhì)損傷從而不會(huì)產(chǎn)生冰晶損傷和溶質(zhì)損傷, ,凍存的細(xì)凍存的細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇后仍保持其正常的結(jié)構(gòu)和功能。胞經(jīng)復(fù)蘇后仍保持其正常的結(jié)構(gòu)和功能。冷凍保護(hù)劑對細(xì)胞的冷凍保護(hù)效果還與冷凍速率、冷凍溫冷凍保護(hù)劑對細(xì)胞的冷凍保護(hù)效果還與冷凍速率、冷凍溫度和復(fù)溫速率有關(guān)。度和復(fù)溫速率有關(guān)。 、培養(yǎng)物的冷

57、凍保存與復(fù)蘇原理、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理2021/3/2354（）冷凍速率（）冷凍速率細(xì)胞在冷凍過程中會(huì)發(fā)生如下生理變化細(xì)胞在冷凍過程中會(huì)發(fā)生如下生理變化: :* * 當(dāng)細(xì)胞被冷至當(dāng)細(xì)胞被冷至-5-5左右時(shí)左右時(shí), ,因溶液中加有冷凍保因溶液中加有冷凍保護(hù)劑而降低了溶液的冰點(diǎn)護(hù)劑而降低了溶液的冰點(diǎn), ,細(xì)胞內(nèi)外溶液仍未結(jié)冰細(xì)胞內(nèi)外溶液仍未結(jié)冰; ;* * 當(dāng)細(xì)胞被冷至當(dāng)細(xì)胞被冷至-5-5- -1515之間時(shí)之間時(shí), ,細(xì)胞外溶液先細(xì)胞外溶液先出現(xiàn)結(jié)冰而細(xì)胞內(nèi)仍保持未結(jié)冰狀態(tài)。細(xì)胞內(nèi)未結(jié)冰的出現(xiàn)結(jié)冰而細(xì)胞內(nèi)仍保持未結(jié)冰狀態(tài)。細(xì)胞內(nèi)未結(jié)冰的水分子會(huì)比細(xì)胞外部分結(jié)冰溶液中的水分子具有更高的水分子

58、會(huì)比細(xì)胞外部分結(jié)冰溶液中的水分子具有更高的化學(xué)能化學(xué)能, ,其結(jié)果是其結(jié)果是: :細(xì)胞內(nèi)水分為了和細(xì)胞外水分保持化細(xì)胞內(nèi)水分為了和細(xì)胞外水分保持化學(xué)能的平衡學(xué)能的平衡, ,會(huì)向細(xì)胞外流動(dòng)會(huì)向細(xì)胞外流動(dòng)。是指降溫的速度。是指降溫的速度。、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理2021/3/2355冷凍速度不同冷凍速度不同, ,細(xì)胞內(nèi)水分向細(xì)胞外流動(dòng)的情況細(xì)胞內(nèi)水分向細(xì)胞外流動(dòng)的情況就會(huì)不同就會(huì)不同: :（1 1）冷凍速度慢）冷凍速度慢, ,細(xì)胞內(nèi)水分外滲多細(xì)胞內(nèi)水分外滲多, ,細(xì)胞脫水細(xì)胞脫水, ,體積縮小體積縮小, ,細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)濃度增高細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)濃度增高, ,細(xì)胞內(nèi)不發(fā)生結(jié)冰細(xì)

59、胞內(nèi)不發(fā)生結(jié)冰; ;（2 2）冷凍速度快）冷凍速度快, ,細(xì)胞內(nèi)水分沒有足夠的時(shí)間外細(xì)胞內(nèi)水分沒有足夠的時(shí)間外滲滲, ,結(jié)果隨著溫度的下降而發(fā)生細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰結(jié)果隨著溫度的下降而發(fā)生細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰; ;（3 3）冷凍速度非?？欤闯焖倮鋬觯├鋬鏊俣确浅？欤闯焖倮鋬觯? ,則細(xì)胞則細(xì)胞內(nèi)形成的冰晶非常小或不結(jié)冰而呈玻璃狀凝固（玻璃內(nèi)形成的冰晶非常小或不結(jié)冰而呈玻璃狀凝固（玻璃化冷凍）?；鋬觯?。 、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理（）冷凍速率（）冷凍速率2021/3/2356超快速玻璃化冷凍超快速玻璃化冷凍: :是細(xì)胞存活最理想的冷凍方法。是細(xì)胞存活最理想的冷凍方法。 因?yàn)榧?xì)

60、胞內(nèi)外呈玻璃化凝固因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)外呈玻璃化凝固, ,無冰晶形成或形成很無冰晶形成或形成很小的冰晶小的冰晶, ,對細(xì)胞膜和細(xì)胞器不造成破壞對細(xì)胞膜和細(xì)胞器不造成破壞; ;細(xì)胞也不會(huì)細(xì)胞也不會(huì)在高濃度溶質(zhì)的溶液中暴露時(shí)間過長而受損。在高濃度溶質(zhì)的溶液中暴露時(shí)間過長而受損。 不同細(xì)胞的最適冷凍速率不同。所以不同細(xì)胞的最適冷凍速率不同。所以, ,在對一在對一種細(xì)胞進(jìn)行冷凍保存之前種細(xì)胞進(jìn)行冷凍保存之前, ,首先要測定其最適冷凍首先要測定其最適冷凍速率速率, ,以保證獲得最高冷凍存活率。以保證獲得最高冷凍存活率。 、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理（）冷凍速率（）冷凍速率2021/3/