該技術(shù)能夠快速在目標(biāo)基因組染色體中確定特異DNA結(jié)合蛋白準(zhǔn)確結(jié)合位點

1、該技術(shù)能夠快速在目標(biāo)基因組的染色體中確定特異DNA結(jié)合蛋白的準(zhǔn)確結(jié)合位點，ChIP芯片也可以在一個基因組的任何感興趣的區(qū)域內(nèi)尋找染色體的結(jié)構(gòu)改變。一、ChIP-Chip的用途（1）在基因組范圍內(nèi)確定基因轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合位點和其他DNA結(jié)合蛋白或蛋白復(fù)合體的DNA結(jié)合位點。（2）染色體活性狀態(tài)的定量分析。（3）組蛋白修飾的功能研究。通過用酰基化或甲基化的組蛋白的特異抗體和沒有進(jìn)行修飾的組蛋白的特異抗體，可以確定與組蛋白修飾有關(guān)的結(jié)合模式的變化。（4）聚合酶活性的定量分析。（5）精煉生物信息方法，用功能數(shù)據(jù)來確定啟動子的位置。二、具體實驗原理和實驗步驟染色質(zhì)免疫沉淀芯片流程圖三、GeneChi

2、p-TilingArray技術(shù)簡介Affymetrix公司于2006年1月24日宣布推出GeneChip（R）人類和鼠源嵌合芯片（TilingA，ray）系列產(chǎn)品。該系列芯片研究范圍大大超出已知編碼蛋白序列，可以對整個人類和小鼠基因組進(jìn)行系統(tǒng)的研究。研究人員可以利用這一芯片對轉(zhuǎn)錄因子和其他蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域進(jìn)行研究。最近，更有研究人員利用Affymetrix的嵌合芯片在過去認(rèn)為是垃圾DNA的區(qū)域中間找到了許多以前從未發(fā)現(xiàn)過的轉(zhuǎn)錄活性區(qū)域。嵌合芯片（TilingArray）是迄今為止分辨率最高的基因芯片類型，其探針設(shè)計幾乎涵蓋了目標(biāo)DNA的全部序列。迄今為止，Affymetrix公司已經(jīng)開發(fā)出了人、

3、小鼠、酵母、線蟲、擬南芥等模式生物的全基因組Tiling芯片，為全基因組規(guī)模上研究目的蛋白與核酸的相互作用提供了強有力的分析工具。GeneChip-TilingArray除了全基因組芯片外，還包括了專門應(yīng)用于ChIPChip技術(shù)中的人啟動子和小鼠啟動子兩款芯片，探針設(shè)計覆蓋了轉(zhuǎn)錄起始位點附近10kb的范圍，可針對腫瘤相關(guān)的1 300個基因，覆蓋范圍更是增加到了12.5kb。1882年，德國細(xì)胞學(xué)家弗萊明首次公開發(fā)表了細(xì)胞有絲分裂現(xiàn)象的觀察結(jié)果，他的工作也被看作是科學(xué)史上最重要的發(fā)現(xiàn)之一。除了對有絲分裂進(jìn)行描繪以及命名之外，弗萊明還對這一過程中看似起關(guān)鍵作用的物質(zhì)染色質(zhì)作了標(biāo)記。目前，它是生物學(xué)

4、兩個最熱門領(lǐng)域基因組學(xué)和蛋白組學(xué)研究關(guān)注的焦點。但是，不同之處在于：弗萊明采用的是光學(xué)顯微鏡和裝有少量苯胺染色的玻璃瓶對其進(jìn)行研究，而最新的基因組階段的染色質(zhì)研究采用的是尖端的技術(shù)染色質(zhì)免疫沉淀作用測定法（ChIP）?；蚪M學(xué)和蛋白組學(xué)都將把染色質(zhì)作為研究對象，但兩個領(lǐng)域采用的方法各異。在基因組學(xué)研究中，研究人員通常從一個蛋白質(zhì)開始研究，采用ChIP去找出與基因組關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)。而蛋白組學(xué)研究采用的是反向方法，先用一個特殊的DNA序列作為尋找蛋白質(zhì)的誘餌；然后用ChIP去證實：那些蛋白質(zhì)就是在體內(nèi)與DNA序列相關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)。四、使用說明：1. 樣品超聲處理條件的優(yōu)化：A. 準(zhǔn)備適量冰浴預(yù)冷的PB

5、S，以及100mM PMSF。將SDS Lysis Buffer適當(dāng)溫浴，使其中的SDS充分溶解，并混勻。B. 將細(xì)胞培養(yǎng)于10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，細(xì)胞培養(yǎng)液的用量為10 ml。在預(yù)期發(fā)生目的蛋白和基因組DNA結(jié)合的時間點，直接在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入適量甲醛，輕輕混勻，至最終濃度為1%。隨即在37孵育10分鐘，以交聯(lián)目的蛋白和相應(yīng)的基因組DNA。例如，對于常規(guī)的每個10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入10 ml細(xì)胞培養(yǎng)液的情況，需加入270微升37%甲醛。請注意盡量使用高質(zhì)量的在有效使用期限內(nèi)的甲醛。細(xì)胞也可以培養(yǎng)于6cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，相關(guān)溶液的用量需按照比例進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整。C. 加入1.1ml Glycine

6、Solution （10X），輕輕混勻。室溫放置5分鐘。D. 將有細(xì)胞樣品的培養(yǎng)皿置于冰浴上。吸盡含甲醛和glycine的培養(yǎng)液，盡量保持沒有液體殘留。E. 在上述室溫放置5分鐘期間，用冰浴預(yù)冷的PBS稀釋100mM PMSF至1mM，即配制成冰浴預(yù)冷的含1mM PMSF的PBS。PMSF水性溶液一定要新鮮配制，其在水相中的半衰期約為30分鐘。F. 加入5-10ml冰浴預(yù)冷的含1mM PMSF的PBS，洗滌細(xì)胞，吸盡液體，盡量保持沒有液體殘留。G. 再加入5-10ml含冰浴預(yù)冷的1mM PMSF的PBS，進(jìn)一步洗滌細(xì)胞，吸盡液體，盡量保持沒有液體殘留。H. 加入1ml冰浴預(yù)冷的含1mM PMS

7、F的PBS，用細(xì)胞刮子刮下細(xì)胞，收集至離心管中。如果細(xì)胞可以用槍吹打下來，也可以用槍吹打。對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，分裝成每管大約100萬細(xì)胞。I. 4，800-1000g離心1-2分鐘，以充分沉淀細(xì)胞。如果發(fā)現(xiàn)沉淀不充分，可以適當(dāng)延長離心時間。吸盡上清，盡量減少液體殘留。J. 配制適量含有1mM PMSF的SDS Lysis Buffer。上一步驟的100萬細(xì)胞沉淀用0.2ml含有1mM PMSF的SDS Lysis Buffer重懸。K. 在冰浴上孵育10分鐘，以充分裂解細(xì)胞。L. 超聲處理，以剪切基因組DNA，使DNA大部分?jǐn)嗔殉?00-1000bp大小，如果能把大部分控制在400-800bp則更

8、佳。超聲過程中請一定注意要保持樣品處于冰浴中，并且處于較低溫度。超聲剪切的效果在后續(xù)去交聯(lián)后可以用常規(guī)的DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測。超聲處理的條件通?？梢栽O(shè)置為10秒每次，共3-4次，功率為50W時設(shè)置為最大功率的30%，采用2mm超聲頭。不同的超聲處理儀器的設(shè)置不太一樣，摸索超聲條件時，可以先固定其他條件，先確定每次超聲多長時間不會導(dǎo)致明顯發(fā)熱，然后摸索不同的超聲次數(shù)。直至找到比較合適的超聲次數(shù)可以使大部分基因組DNA斷裂成200-1000bp大小。需要注意的是每次的超聲體積和細(xì)胞用量宜固定，否則就不能使用一個相對比較固定的超聲條件用于后續(xù)實驗。M. 在0.2ml經(jīng)過超聲處理的樣品中加入8微升

9、5M NaCl，混勻。65加熱4小時，以去除蛋白和基因組DNA之間的交聯(lián)。N. 加入等體積的Tris平衡苯酚，vortex劇烈混勻，隨后4，12000g左右離心5分鐘。吸取上清至另一離心管中。O. 加入等體積氯仿，vortex劇烈混勻，隨后4，12000g左右離心5分鐘。吸取上清至另一離心管中。說明：上述步驟1N和1O的酚氯仿抽提可以使用DNA純化試劑盒進(jìn)行操作。例如碧云天的PCR/DNA純化試劑盒（D0033）。P. 取少量通過酚氯仿抽提或DNA純化試劑盒獲得的液體，對于酚氯仿抽提產(chǎn)物可以取5-10微升，對于DNA純化試劑盒純化產(chǎn)物可以取2-5微升，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，觀察超聲處理對于基因組

10、DNA的剪切效果。2. 染色質(zhì)免疫沉淀：A. 在對樣品超聲處理條件進(jìn)行優(yōu)化后，對于待檢測樣品按照步驟1A-1K進(jìn)行操作，并參考步驟1L進(jìn)行超聲處理。B. 隨后對于經(jīng)過超聲處理的樣品在4，12000-14000g離心5分鐘。取上清（約0.2ml）至一2ml離心管中，置于冰浴。C. 配制適量含有1mM PMSF的ChIP Dilution Buffer。加入1.8ml含有1mM PMSF的ChIP Dilution Buffer以稀釋經(jīng)過超聲處理的樣品，使最終體積為2毫升。D. 取出20微升樣品作為Input用于后續(xù)檢測。其余近2ml樣品加入70微升Protein A+G Agarose/Salm

11、on Sperm DNA（其中約35微升為沉淀，35微升為液體），在4緩慢轉(zhuǎn)動或擺動混勻30分鐘。此步驟的目的是減少Protein A+G Agarose/Salmon Sperm DNA和目的蛋白或目的DNA序列的非特異性結(jié)合。E. 4，1000g左右離心1分鐘，將上清轉(zhuǎn)移至一個新的2毫升離心管中。F. 加入適量一抗，一抗的用量可以參考抗體的說明書。如果抗體的說明中未給出用于ChIP的稀釋比例，可以參考普通的免疫沉淀的稀釋比例。通常一抗的用量為0.5-1微克。4緩慢轉(zhuǎn)動或擺動混勻過夜。可以不加抗體作為陰性對照，或用無關(guān)的抗體作為陰性對照，同時可以用沒有細(xì)胞樣品的溶液作為空白對照。G. 加入6

12、0微升Protein A+G Agarose/Salmon Sperm DNA（其中約30微升為沉淀，30微升為液體），在4緩慢轉(zhuǎn)動或擺動混勻60分鐘，以沉淀一抗識別的蛋白或相應(yīng)的復(fù)合物。H. 4，1000g左右離心1分鐘。非常小心地去除液體，切勿觸及沉淀。隨后依次用如下溶液對沉淀進(jìn)行洗滌，每次洗滌液的用量為1ml，每次在4緩慢轉(zhuǎn)動或擺動洗滌3-5分鐘，隨后4，1000g左右離心1分鐘。非常小心地去除液體，切勿觸及沉淀。a. Low Salt Immune Complex Wash Buffer洗滌一次。b. High Salt Immune Complex Wash Buffer洗滌一次。c

13、. LiCl Immune Complex Wash Buffer洗滌一次。d. TE Buffer洗滌兩次。說明：完成上述所有洗滌步驟后所獲得的沉淀即可用于PCR擴(kuò)增目的基因序列或用Southern檢測目的基因序列，或者用于Western檢測等。3. PCR擴(kuò)增目的基因序列（如果ChIP產(chǎn)物用于檢測目的基因序列）：A. 新鮮配制適量Elution buffer （1% SDS， 0.1M NaHCO3）。B. 完成步驟2H后，即完成所有洗滌步驟后，加入250微升Elution buffer。Vortex混勻，室溫轉(zhuǎn)動或擺動繼續(xù)洗脫3-5分鐘。C. 1000g左右離心1分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到一新的

14、離心管中。沉淀中再加入250微升Elution buffer。Vortex混勻，室溫轉(zhuǎn)動或擺動繼續(xù)洗脫3-5分鐘。D. 1000g左右離心1分鐘，取出上清。和上一步驟，即步驟3C中獲得的上清合并。共計約500微升上清。E. 在500微升上清中加入20微升5M NaCl，混勻。65加熱4小時，以去除蛋白和基因組DNA之間的交聯(lián)。對于步驟2D獲得的作為Input的20微升樣品，加入1微升5M NaCl，混勻，65加熱4小時，同樣用于去除蛋白和基因組DNA之間的交聯(lián)。此步驟完成后可以繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)步驟，也可以先-20凍存，第二天繼續(xù)后續(xù)步驟。說明：此時的樣品已經(jīng)可以用于PCR，可以嘗試使用1、2、5或

15、10微升樣品作為模板用于PCR檢測目的基因。此時PCR的效果和可能被沉淀下來的DNA的量，以及整個PCR擴(kuò)增體系是否容易擴(kuò)增目的基因有關(guān)。如果發(fā)現(xiàn)PCR效果欠佳，可以考慮通過后續(xù)的純化步驟，純化并濃縮樣品，然后再進(jìn)行PCR檢測。F. 在約520微升樣品中加入10微升0.5M EDTA，20微升1M Tris pH 6.5和1微升20mg/ml 蛋白酶K。混勻后45孵育60分鐘。G. 加入等體積Tris平衡苯酚，vortex劇烈混勻，隨后4，12000g左右離心5分鐘。吸取上清至另一離心管中。H. 加入等體積氯仿，vortex劇烈混勻，隨后4，12000g左右離心5分鐘。吸取上清至另一離心管中。

16、I. 加入20微克glycogen或yeast tRNA，加入1/10體積的3M NaAc，pH5.2，再加入2.5倍體積無水乙醇。混勻后-70沉淀不少于1小時，或-20沉淀8小時以上。J. 4，12000-14000g離心10分鐘，小心吸去大部分上清，切勿觸及沉淀。K. 加入約1ml 70%乙醇洗滌沉淀。4，12000-14000g離心10分鐘，小心吸去大部分上清，切勿接觸沉淀。L. 4，12000-14000g離心1分鐘，非常小心地吸除殘留液體。M. 用少量TE或水重懸DNA沉淀，用于目的基因的PCR檢測。用于PCR的引物最好能設(shè)計2組，可以用Input作為模板預(yù)先摸索出相應(yīng)的PCR條件，

17、并選擇一組效果較好的引物用于最終的PCR檢測。少數(shù)情況下，當(dāng)PCR條帶過弱時，可以采用nested PCR技術(shù)，進(jìn)行兩輪擴(kuò)增。說明：步驟G至步驟M也可以采用適當(dāng)?shù)腄NA純化試劑盒純化DNA，例如碧云天的PCR/DNA純化試劑盒（D0033）。4. Western檢測ChIP產(chǎn)物（如果ChIP產(chǎn)物用于Western檢測）：A. 接步驟2H，在完成所有的洗滌步驟后，加入25微升SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（1X）。SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（1X）可以用SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5X）用水稀釋配制而成。沸水浴煮沸10分鐘。B. 可以取10-20微升用于Western檢測ChIP-Seq

18、 數(shù)據(jù)分析ChIP-Seq Data Analysis 背景介紹染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（Chromatin Immunoprecipitation），是一類通過將與特定蛋白質(zhì)與其結(jié)合DNA序列共同沉淀下來研究其相互作用的方法，這一方法和測序技術(shù)結(jié)合起來，可以研究轉(zhuǎn)錄因子在基因組上的結(jié)合區(qū)域、特異性修飾的組蛋白位點以及其他DNA結(jié)合蛋白的基因組特異結(jié)合位點等表觀遺傳性學(xué)問題。ChIP-Seq技術(shù)是在ChIPonChip的基礎(chǔ)上發(fā)展來的，相對于ChIP-on-Chip來說，ChIP-Seq有很多優(yōu)勢：更高的通量；更低廉的價格；雙通道ChIP-Seq可以彌補單通道帶來的GC偏向問題，產(chǎn)生更加

19、可靠的數(shù)據(jù)。 ChIP-Seq的實驗流程圖： Fig.1 ChIP-Seq技術(shù)流程圖。1）提取核內(nèi)染色質(zhì)；2）將染色質(zhì)打碎；3）加入可以和特定蛋白結(jié)合的抗體；4）共沉淀并洗脫復(fù)合物；5）去除蛋白復(fù)合物，純化DNA;6）測序并且定位到基因組上。  數(shù)據(jù)分析流程圖： Fig 2. ChIP-seq 數(shù)據(jù)分析流程圖 數(shù)據(jù)分析項目 一數(shù)據(jù)基本質(zhì)量分析基于不同的技術(shù)平臺，所需要的分析方法不盡相同。對于一般的單通道測序，我們進(jìn)行序列長度統(tǒng)計、豐度統(tǒng)計、定位百分比（mapping coverage）統(tǒng)計等等，

20、通過隨機mapping，我們可以對數(shù)據(jù)質(zhì)量進(jìn)行估計。對于有Input lane的雙通道測序，我們會進(jìn)行橫向的對比以得到更準(zhǔn)確的結(jié)果。 二峰值的定位對于不同的數(shù)據(jù)質(zhì)量，可以選擇相對合適的mapping方法，包括允許不同的mismatch數(shù)目等等以得到比較可靠的數(shù)據(jù)。然后基于這些定位到基因組上的序列和其豐度，找到那些有統(tǒng)計學(xué)意義的位點峰值（peak calling）。一個轉(zhuǎn)錄因子FOXA3的相關(guān)例子如下：Fig.3   ChIP-Seq結(jié)果分析圖。轉(zhuǎn)錄因子FOXA3結(jié)合在特定基因的轉(zhuǎn)錄起始位置，利用ChIP-Seq技術(shù)得到高通量的核酸序列，圖中顯示這些序列可

21、以清楚的定位出一個基因組上的峰值，這個峰值區(qū)域就是FOXA3的結(jié)合區(qū)域。  三Binding motif分析一般的DNA結(jié)合因子都是特異性的，有特定的結(jié)合基序，對于檢測到的峰值序列，我們進(jìn)行DNA binding motif分析，以期驗證或者得到新的DNA結(jié)合因子binding motif。Fig.4     Binding motif分析圖。轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位置的核酸序列有一定的偏好性，圖中顯示各個位置核酸出現(xiàn)的頻率，可以清楚看到此轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合DNA序列的特異性。 四和annotation library的分析對比P

22、eak calling在基因組中的位置在已知注釋信息中的分布可以顯示DNA結(jié)合蛋白的結(jié)合偏好性，我們會給出基于不同注釋庫的分布信息。  Fig.5 組蛋白修飾的基因組分布圖 五基因本體學(xué)分析（Gene Ontology Analysis）對于特定的轉(zhuǎn)錄因子，其DNA結(jié)合位點的下游轉(zhuǎn)錄基因在特定試驗條件下可能會行使相似的功能，GO分析會找出富集的那些可能的功能。 Fig.6  基因功能分析圖。每一列表示一個特定的基因功能分類，每一行顯示分析中所參與的基因，綠色表示基因具有列所顯示的功能，黑色表示沒有。 六Pathwa

23、y AnalysisDNA結(jié)合蛋白的靶基因有可能會富集在特定的生物信號通路或者代謝通路里面，利用富集檢測的統(tǒng)計手段，可以推測出DNA結(jié)合因子在特定的環(huán)境下所可能行使的生物學(xué)功能。如下圖所示，靶基因以橙色表示： Fig.7   Pathway分析圖。圖中橘紅色表示在這個生物通路中表達(dá)的基因，灰色表示沒有表達(dá)的基因，統(tǒng)計分析顯示基因富集在這個通路中，表明這個pathway很可能在實驗中啟重要作用ChIP-on-chip數(shù)據(jù)分析報告Scanning image: 原始Cy3、Cy5熒光掃描圖像；Raw data：探針的掃描熒光信號強度原始數(shù)據(jù)。log2-rat

24、io：經(jīng)過校正得到log2(ChIP/Input)值，此值代表每個探   針在實驗樣本ChIP DNA和對照樣本DNA中的相對富集強度。Scatter plot：散點圖，X軸為Input（Cy3）數(shù)據(jù)值，Y軸為ChIP(Cy5)數(shù)據(jù)值，表示芯片上兩通道數(shù)據(jù)總體分布集中趨勢；MA-plot：MA圖，X軸為A值log2(ChIP)+log2(Input)/2，代表點的整體信號強度，Y軸為M值log2(ChIP)log2(Input)表示點的兩通道信號差，可由MA圖觀察芯片數(shù)據(jù)是否存在強度依賴的 系統(tǒng)偏移以及信號差異點的比例；Peaks GFF文件：由軟件計算出探針相對強度在統(tǒng)計

25、學(xué)意義上顯著的Peaks，代表可能的啟動子區(qū)。Peaks GFF 文件包含每個Peaks的基因組位置、寬度和P-value值概述 染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）也稱結(jié)合位點分析法，是研究體內(nèi)蛋白質(zhì)與DNA相互作用的有力工具，通常用于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點或組蛋白特異性修飾位點的研究。將ChIP與第二代測序技術(shù)相結(jié)合的ChIP-Seq技術(shù)，能夠高效地在全基因組范圍內(nèi)檢測與組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等互作的DNA區(qū)段。 ChIP-Seq的原理是：首先通過染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（ChIP）特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段，并對其進(jìn)行純化與文庫構(gòu)建；然后

26、對富集得到的DNA片段進(jìn)行高通量測序。研究人員通過將獲得的數(shù)百萬條序列標(biāo)簽精確定位到基因組上，從而獲得全基因組范圍內(nèi)與組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等互作的DNA區(qū)段信息。  技術(shù)路線 1實驗流程（Solexa）  實驗流程示意圖  生物信息分析流程示意圖 研究內(nèi)容 1測序 對客戶提供的ChIP樣品（如果有陰陽參啟動子區(qū)域或DNA序列的）進(jìn)行定量檢測，檢測合格后進(jìn)行測序文庫構(gòu)建、DNA成簇（Cluster generation）擴(kuò)增、高通量測序。 2基本數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)產(chǎn)出統(tǒng)計：對測序結(jié)果進(jìn)行圖像識別（Base calling），去除污染及接頭序列；統(tǒng)計結(jié)果包括：測定的序列（Reads）長度、Reads數(shù)量、數(shù)據(jù)產(chǎn)量。 3. 高級數(shù)據(jù)分析 標(biāo)準(zhǔn)高級數(shù)據(jù)分析內(nèi)容包括： （1）ChIP-Seq序列與參考序列比對； （2）Peak calling：統(tǒng)計樣品Peak信息（峰檢測及計數(shù)、平均峰長度、峰長中位數(shù)）； （3）統(tǒng)計樣品Uniquely mapped reads在基因上、基因間區(qū)的分布情況及覆蓋深度； （4）給出每個樣品Peak關(guān)聯(lián)基因列